ISOLASI DAN PEMURNIAN MIKROBA

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

OLEH :

NAMA NIM KELOMPOK ASISTEN

: AYU MAULIDA PUTRI : H1E107001 : 10 (SEPULUH) : DESY FITRIYANI

PROGRAM STUDI TEKNIK LINGKUNGAN FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT BANJARBARU

OKTOBER, 2009

BAB I PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan komplek. Beratus-

ratus spesies berbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut, saluran pencernaan, dan kulit. Sebagai contoh, sekali bersin dapat menyebarkan beribu-ribu mikroorganisme. Satu tinja dapat mengandung jutaan bakteri (Pelczar, 1986). Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal (Pelczar, 1986). Pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru harus dilakukan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alatalat yang ada sangkut pautnya dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benarbenar steril. Hal ini untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya

mikkroorganisme yang tidak diinginkan (Budiarti, 2009). 1.2 Tujuan Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mempelajari teknik-teknik isolasi mikroba dan pemurniannya.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri tersebar sangat luas baik ditanah, air dan udara, bila hendak mengisolasi bakteri dari tanah/ benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut, atau zat cair lain, maka dilakukan serangkaian pengenceran (dilution series) terhadap zat tersebut. Sumber isolat dari bakteri benda yang liat atau padat, misatnya daging maka zat tersebut dihancurkan terlebih dahulu. Terhadap bakteri yang hanya terdapat dipermukaan maka pengenceran dilakukan terhadap air tempat zat tersebut dicelupkan/ direndam. Dan jika bakteri hendak diisolasi dari udara, cukup dengan membuka cawan Petri yang berisi media agar steril beberapa saat. Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal (Pelczar, 1986). Kultur murni atau biakan murni sangat berguna didalam mikrobiologi, yaitu untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri cultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis, memerlukan suatu popolasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja (Hadioetomo, 1993). Sifat organisme dalam suatu biakan murni dapat dipelajari dengan metode yang amat keras dengan hasil yang sangat akurat karena pengaruh sel hidup yang lain dapat ditiadakan (Volk, 1993). Terdapat beberapa cara untuk mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan dan untuk menanam suatu species yaitu :

1.

Penanaman dengan penggoresan Merupakan cara rutin yang dipakai untuk mengasingkan mikroba agar didapatkan biakan murni.

2.

Penanaman lapangan Dilakukan dengan membasahi seluruh permukaan lempeng agar dengan suspensi mikroba.

Cara yang dapat dilakukan untuk mendapatkan biakan murni terdapat beberapa, yaitu : 1. Pengenceran 2. Penuangan 3. Penggesekan 4. Single cell isolatiom 5. Inokulasi hewan (Budiarti, 2009) Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikroba yaitu: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi Tempat hidup atau asal mikroba tersebut Medium pertumbuhan yang sesuai Cara menginokulasi mikroba Cara menginkubasi mikroba Cara menguji bahwa mikrobia yang diisolasi telah berupa kultur murni dan sesuai dengan yang dimaksud 7. Cara memelihara agar mikrobia yang telah diisolasi tetap merupakan kultur murni

Penggunaan media bukan hanya untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba, tetapi juga untuk tujuan-tujuan lain, misalnya untuk isolasi, seleksi, evaluasi, dan deferensiasi biakan yang didapatkan. Artinya penggunaan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba, banyak dilakukan dan dipergunakan. Sehingga tiap-tiap media mempunyai sifat (spesifikasi) tersendiri sesuai dengan maksudnya (Baker, 1986). Bakteri adalah salah satu contoh mikroorganisme yang penting dan memiliki bentuk yang beragam. Pada umumnya bakteri berhubungan dengan makanan. Adanya bakteri dalam bahan pangan dapat mengakibatkan pembusukan yang tidak diinginkan atau menimbulkan penyakit yang ditularkan melalui makanan atau dapat melangsungkan fermentasi yang menguntungkan (Buckle, 1987). Dilakukan serangkaian pengenceran terhadap zat tersebut untuk mengisolasi bakteri dari tanah/benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut atau zat cair. Misalnya suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran diencerkan dalam suatu tabung tersendiri secara berkelanjutan dari suatu tabung ke tabung lain (Dwidjoseputro, 1994). Pertumbuhan bakteri pada medium agar pada umumnya berbentuk koloni berupa lendir dan mengkilap. Pemurnian dengan suhu inkubasi 30C selama 2 x 24 jam (Cappuccino & Sherman, 1983). Selain bakteri, di alam masih terdapat mikroorganisme lain seperti khamir dan fungi. Khamir termasuk fungi, tetapi dapat dibedakan dari kapang karena

bentuknya yang uniseluler, dan memiliki ukuran 5 dan 20 mikron (Fardiaz, 1992). Biasanya berukuran 5 sampai 10 kali lebih besar dari bakteri. Sumber khamir

terutama terdapat pada daun-daun, bunga-bunga, eksudat dari tanaman, buah lewat masak, tanah kebun buah, serta khamir yang banyak di jual dipasaran. Khamir/yeast dapat tumbuh dalam media cair dan pada dengan cara yang sama dengan bakteri. Penampakan pada medium akan tampak seperti koloni bakteri, hanya saja koloninya tidak mengkilap (Buckle, 1987). Fungi/kapang sangat berlawan dengan bakteri dan khamir/yeast, seringkali dapat dilihat oleh mata. Bentuk khas yang dimiliki oleh kapang adalah adanya filamen (miselium) (Fardiaz, 1992). Inilah yang membedakannya dengan mikroorganisme lainnya. Fungi mempunyai bentuk seperti kapas dan biasanya terlihat pada kertaskertas koran basah, kulit yang sudah usang, dinding basah, buah-buahan yang membusuk dan bahan pangan lain seperti keju dan selai. Sumber fungi hampir sama dengan bakteri, hanya saja perbedaannya populasi fungi di air lebih sedikit dan fungi lebih menyukai pH lingkungan yang rendah (Buckle, 1987). Pemurniannya dengan suhu inkubasi 28C selama 2 x 24 jam. Pengukuran kuantitatif populasi suatu mikroba dapat dilakukan dengan penentuan jumlah sel dan penentuan massa sel (Fardiaz, 1992). Ada berbagai macam cara untuk mengukur jumlah sel antara lain dengan hitungan cawan, hitungan mikroskopis langsung, atau dengan alat colony counter (Hadioetomo, 1993).

BAB III METODE PRAKTIKUM

3.1

Waktu dan Tempat Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin tanggal 5 Oktober 2009

bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas MIPA Unlam Banjarbaru.

3.2

Alat dan Bahan Alat alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung reaksi steril, cawan petri steril, vortex mixer, ependorp pipet, pipet volumetric, kertas label, holly stick, jarum inokulasi, labu erlenmenyer, karet gelang, waterbath, inkubator, lampu spritus, aluminium foil, kapas. Bahan - bahan yang digunakan adalah medium nutrient agar (NA), alkohol 70%, spritus, aquadest/larutan fisiologis steril, sumber bakteri, media PDA, bayklin.

3.3

Prosedur Kerja

Isolasi dan Pemurnian Bakteri 1. Dibuat medium Nutrient Agar 2. Dimasukkan sebagian ke dalam tabung reaksi @ 5 ml 3. Dimasukkan sebagian ke dalam labu erlenmeyer 4. Disterilkan pada 121oC selama 15 menit. 5. Dibuat serangkaian pengenceran sampel 101-105 6. Disuspensikan ke dalam cawan petri steril sebanyak 1 ml dari pengenceran tertinggi 7. Diratakan pada dasar cawan dengan menggoyangnya

8. Dituang 10-15 ml sampel agar bersuhu 45oc 9. Digoyang membentuk angka 8 10. Dibiarkan hingga memadat 11. Diinkubasi terbalik pada 30oc selama 24 jam 12. Dimurnikan secara goresan koloni yang terpisah 13. Dipindah ke media agar miring

Isolasi dan Pemurnian Yeast / Khamir 1. Dibuat medium PDA 2. Dimasukkan sebagian ke dalam tabung reaksi @ 5 ml 3. Dimasukkan sebagian ke dalam labu erlenmeyer 4. Disterilkan pada 121oC selama 15 menit. 5. Dibuat serangkaian pengenceran sampel 101-105 6. Dimasukkan dari pengenceran tertinggi 1 ml suspensi khamir ke dalam cawan petri steril 7. Diratakan pada dasar cawan dengan menggoyangnya 8. Dituang cawan-cawan yang berisi suspensi dengan 10-15 ml dengan media PDA bersuhu 45 oC 9. Dibiarkan hingga memadat 10. Diinkubasi terbalik pada 30oC selama 2x24 jam 11. Dimurnikan secara goresan koloni yang terpisah 12. Dipindah ke media agar miring

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Hasil Hasil yang dapat diperoleh dari praktikum kali ini adalah sebagai berikut :

Table 1. Hasil Praktikum Tabel 1.1 Sampel Air Kemasan (1x24 jam) No. 1. 10-2(1) Gambar Konsentrasi Jumlah Koloni

1

2. 10-2(2)

8

3. 10-3(1)

3

4. 10-3(2)

2

Tabel 1.2 Sampel Air Sumur (1x24 jam) No. 1. 2. 3. 4. 10-5(2) Gambar Konsentrasi 10-4(1) 10-4(2) 10-5(1) Jumlah Koloni -

1

5. 10-6(1)

2

6.

10-6(2)

-

Tabel 1.3 Sampel Air Ledeng (1x24 jam) No. 1. Gambar Konsentrasi Jumlah Koloni

10-4(1)

1

2. 10-4(2) -

3.

10-5(1)

16

4. 10-5(2) 29

5. 10-6(1) 12

6.

10-6(2)

9

Tabel 1.4. Sampel Tanah Kebun (2x24 jam) No. 1. Gambar Konsentrasi Jumlah Koloni

10-4(1)

-

2.

10-4(2)

2

3.

10-5(1)

-

4. 10-5(2)

-

5.

10-6(1)

-

6. 10-6(2)

rusak

Table 1.5 Sampel Tanah Dekat Sampah (2x24 jam) No. 1. 10-4(1) Gambar Konsentrasi Jumlah Koloni

3

2. 10-4(2) 2

3.

10-5(1)

2

4. 10-5(2)

-

5.

10-6(1)

-

6. 10-6(2)

Rusak

4.2

Pembahasan Pengisolasian merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan

mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Ada beberapa cara yang dapat dilakukan untuk mengisolasi mikroba antara lain dengan cara goresan (streak plate), cara tuang atau taburan (pour plate), cara pengenceran (dilution method), serta micromanipulator. Beberapa teknik ini memiliki kelebihan dan kekurangan masing-masing. Pada teknik pengenceran, apabila kita hanya mengambil 1 ml, kemungkinan akan di dapat satu koloni saja, tetapi apabila kita tidak yakin dengan koloni tersebut kita dapat melakukan pengenceran ulang. Piaraan murni yang dihasilkan akan lebih terjamin apabila kita melakuka isolasi dengan penuangan. Dimana metode ini yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan dan sampel itu kemudian disebarkan di dalam suatu medium. Dulu digunakan medium kaldu atau gelatin, sekarang digunakan dengan medium agar. Metode dengan penggesekan, sekarang banyak digunakan karena hemat waktu, tetapi bakteri anaerob tidak dapat tumbuh. Dengan metode micromanipulator, kita memerlukan kesabaran dalam pengerjaannya selain itu harganya sangat mahal, tetapi dengan menggunakan alat micromanipulator ini kita dapat dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak, dengan tiada ikut sertanya bakteri lain. Percobaan kali ini digunakan beberapa sampel tanah dan air. Teknik yang digunakan dalam pengisolasiannya adalah metode tuang untuk sampel air dan metode sebar untuk sampel tanah. Sampel yang digunakan adalah air ledeng, air

sumur, air kemasan, tanah kebun dan tanah dekat sampah. Pertama-tama dilakukan pengenceran beberapa kali terhadap sampel yang digunakan. Kemudian disebarkan ke dalam media. Untuk air menggunakan media Nutrient Agar (NA) dan tanah menggunakan media Potato Dextrose Agar (PDA). Pertama-tama yang dilakukan adalah membuat medium. Dalam percobaan ini dibuat medium Nutrient Agar (NA) dan Potato Dextrose Agar (PDA). Setelah dibuat, medium tersebut kemudian dimasukkan sebanyak 5 ml masing-masing ke dalam 5 tabung reaksi yang berbeda selanjutnya disterilkan dengan otoklaf. Kemudian 1 ml sampel air dimasukkan ke dalam tabung reaksi 1, 1 ml sampel dari tabung reaksi 1 dimasukkan ke dalam tabung reaksi 2, begitu seterusnya. Hal ini bertujuan untuk melakukan pengenceran terhadap sampel air. Setelah mencapai titik pengenceran yang tertinggi, diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam cawan petri, langkah selanjutnya cawan petri diisikan dengan medium NA dan medium PDA. Medium yang sudah diiisi dengan mikrobia harus diletakkan terbalik saat diinkubasi di dalam inkubator, hal ini dimaksudkan agar cairan yang dihasilkan dari metabolisme mikrobia pada medium tersebut tidak jatuh pada medium, sehingga akan menyebabkan rusaknya medium tumbuh tersebut. Harus diingat, dalam melakukan percobaan ini dilakukan sterilisasi terhadap alat-alat yang digunakan dengan menggunakan lampu spiritus. Sterilisasi dilakukan baik sebelum atau pun sesudah memasukkan bahan ke dalam alat. Kondisi yang steril dari alat, bahan, maupun praktikan mutlak diperlukan dalam pengisolasian dan pemurnian mikrobia. Hal ini berguna untuk menjaga atau mencegah terjadinya kontaminasi. Karena itu dalam setiap prosedur kerja, baik saat pengenceran ataupun saat menyebar

mikrobia ke dalam medium perlu kehati-hatian agar tidak terjadi kontaminasi yang dapat merusak hasil percobaan. Media NA menggunakan sampel air dan media PDA menggunakan sampel tanah. Hal ini dilakukan karena media NA berfungsi sebagai media pertumbuhan bakteri, sehingga dengan menggunakan media ini dapat diketahui bakteri apa saja yang ada di dalam sampel air yang digunakan. Sedangkan untuk media PDA berfungsi sebagai media pertumbuhan jamur, sehingga dengan menggunakan media ini dapat diketahui ada tidaknya jamur dari tanah sampel yang digunakan. Pengamatan pun dilakukan terhadap sampel selama 2 x 24 jam. Pada pengamatan pertama yaitu pada saat 1 x 24 jam, terlihat pertumbuhan bakteri pada semua sampel baik air maupun tanah. Untuk media NA yang digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri dengan sampel air, pertumbuhan bakteri yang paling banyak terdapat pada air ledeng dengan titik pengenceran 10-5 (2). Hal ini terjadi karena dalam sistem distribusi air dari reservoir ke pelanggan melalui sistem perpipaan dapat terjadi kontaminasi di sepanjang pipa. Sementara untuk air sumur, sampel yang diambil berasal dari sumur bor (air tanah dalam) sehingga kontaminasi bakteri sangat sedikit. Jumlah koloni yang paling sedikit terdapat pada air kemasan. Hal ini karena untuk air kemasan telah dilakukan sterilisasi sebelum pengemasan oleh pabrik. Air kemasan dapat langsung diminum sehingga diusahakan agar benar-benar terbebas dari bakteri untuk memenuhi standar kelayakan air minum. Pada pengamatan ini dilakukan 3 kali pengenceran saja karena jika dilakukan pengenceran lebih tinggi, kemungkinan sudah tidak terdapat bakteri lagi. Terlihat dari sedikitnya jumlah koloni yang tampak hanya dengan pengenceran sampai 10-3. Pengamatan untuk media NA

hanya dilakukan sekali, yaitu 1 x 24 jam. Sedangkan untuk pengamatan media PDA dilakukan selama 2 x 24 jam. Setelah pengamatan selama 2x24 jam terhadap media PDA didapatkan hasil bahwa hanya tanah kebun dengan pengenceran 10-4 (2), tanah dekat sampah dengan pengenceran 10-4 (1), 10-4 (2), dan 10-5 (1) yang ditumbuhi oleh jamur. Dengan masing-masing jumlah koloninya untuk tanah kebun 2, tanah dekat sampah berturutturut 3, 2, dan 2. Koloni jamur yang paling banyak terdapat pada tanah sampah dengan konsentrasi 10-4 (1) yaitu sebanyak 3. hal ini dikarenakan tanah yang berada di dekat sampah umumnya lembab sehingga mudah ditumbuhi oleh jamur. Sedangkan untuk jumlah koloni yang paling sedikit terdapat pada tanah kebun dengan konsentrasi 10-4 (2). Hal ini dikarenakan tanah kebun memiliki tingkat kelembaban yang lebih sedikit dibanding tanah dekat sampah, karena pada tanah kebun hanya ditanami oleh tanaman yang ada di kebun itu saja, sedangkan pada tanah dekat sampah terdapat beberapa macam sampah yang memiliki komposisi yang berbeda sehingga lebih lembab dan memudahkan jamur untuk tumbuh. Kebanyakan dari hasil percobaan terhadap sampel tanah tidak hanya ditumbuhi oleh jamur, tetapi juga oleh mikroba lain seperti bakteri. Hal ini disebabkan karena terjadi kontaminasi pada saat pengerjaan, baik sterilisasi alat yang tidak benar, atau kesalahan praktikan saat mengerjakan percobaan ini serta tidak menggunakan antibiotik ketika mengerjakannya. Selain itu pula pada sampel tanah kebun dengan pengenceran 10-6 (2) dan tanah dekat sampah dengan pengenceran yang sama terjadi kerusakan media. Hal ini juga dikarenakan kesalahan praktikan

saat menuang media ke dalam cawan petri terlalu banyak atau teralu keras pada saat menggoyangnya. Dilakukannya isolasi dan pemurnian mikroba memiliki alasan tersendiri. Hal ini karena dalam setiap percobaan yang menggunakan mikroba haruslah mempunyai persediaan mikroba yang diperlukan. Untuk menggampangkan praktikan dalam melakukan percobaan dengan menggunakan mikroba. Sehingga tidak perlu susah lagi dalam mengerjakannya. Manfaat dilakukannya isolasi dan pemurnian mikroba adalah setelah mendapatkan kultur murni maka dapat ditelaah dan diidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelahaan ciri-ciri cultural, morfologis, fisiologis maupun serologis, karena untuk itu diperlukan suatu pupolasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja.

BAB V PENUTUP

5.1

Kesimpulan Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan

sebagai berikut : 1. Isolasi adalah cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. 2. Teknik isolasi yang digunakan dalam percobaan ini adalah teknik sebar untuk isolasi sampel air dan tuang untuk isolasi sampel tanah. 3. Media yang digunakan dalam percobaan ini adalah media Nutrient agar (NA) untuk sampel air dan media Potato Dextrose Agar (PDA) untuk sampel tanah. 4. Dari hasil percobaan didapatkan untuk sampel air jumlah koloni bakteri yang tumbuh paling banyak terdapat pada sampel air ledeng dengan pengenceran 10-5 (2) dengan jumlah koloni 29, dan yang paling sedikit pada sampel air kemasan. 5. Dari hasil percobaan didapatkan untuk sampel tanah jumlah koloni jamur yang tumbuh paling banyak terdapat pada sampel tanah dekat sampah dengan pengenceran 10-4 (1) dengan jumlah koloni 3, sedangkan yang paling sedikit pada sampel tanah kebun 10-4 (2) dengan jumlah koloni 2. 6. Banyaknya sampel yang tidak ditumbuhi oleh mikroba, atau ditumbuhi oleh mikroba lain, disebabkan terjadinya kontaminasi pada saat pengerjaannya atau sterilisasi alat yang tidak benar. Selain itu penuangan media yang terlalu banyak juga menyebabkan rusaknya media, sehingga tidak dapat ditumbuhi oleh mikroba.

7.

Pemurnian dan isolasi mikroba penting dilakukan agar didapatkan kultur murni dan sebagai stock mikroba, sehingga tidak perlu repot lagi ketika melakukan percobaan yang menggunakan mikroba.

5.2

Saran Dalam pengerjaan percobaan isolasi dan pemurnian mikroba ini harus benar-

benar steril sehingga tidak terjadi kontaminasi dan kerusakan media dan di dapatkan kultur murni sesuai yang diinginkan.

DAFTAR PUSTAKA

Baker Fj, Silverton RE, 1986. Microssopy and Microbiology. Saunder Collage Publishing, London. Buckle, K.A. 1987. Ilmu Pangan. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta. Budiarti, Lia Yulia. 2009. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Terintegrasi. Penerbit Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru. Cappuccino, J. G. dan Natalie. S. 1983. Microbiology A Laboratory Manual. Addison-Wesley Publishing Company, New York. Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan. Jakarta. Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Hadietomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia, Jakarta. Pelczar, Jr et al. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit Universitas Indonesia (UI Press), Jakarta. Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga, Jakarta.