BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangDNA merupakan materi genatik yang yang mengkode

semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. Isolasi DNA adalah suatu tekhnik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau jaringan baik hewan, tumbuhan maupun manusia. Isolasi DNA merupakan teknik awal dalam pemanfaatan DNA untuk berbagai tujuan.

Prosedur ini memiliki beberapa tujuan analisis yaitu visualisasi DNA, peninjauan pola fragmentasi DNA, pembuatan pustaka genomik, rekayasa gen, dan amplifikasi DNA. Terdapat tiga tahapan dasar dan dua tahapan tambahan dalam prosedur isolasi DNA ini, yaitu preparasi ekstrak DNA (perusakan dinding sel dan lisis membran sel), purifikasi DNA, dan presipitasi DNA, serta pemisahan terhadap protein (dengan protease) dan RNA (dengan RNAse). Setiap maksud penggunaan DNA yang beragam membutuhkan persyarakan kualitas DNA yang berbeda. Kualitas DNA tersebut ditentukan oleh hal-hal berikut yaitu kemurnian DNA, panjang DNA, kemampuan dipotong oleh sembarang enzim, tidak mengalami modifikasi selama proses isolasi berlangsung. Oleh sebab itu, terdapat sejumlah teknik isolasi DNA, yang disesuaikan untuk berbagai maksud penggunaan dan kualitas minimum yang ingin dicapai.

1.2 Tujuan Untuk mengetahui tentang pengertian isolasi DNA Untuk megetahui macam-macam metode Isolasi DNA Untuk mengetahui tahap isolasi DNA Untuk mengetahui manfaat isolasi DNA

1.3 MaanfaatDalam praktikum kali ini akan diperoleh banyak

manfaat, salah satu diantaranya yaitu agar dapat memberikan pengetahuan kepada mahasiswa tentang cara melakukan isolasi DNA dengan bahan yang sederhana.

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Isolasi DNA

a. Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama.(Listanto,1996)

b. Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA.salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993).

c. DNA issolation is the use of DNA for analysis or manipulation usually requires that it is isolated and purified to a certain extent. Terjemahan: Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau dimanipulasi yang harus diisolasi terlebih dahulu dan murni kandungannya (Wilson, Keith and John, 2010).

2.2 Macam Metode Isolasi DNA1. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak. Primer tunggal

ini biasanya berukuran 10 basa. PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60%

2. Metode CTAB Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008).

3. Phenol:chloroform Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol.

4. SaltingOut enggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein.

5. Guanidine isothiocyanate Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel , Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein.

6. Silica Gel Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang (Barnum 2005).

7. PCR (Polymerase Chain Reaction) Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik

yang dibatasi oleh dua buah primer oligo nukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Giri, 2004).

2.2 Tahap Isolasi DNAa. Isolasi Jaringan

Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.

b. Pelisisan Dinding dan Membran SelTahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi.

c. Pengekstraksian dalam larutanSelanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan

kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.

d. Purifikasi Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur.

Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.

e. Presipitasi Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas.

( Giri, 2004)

2.4 Manfaat Isolasi DNA

Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik. Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensik perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu (bagi pemerkosa

misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau korban perang), penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan.

Sedangkan manfaat lain dari isolasi DNA yang khususnya dalam bidang pertanian yakni manusia dapat memanfaatkan proses alami pertukaran genetik melalui pemuliaan yang menciptakan variasi ciri biologi. Fakta ini melandasi semua upaya untuk memperbaikan varietas – varietas tanaman pertanian, baik melalui pemuliaan tradisional maupun melalui teknik biologi molekuler. Dalam kedua metode ini, manusia memanipulasi proses alam untuk menghasilkan berbagai varietas tanaman yang menunjukan sifat atau ciri khas yang diinginkan, seperti meningkatkan produksi, tahan terhadap serangan hama dan penyakit, atau ternak dengan produksi daging yang tinggi dengan kadar lemak yang rendah.

Metoda biologi molekuler dapat menyederhanakan masalah ini dengan memanipulasi gen ataupun DNA satu persatu. Tanpa bergantung pada terjadinya rekombinasi sejumlah besar gen, para ilmuwan dapat menyisipkan satu persatu gen untuk sifat spesifik secara langsung ke dalam genom yang telah terbentuk. Para ilmuwan dapat pula mengendalikan ekspresi gen dalam varietas tanaman baru. Transfer gen molekuler dapat memperpendek waktu yang diperlukan untuk mengembangkan varietas baru dan memberikan ketepatan yang lebih besar untuk sifat yang diinginkan. Selain itu juga dapat digunakan untuk mempertukarkan gen antara organisme yang tidak dapat disilangkan secara seksual.

(Yuwono, 2006)

BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat, Bahan dan Fungsi

3.1.1 Alat

a. Mortar: tempat untuk menghaluskan bahan.a. Pestle: untuk menggerus/menumbuk bahan.b. Tips: tempat cairan pada saat akan dipindahkan

dalam tube.c. Gelas ukur: untuk mengukur volume larutan.d. Tubes 1,5 ml: sebagai tempat larutan ekstraksi bahan.e. Mikro pipet: untuk memindahkan cairan.f. Mesin PCR: untuk memperkuat segmen DNA melalui

reaksi berantai polimerase/PCR proses.g. Oven: untuk mengeringkan bahan ataupun alat.h. Vortex: untuk mengaduk/ mencampurkan larutan

dalam tube.i. Timbangan analitik: untuk menimbang bahan.j. Mesin elektroforesis: untuk mendeteksi protein dan

asam amino.k. Centrifuge: untuk memisahkan larutan berdasarkan

jenisnya.l. Lemari es: untuk menginkubasi larutan.

3.1.2 Bahan

a. Daun tanaman yang masih segar dan tidak mengkilat, yakni daun cabai, tomat dan sawi sebagai bahan perlakuan yang diisolasi DNA-nya

b. CTAB dan merkapto ethanol untuk memecah dinding sel dan menjaga DNA agar tidak rusak.

c. Tris HCl pH 8.0 dan EDTA untuk meresistensi

d. Nitrogen cair untuk membantu penggerusan dan penghalusan tumbukan daun dan merusak dinding sel.

e. CHISAM/Chloroform, Isoamilalkohol untuk mengeluarkan isi sel dan untuk mengurangi kontaminasi protein dan polisakarida

f. Buffer pencuci untuk mencuci larutan

3.2 Langkah Kerja + Dokumentasi

Campur buffer ekstraksi (1 ml) dengan karbon (0,5% w/v) & mercaptoethanol 4 μl (kocok sebelum digunakan)

Masukkan 1 ml ke dalam tube ukuran 1,5 ml & tutup tube (beri label pada tube)

Tube berisi buffer ekstraksi

Timbang 0,1 g sampel daun

Masukkan dalam mortar, tambah sedikit PVP, tambah N2 cair, segera digerus sampai halus (jangan sampai mencair)

Segera vortex sampai rata

Inkubasi dalam oven (65°C selama 10’), bolak-balik tube setiap 5’

Keluarkan tube dari oven & dinginkan sebentar

Setelah dingin, sentrifuge (13.000 rpm selama 5’)

Ambil supernatant & pindahkan ke tube baru (tube 2 ml/1,5 ml)

Tambah 500 μl chisam pada supernatant & vortex

Sentrifuge (13.000 rpm selama 5’)

Pindahkan supernatant ke tube 1,5 ml, tambahkan chisam 500 μl & vortex

Sentrifuge (13.000 rpm selama 5’)

Pindahkan supernatant ke tube baru 1,5 ml, tambahkan 300 μl isopropanol dingin secara perlahan

Bolak-balik tube secara perlahan (jangan sampai terguncang keras & inkubasi dalam frezer selama 10’)

Keluarkan tube dan biarkan hingga tidak terlalu dingin & sentrifuge (10.000 rpm selama 5 menit)

Sentrifuse (10.000 rpm selama 5’)

Buang supernatant, tambahkan buffer pencuci 500 μl pada pelet dalam tube vortex

Pindahkan supernatant ke tube 1,5 ml, tambahkan chisam 500 μl & vortex

Sentrifuge (13.000 rpm selama 5’)

Pindahkan supernatant ke tube baru 1,5 ml, tambahkan 300 μl isopropanol dingin secara perlahan

Keluarkan tube & biarkan hingga tidak terlalu dingin, sentrifuge (10.000 rpm selama 5’)

Bolak-balik tube secara perlahan (jangan sampai terguncang keras & inkubasi dalam frezer selama 10’)

Buang supernatant, tambahkan buffer pencuci 500 μl pada pellet dalam tube vortex

Sentrifuse (10.000 rpm selama 5’)

Buang supernatant &kering anginkan pellet sampai kering

Tambahkan buffer TE 50 – 100 μl & larutkan pellet DNA dengan cara mengketuk-ketuk tube secara perlahan

3.2 Analisis Perlakuan

Pada praktikum isolasi DNA ini, menggunakan daun bayam, cabai dan kangkung sebagai objek pengamatan praktikum. Daun yang telah dipotong kecil-kecil ditumbuk dengan mortar dengan diberi Nitrogen cair untuk mempercepat proses penumbukan menjadi bubuk dan telah diberkan PVP 1%, buffer ekstraksi, β mercaptoethanol, dan diinkubasi dalam oven selama 30 menit. Lalu setelah didinginkan sebentar, dimasukkan dalam sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Setelah itu supernatant dipindahkan ke tube baru dan diberi chisam lalu divortex, kemudian disentrifuge selama 10 menit. Supernatan dipindahkan lagi ke tube baru lalu ditambahkan chisam sebanyak 500 μl dan di vortex kembali. Setelah itu disentrifuge lagi selama 10 menit. Supernatant dipindahkan pada tube baru, lalu ditambahkan isopropanol sebanyak 300 μl, kemudian dibolak-balik secara perlahan dan diinkubasi dalam freezer selama 30 menit. Disentrifuge kembali, supernatant dibuang dan ditambahkan buffer pencuci 500 μl pada pellet

Tambahkan 1 μl RNAse, inkubasi dalam oven suhu 37°C selama 30’

Isolat DNA, kemudian simpan dalam freezer

dalam tube, kemudian di vortex, sentrifuge pada kecepatan 9000 rpm selama 10 menit. Supernatant dibuang dan pallet diangin-keringkan selama ± 20 menit. Setelah itu ditambahkan buffer TE sebanyak 50-100 μl dan pellet DNA dilarutkan dengan cara mengketuk-ketuk tube secara perlahan. Terakhir ditambahkan 1 μl RNAse, lalu diinkubasi dalam oven suhu 37°C selama 30 menit, dan isolasi DNA disimpan dalam freezer.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

NO Gambar Dokumentasi

Keterangan

1.

Daun cabe yang sudah dihaluskan dimasukkan kedalam tube

2.

Daun sawi yang sudah dihaluskan kedalam tube

3.Tube dimasukkan kedalam oven

4.

Tube dimasukkan kedalam centrifuge untuk memisahkan larutan berdasarkan berat molekul

5.

Menambahkan chisam kedalam tube yang berisi supernatan

No. Gambar Dokumentasi

Keterangan

6. Pemisahan supernatan dari larutan yang sudah dipisahkan dengan menggunakan centrifuge

7.Memindahkan supernatan kedalam tube yang baru

8. Pemberian chisam sebelum tube dimasukkan kedalam centrifuge untuk melihan adanya DNA

9.

Dna yang terlihat setelah di centrifuge dengan putaran 10.000 rpm selama 5 menitYaitu pada sampel cabai.

4.2 Pembahasan

Dari hasil praktikum didapatkan hasil bahwa dari ketiga sampel (daun cabai, sawi dan tomat) yang digunkan untuk isolasi DNA-nya, hanya daun cabai yang terlihat DNA nya. saat dielektroforesis. Tidak semua sampel terlihat kemungkinan dikarenakan kurang efektifnya perlakuan saat praktikum serta kesterilan alat dan bahan praktikum atau alat-alat yang digunakan terjadi kontaminasi. Selain itu dapat pula dikarenakan kurangnya keterampilan praktikan saat melakukan praktikum ( terjadi human eror).

Hal ini sesuai dengan pernyataan Ardiana (2009) “DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid, sehingga diperlukan cara untuk menghindari hal di atas. Teknik yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah kombinasi penambahan antioksidan polivinilpolipirolidon (PVPP) dan mercaptoethanol pada buffer ekstraksinya. Dengan kombinasiini dihasilkan kualitas DNA yang baik”.

Berbagai teknik atau metode dapat dilakukan untuk mengisolasi DNA tergantung dari jenis tanaman, organ tanaman atau jaringan tanaman yang digunakan. Tetapi pada dasarnya ada tiga faktor penentu dalam ekstraksi dan purifikasi DNA secara optimal : 1) Penghomogenan jaringan tanaman, 2) Komposisi penambahan larutan buffer pada saat penggerusan daun/jaringan tanaman sampel, dan 3) Penghilangan enzim penghambat polisakarida khususnya untuk tanaman tahunan.

(Tridjatmiko, 2006)

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Isolasi DNA merupakan Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau dimanipulasi yang harus diisolasi terlebih dahulu dan murni kandungannya. Dalam praktikum isolasi DNA, dapat diketahui bahwa pada saat larutan ekstraksi daun disentrifuge pertama kali akan terlihat adanya 3 larutan yang terpisah satu sama lain yaitu, lapisan atas disebut supernatant (Chisam+DNA), lapisan tengah yaitu fase organik, dan lapisan bawah yang disebut fenol. Sedangkan pada saat sentrifuge yang kedua yaitu hanya larutan supernatant yang digunakan sehingga ada 2 material yang terpisah yaitu lapisan atas (DNA) berwarna putih dan lapisan bawah (Chisam) berwarna bening.

Dalam praktikum ini, digunakan daun cabai, sawi dan tomat untuk proses pengisolasian DNA. Didapatkan hasil hanya DNA pada daun cabai yang terlihat hal ini dikarenakan ada faktor- faktor yang menyebabkan DNA tidak terlihat kemungkinan dikarenakan kurang efektifnya perlakuan saat praktikum serta kesterilan alat dan bahan praktikum atau alat-alat yang digunakan terjadi kontaminasi. Selain itu dapat pula dikarenakan kurangnya keterampilan praktikan saat melakukan praktikum ( terjadi human eror).

5.2 Kritik dan Saran

5.2.1 Kritik dan Saran untuk Praktikum Tahun Depan

Praktikum kurang efektif karena dilaksanakan 2 minggu sekali sehingga keterbatasan waktu juga menyebabkan praktikan kurang memahami dan mengerti. Semoga untuk tahun depan lebih baik lagi

5.2.2 Kritik dan Saran untuk Asisten

Kurang tegas sehingga praktikan menjadi santai....semoga lebih tegas lagi dan lebih baik lagi

DAFTAR PUSTAKA

Ardiana, d.w. 2009. Teknik isolasi dna genom tanaman pepaya dan jeruk dengan menggunakan modifikasi bufer ctab. Bul. Teknik pertanian. 14(1): 12-16.

Giri-Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme Bakteri. Bandung : KPP Bioteknologi Bandung.

Listanto, E; pardal,s.j; Wang, k. 1996. Jurnal Bioteknologi Pertanian, Indonesian Journal of Agricultural Biotechnologi. Metode sederhana isolasi DNA dari tanaman jagung transgenic untuk polymerase chain reaction. Balai penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. Bogor

Mader,S.S.1993.Biology.Wm.C Brown Publishers: Lowa

Prasetyo, A. 2008. Karakterisasi virus pada tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.). Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada. Skripsi.(Tidak Dipublikasikan)

Tridjatmiko, k.r. 2006. Penggunaan metode pcr untuk Deteksi cepat keragaman dna. Pelatihan dan Workshop identifikasi DNA dengan aplikasi pcr. Malang. P.22-25.

Wilson,keith and john walker,2010.Principles and Techniques of Biochemistry and molecular Biology.Cambridge University Press,New York.

Yuwono, T.2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta : Gajahmada University Press.

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“Materi Isolasi DNA“

Nama : Dian Khoiratun R.S

NIM : 125040201111273

Kelompok : Jum’at/ 15.00-16.45

Asisten : M. Harisullah

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG

2013