LAPORAN PRAKTIKUM

BIOLOGI SEL MOLEKULER

KODE MATA KULIAH BIU 1102

Disusun oleh:

MA’RUF

P2BA09006

PROGRAM STUDI S2 BIOLOGI

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

PURWOKERTO

2010

1

KATA PENGANTAR

Praktikum mata kuliah Biologi Sel molekuler dilaksanakan guna memenuhi

satuan kredit semester (SKS) yang dilaporkan berdasarkan hasil kegiatan sesuai dengan

petunjuk praktikum. Pelaksanaan praktikum ini dilakukan dengan menyesuaikan pencapaian

kompetensi mata kuliah dan ketersediaan fasilitas peralatan yang ada di laboratorium, oleh

karena itu tentu hasil yang kami peroleh belum dapat memenuhi harapan yang ideal.

Adapun tujuan dilaksanakan kegiatan praktikum adalah memperjelas materi

perkuliahan, memberi sedikit bekal kepada kami tentang metode untuk mempelajari biologi

sel molekuler, menumbuhkan semangat bekerja dalam tim serta melatih kami dalam hal

penulisan laporan ilmiah.

Atas dasar petunjuk praktikum mata kuliah Biologi Sel Molekuler, kegiatan praktikum

ini terdiri lima acara yaitu :

I. Isolasi DNA Plasmid

II. Restriksi DNA Plasmid

III. Elektroforesis Gel Agarosa

IV. Ligasi DNA

IV. Transformasi.

Saran dan kritik dari semua pihak sangat kami hargai demi peningkatan kualitas

kegiatan maupun laporan praktikum yang tentunya akan dapat menjadi bekal bagi kami dalam

mencapai kompetensi mata kuliah Biologi Sel Molekuler.

Purwokerto, Pebruari 2010

Praktikan

2

DAFTAR ISI

Halaman

Halaman sampul ........................................................................................................... 1

Kata Pengantar ............................................................................................................. 2

Daftar Isi ........................................................................................................................ 3

ACARA I. ISOLASI DNA PLASMID ..................................................................... 4

ACARA II. RESTRIKSI DNA PLASMID ................................................................ 20

ACARA III. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA ............................................... 23

ACARA IV. TRANSFORMASI ................................................................................ 31

3

ACARA I.

ISOLASI DNA PLASMID

LANDASAN TEORI

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang

terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid

pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri,

tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam

rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu

yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan

mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.

Berikut prosedur isolasi plasmid yang biasa dilakukan dalam praktikum:

1. PEMANENAN SEL

Tahap satu ini ditujukan untuk mendapatkan pelet sel yang terpisah dari media

pertumbuhannya.

2. PELEPASAN PLASMID DARI SEL

Setelah diberi Lar II, maka seharusnya terdapat lendir pada tutup tube (jika dibuka); Lar

I, II, III diusahakan dingin.; setelah diberi Lar III, biasanya akan ada gumpalan putih.STE

(Sodium Tris EDTA) berfungsi sebagai pencuci sel dari media dan bahan lain. saat sel

dicampur dengan Lar I, maka tris-EDTA dapat mengikat Mg 2+ dan Ca2+ -->

mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan

menghambat DNAse. sedangkan glukosa dari Lar I akan mencegah buffer (tris) merusak sel

dan membuat lingkungan hiperosmotik.

4

STE (Sodium Tris EDTA) berfungsi sebagai pencuci sel dari media dan bahan lain. saat sel

dicampur dengan Lar I, maka tris-EDTA dapat mengikat Mg 2+ dan Ca2+ -->

mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan

menghambat DNAse. sedangkan glukosa dari Lar I akan mencegah buffer (tris) merusak sel

dan membuat lingkungan hiperosmotik

Sodium Dodecyl Sulphate ( SDS ) dari Lar II dapat melubangi membran sel karena

SDS adalah salah satu jenis deterjen yang mampu mengikat (menyelimuti)protein membran

sehingga terpisah dari bilayer lipid. NaOH akan memecahkan dinding sel dan juga

mendenaturasi DNA kromosom sehingga tampak lebih kusut. plasmid juga terdenaturasi,

namun yang membedakan adalah ukurannya, plasmid mudah untuk renaturasi. plasmid dan

RNA akan keluar dari pori-pori membran tapi DNA kromosom masih tetap di dalam sel

karena terlalu besar untuk keluar.

KAc (Kalium Acetic) (asam) akan menetralkan NaOH sehingga plasmid dapat terenaturasi

jika etanol tidak kering, maka dapat mengganggu kerja enzim dan tidak mengendapkan DNA

saat dielektroforesis.

Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA

tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etamol absolut dingin --> mengendapkan DNA

plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid. bagaimana bisa etanol

mempresipitasi DNA? : penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula

fosfat DNA. ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang

bermuatan negatif. jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih

lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan

+pada H dan - pada O). atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi.

fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tsb.

atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah

terpresipitasi. mungkin ilustrasi di bawah ini dapat membantu membayangkan.

5

6

7

PEMISAHAN DAN PEMEKATAN PLASMID

penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa

larut pada keadaan tersebut. etamol absolut dingin --> mengendapkan DNA plasmid dan juga

untuk membilas dan mencuci plasmid. bagaimana bisa etanol mempresipitasi DNA? :

penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. ion-ion seperti

kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. jika di dalam air,

gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA

masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan +pada H dan - pada O). atau dapat

dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. fungsi penembahan pelarut organik seperti

etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tsb. atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+

sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. mungkin ilustrasi di bawah ini dapat

membantu membayangkan................

kira2 yang terjadi di dalam tube ......

etanol 70% --> membersihkan lagi dan lebih memekatkan plasmid hasil setelah dielektroforesis.

http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/isolasi-plasmid-metode-lisis-alkali.html

RESTRIKSI DNA PLASMID

Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai

pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu

organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA

rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat

diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah

pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan

DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi.

Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand

DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi

dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong

dengan enzim restriksi.

Plasmid

Plasmid merupakan DNA sirkuler untai ganda ekstra kromosomal dengan ukuran

bervariasi antara 1 kb sampai lebih dari 200 kb ditemukan pada berbagai spesies bakteri yang

dipakai sebagai unit gen untuk melakukan replikasi (Sambrook et al., 1989).

Plasmid hampir selalu membawa satu gen atau lebih dan sering kali gena tersebut

menyebabkan adanya ciri-ciri penting yang ditunjukkan oleh bakteri tuan rumah (Brown, 2003).

Plasmid membawa tipe gen yang sangat bervariasi fungsinya seperti resisten terhadap antibiotik,

resisten terhadap logam berat, sensitif terhadap mutagen, sensitif atau resisten terhadap

bakteriophage, produksi enzim retriksi, produksi asam amino, produksi toksin, penentu virulensi,

katabolisme molekul organik yang komplek, kemampuan untuk membentuk hubungan simbiosis

dan transfer DNA antar kingdom (Feinbaum, 1998).

Berdasarkan sifat-sifat utama yang dikode oleh plasmid, plasmid dapat diklasifikasikan

menjadi 5 jenis utama:

a. Plasmid fertilitas atau plasmid “F” yang hanya membawa gena tra dan tidak mempunyai sifat

lain kecuali kemampuan untuk melakukan transfer plasmid dengan cara konjugasi.

b. Plasmid resistensi atau plasmid “R” membawa gena yang menyebabkan resistensi bakteri tuan

rumah terhadap satu atau lebih agen antibakteri, seperti kloramfenikol, ampisilin dan merkuri.

c. Plasmid col mengkode kolisin, protein yang dapat membunuh bakteri lain.

d. Plasmid degradatif memungkinkan bakteri untuk mengadakan metabolism molekul yang tidak

biasa, seperti toluen dan asam asetat.

e. Plasmid virulensi menyebabkan patogenitas pada bakteri tuan rumah (Brown, 2003).

Jumlah kopi menunjukkan jumlah molekul plasmid yang biasanya ditemukan dalam satu sel

bakteri. Tiap-tiap plasmid mempunyai jumlah kopi antara 1-50 atau lebih (Brown, 2003).

Berdasarkan jumlah kopi plasmid dapat diklasifikasikan menjadi dua yaitu: High Copy Number

Plasmid dengan jumlah kopi lebih besar dari 20 kopi per sel bakteri dan Low Copy Number

Plasmid dengan jumlah kopi lebih kecil dari 20 kopi per sel bakteri (Feinbaum, 1998).

Kebanyakan plasmid yang berada dalam sel sebagai molekul yang sangat berlilit (supercoiled).

Pelilitan (supercoiling) terjadi karena heliks ganda DNA plasmid sebagian terbuka oleh enzim

yang disebut topoisomerase selama replikasi plasmid. Bentuk berlilit hanya dapat dipertahankan

bila kedua untai polinukleotid dalam keadaan utuh sehinggga disebut DNA sirkuler yang tertutup

secara kovalen (covalently-closed-circular (ccc) DNA). Jika salah satu untai polinukleotid

terputus maka heliks ganda akan kembali ke keadaan normalnya, yaitu berelaksasi, dan plasmid

akan mengambil bentuk alternatif yang disebut sirkuler terbuka (open circular (oc)) (Brown,

2003).

Lebih jelasnya model konformasi DNA tersebut seperti tersaji pada Gambar 2.

Gambar 2. Model Konformasi DNA

Keterangan: Bentuk lingkaran kovalen tertutup dan dua tipe lingkaran nick, tanda

panah menunjukkan adanya torehan/nick. (Adaptasi dari Freifelder,

1983).

Plasmid pUC 19 adalah salah satu vektor plasmid yang sering digunakan dalam biologi

molekuler. Plasmid ini mempunyai besar 2,69 kb, jumlah kopi sekitar 500-7000 dan mempunyai

peta retriksi seperti tersaji pada Gambar 3. Plasmid pUC19 mempunyai berbagai sisi

pemotongan untuk enzim BamHI. Plasmid pUC19 mempunyai gen penanda, yaitu gen penyandi

resisten terhadapampisilin. Gen penanda tersebut akan mengeksploitasi enzim beta-laktamase ke

plasma sel bakteri inang. Enzim tersebut akan mengkatalisa hidrolisis cincin

betalaktam,sehinggga menyebabkan bakteri hasil transformasi dengan pUC19menjadi resisten

terhadap ampisilin (Sambrook et al., 1989).

Gambar 3. Peta Restriksi Plasmid pUC19 (Sambrook et al., 1989).

Fuji Lestari, (2008), Uji Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil Fraksi Protein Daun Kucing-Kucingan (Acalipha indica L)

Terhadap pUC 19, Skipsi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhamadiyah Surakarta, Surakarta.

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip

dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.

Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya

gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul

bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula

digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam

metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-

blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang

porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam

nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya

merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat

yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida

dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih

besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut)

yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada

gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-

molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik

sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda

positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk

menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu

panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam

nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium

dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul

sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie"

(Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam

sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar

ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses

pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang

berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang

bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti

bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang

merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan

ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel

yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita

sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap

logaritma ukuran molekul.

Gel poliakrilamid vs gel agarose

1. Gel Poliakrilamid

Lebih effektif untuk pemisahan fragmen DNA antara 5-500bp

Power: ekstrim tinggi

Ukuran perbedaan DNA yang terpisah sampai 1bp

Pembuatannya lebih sulit dibanding gel agarose, karena biasanya digunakan

poliakrilamid dengan resolusi yang tinggi.

Medan gerak secara vertikal dan listriknya konstan.

2. Gel Agarose

Power lebih rendah

Mempunyai laju pemisahan lebih cepat

Dapat memisahkan fragmen DNA antara 100bp – 50kb tergantung dari

konsentrasi gel agarose yang digunakan

Medan gerak biasanya horizontal

Electroforesis migration rate

Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak menembus gel agarose dipengaruhi

oleh beberapa factor utama, sebagai berikut:

1. Ukuran molekul DNA

Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih

cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah laju

terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa.

2. Konsentrasi gel agarose

Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai dengan

konsentrasi dari gel agarose yang digunakan. Rumusnya adalah: log=log-KrT

dimana adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah retardation coefficient,

dan T adalah gel konsentrasi serta adalah electrophoretic mobility DNA.

Tabel 1. konsentrasi gel agarose dan ukuran molekul DNA

No Konsentrasi Gel Agarose (%) Effisiensi range Pemisahan pada DNA linier (kb)

1 0.3 60-5

2 0.6 20-1

3 0.7 10-0.8

4 0.9 7-0.5

5 1.2 6-0.4

6 1.5 4-0.2

7 2.0 3-0.1

3. Konformasi DNA

Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu bahwa ada

3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III).

Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel

elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:

terutama konsentrasi gel agarose

kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan

densitas kembaran superheliks pada bentuk I

pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III

tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat, pengikatan

DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh untuk bentuk I

konsentrasi EtBr kritis antara 0.1g/ml-0.5l/mg

4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris

Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya untuk DNA

2kb pada gel agarose bergerak 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA 50-

100kb bergerak dengan laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan

pergerakan DNA akan berubah juga.

5. Komposisi basa DNA atau temperature

Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh, mobilitas DNA stabil

pada temp. 4-30C. Dan elektroforesis gel agarose dilakukan pada suhu kamar

6. Keberadaan pewarna DNA

Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen untuk deteksi asam

nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi

mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA 1ng dapat dideteksi secara

langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan

untuk mendeteksi single- atau double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun,

affinity dari EtBr-dye ini untuk single-stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran

fluorensen minimum. PERHATIAN! EtBr ini powerful mutagen, pengguna harus selalu

memakai sarung tangan pada saat bekerja, dan lindungi mata anda dengan kaca pelindung

pada saat mengamati di atas UV-transilluminator.

7. Konposisi buffer elektroforesis

Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk

pembuatan gel agarose. Missal:

Tris-acetate; umu dipakai untuk preparative, kemampuannya paling rendah, tetapi efektif

untuk isolasi DNA dari gel agarose baik elektroelusi maupun gel ekstraksi.

Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA dari agarose kurang

effektif, karena ada interaksi dengan agarose.

Gambar 1. Peralatan elektroforesis dari iMupid (Japan). A. Gel tray, B. Cara mencetak gel agarose. C. Peralatan

lengkap untuk running elektroforesis (dengan/tanpa ditambah power supply).

A BC

Gambar 2. Laju migrasi gel elektroforesis. Disampingnya adalah hasil elektroforesis DNA pada gel agarose dengan

DNA ladder sebagai markernya.

Gambar 3. Konsentrasi gel agarose dan hasil separasi dari marker DNA.

Acuan: Maniatis T et al, 1982-Molecular cloning : A Laboratory Manual. CSH.

TRANSFORMASI

Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri

misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil transforman akan berubah karena

mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA

ini biasanya dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid.

Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat

kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah, sehingga diperlukan

metode untuk membedakan antara sel transforman dan sel nontransforman. Sel transforman

adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah sel yang

tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi

yang disisipkan pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru

pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman.

Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium padat,

sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik

karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah

koloni yang berasal dari bakteri transforman saja.

http://joelnaga.blogspot.com/2009/12/pembuatan-sel-kompeten-dan-transformasi.html

HASIL PRAKTIKUM

Hasil dari elektroforesis selama 45 menit dengan tegangan 90 volt dilihat dengan sinar UV:

TUJUAN

Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid

BAHAN DAN ALAT

1. E. coli JM109 yang di dalamnya terdapat plasmid pUC19

2. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair

3. Ampisilin

4. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)

5. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)

6. Tabung mikrosentrifuga

7. Sarung tangan

8. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

9. Lemari pendingin

10. Kamera Digital

CARA KERJA

DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA).

1. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan

diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC

selama 16 jam (semalam).

2. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung

mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5

menit.

3. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x

g selama 5 menit.

4. Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen.

5. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik

sebanyak 4-6 kali.

6. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru.

7. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga

warna suspensi kembali seperti warna awal.

8. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm

(17,900 x g) selama 10 menit.

9. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang

dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000

rpm (17,900 x g) selama satu menit.

10. Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke

dalam tabung mikrosentrifuga.

11. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000

rpm selama satu menit.

12. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang, dan ke dalam QIAprep spin column

ditambahkan kembali 750 μl buffer PE, dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000

rpm selama satu menit.

13. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk

menghilangkan sisa buffer pencuci.

14. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml baru dan ditambah

dengan 50 μl buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm

selama satu menit (elusi pertama).

15. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang lain dan ditambah

dengan 50 μl buffer EB. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi

pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua).

HASIL

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang

terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada

umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi

sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa

genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang

diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk

komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.

Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini

preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar

(100-200µg) dinamakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar

dari 200 µg.

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua

organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal

(plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel,

organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling

lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang

paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA

memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis.

DNA kromosom dan DNA plasmid dapat merenaturasi dengan membutuhkan lama

waktu yang berbeda. Tahapan yang harus dilalui selama proses ini adalah resuspention, lysis,

neutralization, dan clearing of lysate. Pada tahap resuspensi, pellet sel hasil dentrifuge

diresuspensikan dalam buffer STE (Saline Tris EDTA) pH 8. Adanya EDTA ini berfungsi

sebagai pengkelat magnesium kalsium yang berperan dalam menjaga stabilitas membran plasma.

Selain itu EDTA juga menghambat DNAse sehingga molekul DNA tidak terdenaturasi. Tris

Saline menjaga pH larutan sehingga DNA tetap stabil. Tahap lysis tetap menggunakan pelet hasil

sentrifuge pada tahap sebelumnya. Pellet ini diresuspensikan ke dalam buffer lisis yang terdiri

dari: SDS 10% untuk menghancurkan membran sel dan denaturasi protein, NaOH untuk

mendenaturasi DNA dan mulai menghidrolisis RNA, enzim lisosim menghancurkan dinding sel

bakteri, dan larutan glukosa untuk meningkatkan tekanan osmotik di luar sel yang mampu

membantu proses pelisisan. DNA plasmid dan DNA kromosomal akan terdenaturasi dengan cara

yang berbeda dengan menggunakan NaOH, karena plasmid berbentuk sirkuler maka setelah

mengalami denaturasi bentuknya akan tetap utuh. DNA kromosomal yang berbentuk linier akan

segera kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi. Selanjutnya adalah tahap neutralizer, dengan

menambahkan larutan penetralisir yang berisi kalium asetat dan asam asetat pada pH 5.

Kegunaan dari asam asetat adalah untuk menetralkan pH sehingga pH tidak basa dan DNA bisa

renaturasi.

Penambahan kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid, mengendapnya single

stranded DNA karena molekulnyayang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar

garam tinggi, pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan mudah terbuang.

Yang perlu diperhatikan pada tahap ini adalah proses renaturasi pada DNA plasmid lebih cepat

daripada renaturasi dari DNA kromosomal. Selain itu pada saat penambahan larutan lisis ini

sebaiknya tidak digunakan vortex atau sentrifugasi yang berlebihan karena akan ikut

menyebabkan DNA kromosomal menjadi lebih kecil sehingga akan terlarut pada supernatant.

Kemudian masuk ke tahap clearing of lysates, pada tahap ini diperoleh supernatant yang berisi

DNA plasmid. Penambahan etanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena

perbedaan polaritas, etanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid

yang mengendap. Selanjutnya untuk menghilangkan pengotor yang masih ada ditambahkan

etanol 70% sehingga sisa etanol yang tersisa dapat diuapkan dengan evaporasi. Plasmid yang

didapatkan berupa pellet dilarutkan kembali dengan ddH2O sehingga dapat dilakukan analisis

lebih lanjut dengan menggunakan elektroforesis.

ACARA II.

RESTRIKSI DNA PLASMID

LANDASAN TEORI

Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai

pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu

organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA

rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat

diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah

pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan

DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi.

Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand

DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi

dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong

dengan enzim restriksi.

TUJUAN

Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid

BAHAN DAN ALAT

1. Plasmid pUC19

2. Enzim restriski (PstI)

3. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)

4. Tabung mikrosentrifuga

5. Sarung tangan

6. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

7. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

8. termometer

9. Lemari pendingin (Frezer)

10. Kamera Digital

CARA KERJA

1. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom,

yaitu enzim PstI.

2. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat

terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam

tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml, dengan komposisi Buffer E, BSA, DNA dan PstI

3. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan

hasil optimasi reaksi restriksi. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan

komposisi Buffer E sebanyak 5 µl, BSA sebayak 0,5 µl, DNA pUC19 sebayak 20 µl, dan

PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl.

4. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik.

Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi.

5. Tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C

selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath).

6. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 0C selama 10 menit

menggunakan Water Bath. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi.

7. Larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Frezer.

HASIL

Amatilah hasil pemotongan DNA palsmid dengan melihat visualisasi sampel larutan DNA

plasmid yang diperoleh menggunakan elektroforesis gel agarosa (Acara III.)

DAFTAR REFERENSI

http://karya-ilmiah.um.ac.id/index.php/disertasi/article/view/1045

ACARA III.

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

LANDASAN TEORI

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan

atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain

agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan

ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi

melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin

rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan

memsumuraningkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA

standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di

bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan

larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam

larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

Teknik gel elektroforesis makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun

kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang

terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup

memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi

elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan

untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran

DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.

TUJUAN

Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa

BAHAN DAN ALAT

1. DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII

2. Sampel DNA, misalnya :

a. DNA kromosom bakteri,

b. DNA plasmid hasil isolasi (uncut)

c. DNA plasmid hasil restriksi (cut)

2. Agarosa

3. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH

8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)

4. Akuades

5. Gelas Ukur 1000 ml

6. Labu Erlenmeyer 50 ml

7. Tabung mikrosentrifuga

8. Sarung tangan

9. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

10. Kertas parafilm

11. seperangkat alat elektroforesis

12. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000;

EDTA 120 mM)

13. larutan Etidium Bromid (EtBr)

14. UV transluminator

15. Kaca mata UV

16. kamera digital

CARA KERJA

No. Keterangan Gambar

1. Untuk membuat 20 ml larutan agarosa 1%,

timbang 0,2 g agarosa (sudah disiapkan

asisten)

2. Tambahkan TAE (1X) sampai volume 20

mL

3. Didihkan agarosa sampai larut dan terlihat

jernih.

4. Biarkan larutan agarosa mendingin (55ºC)

dan tambahkan 1 uL etidium bromida (10

mg/ml) sebelum larutan agarosa dituang ke

dalam pencetak gel

5. Siapkan pencetak gel dengan menyelotip ke

dua ujung pencetak gel dan menempatkan

sisir pada salah ujung pencetak gel

6. Tuangkan larutan agarosa ke dalam

pencetak gel.

7. Setelah gel memadat, pindahkankan gel

agarosa beserta pencetak gel ke dalam

tangki elektroforesis.

Sebelum dipindahkan ke tangki

elekstroforesis, selotip pada kedua

ujung pencetak gel dilepas terlebih

dahulu

8. Masukkan 10 µL sampel DNA yang telah

dicampur dengan 2 uL loading dye (6X) ke

dalam sumur (well) gel agarosa

9. Elektroforesis pada 70 Volt sampai penanda

warna (biru) bermigrasi di atas gel agarose

bagian bawah.

10. Setelah elektroforesis selasai, letakkan gel

agarosa di atas UV transillumitor dan tutup

kaca pelindung dan amati pita DNA

11. Dokumentasikan pita DNA yang tampak

menggunakan kamera .

HASIL

Gambarlah pita-pita dna hasil elektroforesis dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya.

Perkirakan ukuran masing-masing fragmen/pita dengan memsumuraningkannya dengan posisi

migrasi pada DNA marker.

Keterangan:

1 = Marka (λ/hind III)

2 = K1 (pUC + HindIII)

3 = K2 (pUC + E. Cory I)

4 = K3 (pUC + Pst I)

5 = K4 (pUC + E. Cory I)

6 = A1 (pUC + E Cory I)

7 = A2 (pUC + Pst I)

8 = A3 (pUC + HindIII)

9 = A4 (pUC)

10 = K1 (pUC hasil isolasi)

11 = K2 (pUC hasil isolasi)

base pairs (bp)

distance(mm) log 10 bpdistance unknow

m*distance y valueunknow bp

value

23130 13 4.364176 36 -0.972 3.711 5140.4365169416 25 3.973866 35 -0.945 3.738 5470.1596296557 30 3.816705 33 -0.891 3.792 6194.4107514361 40 3.639586 35 -0.945 3.738 5470.159629

43 -1.161 3.522 3326.59553332 -0.864 3.819 6591.73895235 -0.945 3.738 5470.15962944 -1.188 3.495 3126.07936745 -1.215 3.468 2937.64965243 -1.161 3.522 3326.595533

Elektroforesis dapat digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan

menggunakan DNA marker yang sudah diketahui ukurannya. DNA marker ini

berfungsi sebagai pemsumuraning sehingga bisa diketahui perkiraan ukuran DNA

sampel. Beberapa hal yang dapat mempengaruhi hasil elektroforesis adalah jumlah

DNA di dalam sampel dan kecepatan migrasi DNA yang dipengaruhi oleh ukuran

DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, tegangan arus listrik, arah medan listrik,

temperatur, keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan komposisi buffer

elektroforesis

Berdasarkan hasil praktikum tersebut persamaan regresi logaritmik yang digunakan

untuk DNA marker data yang diperoleh: y = -0,027x+4,683; R2 = 0,977 Persamaan

logaritmik menghasilkan nilai R2 yang paling mendekati 1. Dengan menggunakan

persamaan ini dapat ditentukan ukuran DNA sampel berdasarkan jarak migrasinya:

NO SUMURAN distance unknow unknow bp value 1. Marka (DNA λ/Hind III)2. K1 (pUC + HindIII) 36 5140.4365163. K2 (pUC + E. Cory I) 35 5470.1596294. K3 (pUC + Pst I) 33 6194.4107515. K4 (pUC + E. Cory I) 35 5470.1596296. A1 (pUC + E Cory I) 43 3326.5955337. A2 (pUC + Pst I) 32 6591.7389528. A3 (pUC + HindIII) 35 5470.1596299. A4 (pUC) 44 3126.07936710. K1 (pUC hasil isolasi) 45 2937.64965211. K2 (pUC hasil isolasi) 43 3326.595533

Hasil praktikum menunjukkan adanya kesingkronan dengan ukuran dan jarak

migrasi DNA marker. Namun ada yang menunjukkan kejanggalan yaitu pada

sumuran ke 10 pita DNA tidak jelas sehingga tidak dapat di pengukuran dan

perhitungan jarak migrasi dari DNA kurang tepat. Hal ini dimungkinkan saat

meletakkan DNA pUc hasil isolasi tidak berada tepat pada sumuran sehingga hasil

elektroforesisnya tidak terlihat dengan jelas. Selain itu yang menyebabkan

kejanggalan ini adalah perhitungan jarak migrasi dari DNA marker yang kurang tepat

karena adanya pita smear atau pita yang tertumpuk sehingga sulit untuk diketahui

jarak migrasi pastinya.). Migrasi DNA saat elektroforesis tergantung pada ukuran dan

bentuk DNA maka bentuk dari DNA sampel dapat diperkirakan berdasarkan jarak

migrasinya. Untuk plasmid yang sama diperoleh lebih dari satu ukuran karena adanya

DNA lain, seperti DNA kromosomal dan DNA mitokondria yang bisa saja terikut

dalam elektroforesis selain DNA plasmid sehingga diperoleh berbegai macam ukuran

DNA. Bentuk DNA plasmid yang diperoleh juga bervariasi, kemungkinan

penyebabnya adalah proses renaturasi plasmid yang tidak sempurna sehingga tidak

dapat berbentuk sirkular seperti normalnya atau bahkan plasmid tersebut terdenaturasi

karena goncangan yang terlalu kencang saat proses isolasi. Hampir semua sumuran

menunjukkan adanya RNA karena sumuran yang ditunjukkan berupa smear

dan kurang jelas yang merupakan ciri dari RNA saat elektroforesis. Hanya pita

no 5 dan 8 saja yang terlihat jelas tanpa adanya smear. Bentuk DNA (plasmid)

yang paling cepat termigrasikan menuju kutub positif adalah DNA dengan bentuk

supercoiled. Disusul oleh DNA plasmid bentuk supercoiled terdenaturasi, relaxed

circular, linear, dan nicked open circular. Hal yang dapat menyebabkan

tertumpuknya sumuran ini beragam, mulai dari DNA sampel itu sendiri serta proses

elektroforesis yang dilakukan. DNA plasmid yang digunakan untuk proses

elektroforesis ini tidak dapat dijamin 100% kemurniannya karena selain DNA plasmid

dalam bakeri juga terdapat DNA lain yang mungkin saja terikut, misalnya, pada

proses penetralan jika sentrifugasi dan pengocokan dilakukan berlebihan atau terlalu

kuat maka DNA kromosomal dapat terlarut dalam supernatant bersama DNA plasmid

yang digunakan untuk tahap selanjutnya. Dalam proses elektroforesis itu sendiri

banyak hal yang mempengaruhi migrasi DNA, yaitu: ukuran DNA, konsentrasi

agarosa, konformasi DNA, tegangan arus listrik, arah medan listrik, temperatur,

keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan komposisi buffer elektroforesis.

DAFTAR REFERENSI

http://www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler/

http://www.docstoc.com/docs/16225344/isolasi-plasmid

ACARA IV.

TRANSFORMASI

LANDASAN TEORI

Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang

bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil transforman akan berubah

karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut.

Molekul DNA ini biasanya dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid.

BAHAN ADAN ALAT

1. strain E. coli JM 109

2. media LB cair

3. media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin

4. media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG

5. es batu

6. shaker-incubator

7. termometer

8. Tabung mikrosentrifuga

9. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

10. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)

11. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

12. jarum ose

13. batang drugalsky

14. cawan Petri

15. Erlenmeyer

16. shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico, Ltd.)

17. kamera digital.

CARA KERJA

1. Kultur semalam strain E. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan

cara memindahkan satu koloni strain E. coli JM 109 ke media LB cair. Inkubasi di

dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama

16 jam (semalam).

2. Pindahkan kultur E. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml

dengan cara mengambil 250 μl kultur E. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25

ml, atau dengan kata lain persumuraningan antara volume media dan volume

kultur 10:1, kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan

kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC.

3. Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam

tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g

selama 5 menit.

4. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl

CaCl2 dingin, diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g

selama 5 menit.

5. Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl

CaCl2 dingin, diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat

lima tabung mikrosentrifuga, dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya

untuk inkubasi 16 jam.

6. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl

sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid

pUC19 sirkuler, sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid.

7. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi

kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera

dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.

8. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10

menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC

dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam.

9. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan

LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada

tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. Inkubasi

dilakukan selama 16 jam pada suhu 37oC.

10. Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang

masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, ditambahkan 10 μl vektor pUC19

sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3), 2 μl vektor

pUC19 rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung

nomor 5).

11. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit

dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera

dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.

12. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml,

dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu

37oC.

13. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl

X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp, lalu diinkubasi pada suhu 37oC

selama lebih kurang 30 menit.

14. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan

LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl.

15. Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl, dan kemudian ditumbuhkan dengan

cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG.

16. Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media

cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl,

dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC.

17. Untuk cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan

koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya.

18. Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut

Dimana,

Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu)

[pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng)

HASIL

Tahap berikutnya dalam eksperimen pengklonan gen setelah molekul DNA

rekombinan berhasil dikonstruksi adalah memasukkan molekul DNA rekombinan

tersebut ke dalam sel hidup yang disebut sel inang. Sel inang yang paling umum

digunakan adalah Escherichia coli.. Karena sel dalam E.coli tergolong tidak efisien

dalam menyerap DNA. Sel ini memiliki kemampuan alami menyerap DNA asing

yang rendah. Kemampuan sel dalam menyerap DNA dapat ditingkatkan dengan

perlakuan khusus, sehingga sel tersebut menjadi kompeten.

Sel kompeten adalah sel yang dapat menyerap DNA karena telah mendapat

perlakuan fisik maupun kimia. Sel dapat dibuat kompeten melalui perlakuan dengan

garam kalsium klorida (CaCl2). Fungsi penambahan CaCl2 pada pembuatan sel

kompeten mempengaruhi dinding sel dan mungkin berperan dalam pengikatan DNA

pada permukaan sel. Literatur yang sama menyebutkan bahwa penyerapan DNA

secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh perlakuan kejut panas. Sel E.coli yang

kompeten diberi perlakuan kejut panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri.

Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel.

Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi

kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah mengalami perlakuan yang ekstrem.

Pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut

transformasi apabila vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut

transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan plasmid

masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka

yang dibawa oleh plasmid tersebut.

Plasmid pUC 19 adalah salah satu vektor plasmid yang sering digunakan

dalam biologi molekuler. Plasmid ini mempunyai besar 2,69 kb, jumlah kopi sekitar

500-7000 dan mempunyai peta retriksi seperti tersaji pada gambar .

Plasmid pUC19 mempunyai gen penanda, yaitu gen penyandi resisten

terhadap ampisilin. Gen penanda tersebut akan mengeksploitasi enzim beta-laktamase

ke plasma sel bakteri inang. Enzim tersebut akan mengkatalisa hidrolisis cincin

betalaktam, sehinggga menyebabkan bakteri hasil transformasi dengan pUC19

menjadi resisten terhadap ampisilin. Sel inang yang telah mengandung DNA

rekombinan dibiakkan dalam medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni

yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan

sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang

berasal dari bakteri transforman saja.

Hasil praktikum transformasi yang telah dilakukan tersaji dalam plate seperti

berikut:

Hasil tersebut menunjukkan pada pUC yang ditambah LB amphisilin (LB-

Amp), setelah dilakukan penghitungan menghasilkan 274 koloni, sedangkan pada

pUC LB Non-Amp koloni terlalu banyak (TBUD). Pada Non-pUC LB non-Amp

hasilnya juga terdapat banyak koloni (TBUD). Hasil transformasi yang tidak benar

terjadi pada hasil Non-pUC LB-Amp yang seharusnya kosong, namun hasil yang

didapat dari praktikum kita terdapat kontaminan. Hal ini dimungkinkan amphisilin

telah rusak, karena kepanasan, atau mungkin disebabkan karena dalam berkerja

kurang aseptis atau kurang steril. Pada cawan sampel terjadi pertumbuhan bakteri

E.coli transforman yang telah membentuk koloni tunggal. Transformasi antara sel

yang kompeten dapat terjadi saat bakteri ditumbuhkan dalam media dan dapat

menyebabkan kesalahan pada perhitungan laju transformasi. Hal ini dapat diperbaiki

dengan penambahan EDTA pada media seleksi.

Peningkatan efisiensi transformasi dapat dilakukan dengan modifikasi metode

standar CaCl2. Konsentrasi optimum CaCl2 adalah 75 mM. Sel kompeten yang

disimpan dalan -20oC dapat bertahan hingga 7 hari, sementara penyimpanan pada -

70oC dapat bertahan hingga 15 hari. Media LB diganti dengan media SOC yang berisi

tripton, ekstrak ragi, NaCl, MgCl2, MgSO4, dan glukosa. Media ini mendukung

pertumbuhan transforman yang lebih cepat. Sementara itu, pada saat transformasi

dengan plasmid ditambahkan DMSO dan PEG8000. Penambahan ini mampu

meningkatkan efisiensi transformasi antara 100-300 kali lipat.

DAFTAR REFERENSI

http://journal.ui.ac.id/upload/artikel/Transformasi%20fragmen_Mangunwardoyo.pdf

http://afie.staff.uns.ac.id/2008/12/11/transformasi-plasmid-dna-sel-kompeten-metode-

cacl2/

http://etd.eprints.ums.ac.id/2340/1/K100040214.pdf

Lampiran 1. Peta Restriksi DNA pUC19

Lampiran 2. Skema kerja Isolasi DNA Plasmid menggunakan QIAprep Spin

Miniprep Kit (Qiagen, USA)

25 ml LB

E.coli transfor

man pUC19

Inkubasi 370C, shaker

150 rpm, 16

jam

@ 3 ml

Sp dibuan

g+ 1 ml

STEresuspensi

Sentrifugasi5000 rpm,

5'

1

Sp dibuan

g

+ 250 µl Buffer P1Resuspensi (vortex, bolak balik+ 250 µl

Buffer P2Bolak-balik sebentar

Warna

mjd BIR

U

+ 350 µl Buffer N3Bolak-balik sebentarWar

na BIR

U hilan

g

Sentrifugasi

13.000 rpm, 1'

Sp dipinda

h

Cairan dibuan

g

Sentrifugasi5.700xg

(5000 rpm), 5'

+ 500 µl Buffer PB

+ 750 µl Buffer PE

Sentrifugasi

13.000 rpm, 1'

Sentrifugasi

13.000 rpm, 1'

Cairan dibuan

g

Sentrifugasi

13.000 rpm, 5'

Cairan dibuan

g

Sentrifugasi

13.000 rpm, 1'

Kolom pindah

+ 50 µl Buffer EB

Sentrifugasi

13.000 rpm, 1'

DNA

plasmid

Lampiran 3. Skema Kerja Restriksi DNA plasmid

Optimasi reaksi pemotongan DNA (Modifikasi Promega, 2005)

No. Komponen P1 P2 P3

1. ddH2O 22,5 µl 22,5 µl 22,5 µl

2. Buffer E 5 µl 5 µl 5 µl

3. BSA 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl

4. DNA

pUC19 20 µl 20 µl 20 µl

5. PstI 2 µl - -

6. HinfI - 2 µl -

7. HindIII - - 2 µl

Jumlah 50 µl 50 µl 50 µl

1 2 3 4 5 6 7

Spin sebentar, 2”

Ketuk-ketuk

P1 P2 P3

Inaktifasi, suhu 700C dg waterbath, 10 menit

Simpan di frezer

Inkubasi 37 0C, dg Water bath selama 4 jam

Lampiran 4.Skema Keja Pembuatan Gel Agorosa Elektroforesis

Agarosa dilarutkan dalam buffer TAE 1X hingga 20 ml dengan konsentrasi gel agarosa sebesar 1%

Dibuat TAE 1 X 250 ml (5 ml TAE 50Xke dalam 245 ml akuades)

Gel agarosa

Sisir dan selotip dilepas

220 ml TAE 1X di dalam bejana buffer Elektroforesis Gel memadat beserta cetakan

Dimasukkan hingga tenggelam

Dibuat larutan gel agarosa

Dibuat cetakan gel

Dihomogenkan dengan pemanasan hingga mendidih

Kedua ujung ditutup selotip

Sisir elektroforesis dipasang untuk dibuat sumur

Diamkan hingga suhu ±50oC

Ditambah 2 ml etidium bromida

Larutan gel agarosa

Dituang ke dalam cetakan gel

Gel memadat didalam cetakan

Lampiran 5. Skema Kerja Elektroforesis Gel Agarosa

Gambar 1. Gel Agarosa Elektroforesis

Sampel DNA

Dimasukkan ke dalam sumur gel elektroforesis

Arus DC dialirkan dari power supply

Migrasi DNA menuju electrode positif

Dilihat pita DNA pada transiluminator UV

Lampiran 6. Skema Kerja Pembuatan Sel Kompeten E. coli JM 109

Medium LB

OvernightE.coli JM 09

LB 25 ml

Diambil 250 µl

LB cair 25 ml

Inkubasi ± 2 jamShaker incubator 150 rpm

37 0C

Masing-masing1,5 ml

Sentrifugasi5.000 rpm

5 menit

1 2 3 4 5 6

Dibuang supernatannya+ 500 CaCl2 (Vortex)

Sentrifugasi 5.000 rpm, 5 menit

Dibuang supernatannya+ 200 CaCl2 (Vortex)

Inkubasi :esTabung 1 dan 2 selama 2 jamTabung 3, 4 dan5 selama 16 jam

Transformasi

E. coli JM 09 Sel kompeten, gliserolSp

Inkubasi ± 16 jamOvernight

37 0C

Medium LB

Inkubasi ± 16 jamOvernight

Shaker incubator 150 rpm

37 0C

Tabungsentrifuga

Kerja Aseptis

Lampiran 7. Skema Kerja Transformasi E. coli JM 109

Inkubasi 2 jam

1 2

Tabung sentrifuga berisi E.coli JM 09 kompeten inkubasi 2 jam

Simpan di ES

inkubasi pada 37 0C, selama ± 30 menit

Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada medium LB Amp cawan 2A

Simpan di ES selama 20 menit

Heat Shock pada 42 0C, selama 90 detik

Simpan segera di ES selama 10 menit

Ditambahkan LB cair hingga 1 ml (±800 µl)

Shaker inkubator pada 37 0C, selama 1,5 jam 150 rpm

1 2 treatment

Tabung sentrifuga

Sel E. coli Kompeten 200 µl 200 µl

10 µl -pUC 19

Medium LB

1

100 µl 50 µl

Medium LB Amp

Medium LB

2

100 µl 50 µl

Medium LB Amp

PLATING

2

1 2

1A 1B

2A 2B

dibolak balik+ ketuk-ketuk

1 2

Inkubasi 16 jam

Disentrifugasi 5.000 rpm, ± 5 menitSupernatan dibuang, sisakan 100 µl

Inkubasi pada 37 0C, selama ± 30 menit

Dihitung jumlah koloni putih pada cawan 4A untuk diketahui effisiensi transformasinya

Simpan di ES3 4 5

3 4 5 Simpan di ES selama 20 menit

Heat Shock pada 42 0C, selama 90 detik

Simpan segera di ES selama 10 menit

Ditambahkan LB cair hingga 1 ml (±800 µl)

Shaker inkubator pada 37 0C, selama 1,5 jam 150 rpm

pUC 19 rekombinan

Tabung sentrifuga

Sel E. coli Kompeten 200 µl 200 µl 200 µl

- 2 µl -

treatment 3

pUC 19 10µl - -

4 5

mediumLB/Amp/X-Gal/IPTG

3

100 µl

3A

4

4 100 µl

mediumLB/Amp/X-Gal/IPTG

4A

5

50 µl100 µl

mediumLB Amp

Medium LB

5A 5B

dibolak balik+ ketuk-ketuk

3 4 5

Tabung sentrifuga berisi E.coli JM 09 kompeten inkubasi 16 jam

3 4 5 PLATING

Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu)

[pUC 19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng)

Lampiran 8. Media Pertumbuhan Bakteri

1. Media Cawan Agar Luria-Bertani (LB) 100 ml

- Bacto tryptone 1 gram

- Bacto yeast extract 0,5 gram

- NaCl 0,5 gram

- Agar 2 gram

Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian

diautoklaf.

2. Media Cair Luria-Bertani (LB) 100 ml

- Bacto tryptone 1 gram

- Bacto yeast extract 0,5 gram

- NaCl 0,5 gram

Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian

diautoklaf.

3. Media Cawan Agar Luria-Bertani/Ampisilin (LB/Amp) 100 ml

- Bacto tryptone 1 gram

- Bacto yeast extract 0,5 gram

- NaCl 0,5 gram

- Ampisilin (100 μg/ml) 100 μl

- Agar 2 gram

Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian

diautoklaf.

4. Media Cair Luria-Bertani/Ampisilin (LB/Amp) 100 ml

- Bacto tryptone 1 gram

- Bacto yeast extract 0,5 gram

- NaCl 0,5 gram

- Ampisilin (100 μg/ml) 100 μl

Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian

diautoklaf.

5. Media Cawan Agar LB/Amp/X-Gal/IPTG

Buat media agar LB/Amp seperti diatas, kemudian ditambahkan 100 μl IPTG 100

mM dan 50 μl X-Gal 50 mg/ml. Ratakan dengan cara dispread hingga kering,

inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit sebelum digunakan.

Komposisi Bufer dan Larutan

1. TAE bufer 50X (Annymous, http://www.6mgel.com/50x_tae_buffer_1_liter.htm)

- Tris-base 242 g

- Glacial acetic acid 57,1 g

- EDTA 0,5 M pH 8,0 100 ml

Semua komponen dilarutkan ke dalam akuades secukupnya, kemudian tambahkan

HCl untuk menentukan pH 7,6-7,8. Tera dengan akuades hingga volume akhir

1000 ml. Dapat disimpan pada suhu ruang.

2. Loading buffer 6X (Anonymous, http://www.bioron.net/products/dna-and-dna-

markers/loading-buffer/)

- Bromophenol blue 0,25%

- Xylene cyanol 0,25%

- Ficoll tipe 400 15%

- EDTA 120 mM

Semua komponen dilarutkan hingga homogen. Dapat disimpan pada suhu ruang.

3. Larutan stok IPTG (0,1 M) (Promega, 2003)

- IPTG 1,2 g

Tambahkan air sampai volume akhir 50 ml. Sterilisasi secara filtrasi kemudian

simpan pada 4o C.

4. Larutan X-Gal (2 ml) (Promega, 2003)

- 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 100 mg

Larutkan dalam 2 ml N,N'-dimethyl-formamide. Tutup dengan aluminium foil

kemudian simpan dalam -20o C.