laporan praktikum biologi sel

19
LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL FRAKSIONASI DAN ANALISA KOMPONEN SELULER Nama : Febby Nurdiya Ningsih NIM : 125090100111016 Kelompok : 4 Asisten PJ : Galuh Wening Permata Sari Tanggal : 9 Oktober 2013

Upload: febby-nurdiya-navriasa

Post on 25-Oct-2015

926 views

Category:

Documents


93 download

TRANSCRIPT

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SELFRAKSIONASI DAN ANALISA KOMPONEN SELULER

Nama : Febby Nurdiya NingsihNIM : 125090100111016Kelompok : 4Asisten PJ : Galuh Wening Permata SariTanggal : 9 Oktober 2013

LABORATORIUM FISIOLOGI TUMBUHAN DAN MIKROTEKNIKJURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

FRACTIONATION AND CELLULAR COMPONENT ANALYZE Febby Nurdiya Ningsih

Biology Department, Faculty Of Matemathic And Natural Science, Brawijaya University

ABSTRACT

Fractionation of cell is a method to study about cell and it’s body of cell.The aim of this practice is separating subcelluler component by centrifugation.Practical uses of materials namely red beans, tetrazolium, sucrose, iodine and the tools used are sentrifuge, polypropilene tube, glass objects, water bath, sentrifugator, net, mortar and microscopes. The centrifugation method used, iodine test, and the tetrazolium test. Homogenation include, filtration, centrifugation 1000 rpm in 5 minutes, 2000 rpm in 10 minutes and 4000 rpm in 20 minutes. Iodine test is used to know existence of the starch in the cell while the tetrazolium used to know the mitochondria within cells. The tetrazolium test results show negative response. But in iodine test result that amilum was existence. Failure in tetrazolium test cause of wrong technique and trouble in sentrifugator.

Keyword: centrifugation, fractinonation, iodin, result, tetrazolium, Amilum, mitochodrial

FRACTIONATION AND CELLULAR COMPONENT ANALYZE Fakhisa, E., Febby, N., Ivakhul, A., Noviana D.L., Priska, Ristianadewi., Zulfah

Biology Department, Faculty Of Matemathic And Natural Science, Brawijaya University

ABSTRACT

Fractionation of cell is a method to observe and study about cell and it’s body of cell. The aim of this practice is separating subcelluler component by centrifugation. Centrifugation is one separation technique based on the size and density. Practical uses of materials namely read beans, tetrazolium, sucrose, iodine and the tools used are sentrifus, muslin tube, glass objects, water bath, sentrifus, mortar, test tubes and microscopes. The centrifugation method used, iodine test, and test the tetrazolium. Homogenation include, filtration, centrifugation and 1000 rpm in 5 minutes, 2000 rpm in 10 minutes and 4000 rpm in 20 minutes. Iodine test is used to know the starch in the cell while the tetrazolium used to know the mitochondria within cells. Based on the result, iodine test give a positive result to sample p-2 and p-3, but unfortunately tetrazolium test result give a negative result.This Failure happen because of wrong technique.

Keyword: centrifugation, fractinonation, iodin, tetrazolium, Amilum, mitochodrial

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Dasar Teori

Sel memiliki berbagai macam komponen. Sel sendiri berdasarkan komponennya dibagi menjadi sel prokariotik dan sel eukariotik. Pada hewan dan tumbuhan, tersusun atas sel eukariotik. Sel eukariotik sendiri terdiri atas beberapa komponen seluler, yang diantaranya adalah nucleus, mitokondria, apparatus golgi, dan sebagainya. Untuk mengetahui keberadaan komponen-komponen sel, terkadang kita perlu melakukan suatu metode tertentu untuk mengamati dan menganalisis komponen seluler tersebut. Dalam

mengamati dan menganalisis komponen seluler, ada beberapa metode yang salah satunya adalah metode fraksinasi.

Gambar 1. Diagram alir dari salah satu contoh proses fraksinasi(Oxford University, 2002)

Fraksinasi sel merupakan suatu kombinasi metode untuk memisahkan organel-organel sel dan komponen-komponen sel yang lainnya. Terdapat dua fase fraksinasi sel, yakni homogenisasi dan isolasi. Pada tahap awal, pra-homogenisasi, membrane sel atau dinding sel perlu dirusak terlebih dahulu untuk mempermudah proses homogenisasi (Johnson et al., 2002)

Homogenisasi merupakan proses pemisahan organel dari selnya dengan cara merusak dan membuka sel. Kerusakan pada sel ini terjadi karena pemberian suatu zat kimia, enzim atau karena gelombang suara. Namun beberapa peneliti juga terkadang menghomogenisasi sel dengan cara memaksa sel melalui suatu celah berukuran lebih kecil dengan tekanan yang amat tinggi sehingga sel menjadi rusak (LTAING, 2005).

Sedangkan fase isolasi merupakan pemisahan organel sel berdasarkan ukurannya. Fase ini dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, baik dengan cara kimiawi maupun fisika, seperti sedimentasi gravitasi atau pengendapan, penyaringan sederhana dan sentrifugasi. Namun kebanyakan cara yang digunakan adalah sentrifugasi (Heidcamp, 2013).

Sentrifugasi merupakan cara untuk mempercepat proses pemisahan komponen berdasarkan pada ukuran dan densitas tiap komponen dengan memanfaatkan kecepatan rotasi. Jadi, sampel yang telah dihomogenisasi dimasukkan ke dalam suatu alat yang

dapat berputar dengan kecepatan tertentu dengan bantuan sebuah rotor. Proses ini membutuhkan waktu yang lebih singkat daripada proses sedimentasi biasa. Proses sentrifugasi memanfaatkan gaya gravitasi bumi dan kecepatan. Ada dua jenis sentrifugasi, yakni differential centrifugation dan ultracentrifugation. Namun pada umumnya yang digunakan adalah differential centrifugation (Gallik, 2011).

Differential centrifugation memisahkan komponen seluler berdasarkan laju sedimentasi dan berdasarkan pada ukuran dan bentuk tiap komponen. Pada differential centrifugation, tiap-tiap stepnya menghasilkan produk berupa pellet, yang merupakan komponen seluler dengan ukuran dan densitas tertentu yang mengendap lebih dahulu. Sedangkan cairan jenuh diatas pellet adalah supernatant, yang merupakan campuran komponen yang memiliki ukuran dan densitas lebih kecil daripada pellet. Pellet bisa menjadi hasil isolasi yang dibutuhkan. Jika pellet yang didapat belum sesuai dengan kebutuhan, maka supernatant yang ada disentrifugasi kembali dengan kecepatan yang berbeda dari sebelumnya. Organel yang biasanya berhasil terisolasi dalam proses ini adalah mitokondria, nukleus, kloroplas, dll (Alberts et al., 2009).

Gambar 2. Metode Differential centrifugation(Alberts et al, 2009)

Metode fraksinasi sering kali digunakan dalam analisis-analisis mikrobiologi yang dibutuhkan dalam bidang pangan, industri, maupun medis. Metode ini dikenal sebagai metode yang akurat dan rinci dalam menunjukkan proses biokimia dan data kuantitatif dari suatu mikroorganisme, termasuk data perkembangan suatu virus (Fisher et al., 1966).

1.2. Tujuan

Praktikum dengan topik berjudul “Fraksionasi dan Analisa Komponen Seluler” dilakukan dengan tujuan memisahkan komponen seluler tumbuhan berdasarkan ukurannya dengan sentrifugasi.

BAB IIMETODE

2.1. Alat dan Bahan

Dalam praktikum ini, alat dan bahan yang digunakan adalah tabung sentrifus (tabung polipropilene), kain kasa, objek + cover gelas, water bath, sentrifus, mortal dan alu, tabung reaksi, mikroskop cahaya, biji kacang merah (Paseolus vulgaris) tetrazolium chloride 0,05%, sukrosa-bufer solution dan iodin.

2.2. Prosedur

Dalam praktikum ini, terdapat beberapa tahapan kerja yakni homogenasi, filtrasi, sentrifugasi, pengamatan komponen sel hasil fraksinasi menggunakan mikroskop dan pengamatan komponen sel hasil fraksinasi menggunakan tetrazolium. Pada tahap awal, yakni homogenasi, dengan cara menggerus 5 butir kacang merah dengan mortar dan alu. Setelah itu ditambah dengan sucrose-buffer solution sebanyak 10 ml. Hasil homogenasi tersebut dinamakan homogenat.

Setelah dihomogenasi, homogenat tersebut difiltrasi dengan kain kasa sebanyak 1 lapis. Hasil filtrasi tersebut berupa cairan dan disebut filtrat, sedangkan substan yang tertahan di kain kasa adalah residu.

Setelah difiltrasi, filtrat yang dihasilkan dituang ke dalam tabung polipropilen kemudian ditambah lagi dengan sucrose-buffer solution hingga 5 ml. kemudian ditimbang terlebih dahulu dengan neraca digital. setelah ditimbang dan diketahui massanya, disentrifugasi dengan kecepatan rendah (1000 rpm) selama 5 menit. Setrifugasi ini menghasilkan padatan di dasar tabung sentrifus yang dinamakan pellet p-1, dan menghasilkan cairan jenuh diatas pellet, yakni supernatan s-1. Supernatan s-1 dipipet dengan perlahan dan dipindahkan ke tabung sentrifus yang baru. sedangkan p-1 dibuang. Lalu s-1 yang sudah dipindahkan ke tabung polipropilen baru ditimbang dengan neraca digital lalu di tambahi dengan sucrose-buffer solution lagi hingga volume totalnya 10 ml. setelah itu kembali disentrifus dengan kecepatan yang lebih tinggi dari sebelumnya (2000 rpm) selama 10 menit. Hasil sentrifus kedua ini adalah pellet p-2 dan supernatant s-2.

s-2 dan p-2 dipisahkan dengan cara memipet s-2 dan memindahkannya ke tabung polipropilen baru. s-2 ditimbang kembali dengan neraca digital dan ditambahi sucrose-buffer solution hingga volume totalnya mencapai 10 ml. Setelah itu disentrifus kembali dengan kecepatan 4000 rpm selama 20’. p-2 diambil sedikit sampel yang kemudian di oleskan (smear) di atas kaca objek. setelah itu ditetesi dengan iodin dan ditutup dengan cover glass. Preparat tersebut diamati di mikroskop perbesaran 100x kemudian ditingkatkan menjadi 400x.

Setelah s-2 selesai disentrifus selama 20 menit, didapatkan supernatant 3 dan pellet 3. Supernatan 3 dipisahkan dari pellet 3. Kemudian pellet 3 di diambil sedikit dan dioleskan di atas kaca objek. Setelah itu ditetesi dengan iodin dan ditutup dengan cover glass. Preparat tersebut kemudian diamati dengan mikroskop perbesaran 100x dan 400x.

Masing-masing sisa dari pellet 2 dan pellet 3, diambil sampel sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung A (untuk p-2) dan tabung B (untuk p-3). Masing-masing dari tabung, ditambahi dengan tetrazolium chloride dengan perlahan melalui sisi dinding (tidak perlu dikocok). Kedua tabung tersebut kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37-40 0C. setelah diinkubasi, diamati perubahan apa yang terjadi kemudian dicatat dalam buku pengamatan.

BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. Analisa ProsedurDalam praktikum ini, terdapat berbagai macam alat dan bahan yang

digunakan. Masing-masing alat dan bahan memiliki fungsi tersendiri. Tabung polipropilen memiliki fungsi sebagai wadah untuk menampung filtrate maupun supernatant yang akan disentrifus. Tabung ini digunakan karena bahannya yang tidak mudah pecah dan tidak mudah leleh ketika berada dalam suhu panas. Mengingat pada saat proses sentrifus, terjadi rotasi yang amat cepat dan menghasilkan panas pada sentrifus biasa, sehingga dibutuhkan jenis tabung yang sesuai dengan kondisi pada saat sentrifus berlangsung (Physorg. 2008)

Kain kasa memiliki fungsi yakni untuk menyaring homogenate sehingga filtratnya terpisah dari residu. Objek dan cover glass merupakan seperangkat alat untuk membuat preparat dari sampel pellet agar dapat diamati dengan mikroskop. Waterbath berfungsi untuk menginkubasi sampel dengan suhu yang terkontrol. Inkubasi dilakukan untuk mempercepat reaksi. Sentrifugator merupakan alat penting yang berfungsi untuk memisahkan organel-organel atau substansi sesuai dengan ukuran dan densitasnya. Mortal dan alu digunakan untuk membantu proses

homogenasi bahan agar bentuknya menjadi lebih sederhana dan halus sehingga mudah untuk diambil filtratnya. Untuk mengamati dan membuktikan keberadaan suatu organel, digunakan pula mikroskop cahaya. Dengan menggunakan mikroskop, maka organel-organel yang menjadi target pengamatan dapat diamati keberadaannya.

Pada praktikum ini, bahan utam yang digunakan adalah kacang merah (Phaseolus vulgaris). Selain bahan utama, terdapat juga bahan-bahan pendukung seperti larutan tetrazolium chloride 0,05%, sucrose-buffer solution dan larutan Iodin. Alasan mengapa kacang merah digunakan dalam praktikum ini adalah karena uji yang pernah dilakukan sebelumnya, kacang merah memiliki tingkat keberhasilan paling tinggi dibandingkan dengan bahan lain. Maksudnya, penemuan organelnya paling mudah daripada yang lainnya. Selain itu, di dalam kacang mengandung banyak mitokondria dibadingkan dengan bagian tanaman lainnya. Pada uji ini iodin berperan sebagai indikator keberadaan amilum. Hal tersebut dikarenakan suatu substan akan menunjukkan keberadaan amilum ketika direaksikan dengan iodin, yang ditandai dengan munculnya warna ungu tua hingga hitam. Sedangkan sucrose-buffer solution berguna untuk menjaga kondisi fisiologis organel agar tetap bertahan seperti semula meskipun melalui berbagai macam proses, seperti sentrifugasi.

Tetrazolium chloride berfungsin sebagai indikator reaksi redox. Sehingga tetrazolium sering digunakan untuk indikasi ada tidaknya proses respirasi seluler yang berlangsung. Tidak hanya respirasi, tetrazolium chloride juga digunakan untuk mengetahui ada tidaknya proses metabolime (Berridge, 2005)

Ada banyak perlakuan yang dilakukan dalam praktikum kali ini. Perlakuan pertama adalah penggerusan pada kacang merah. Penggerusan dilakukan dengan maksud untuk memecah sel dan merusak dinding sel. Setelah digerus, hasil gerusan ditambah dengan sucrose-buffer solution yang bertujuan untuk menjaga kondisi fisiologis sel dan organel-organelnya. Kemudian dilakukan penyaringan yang fungsinya untuk memisahkan residu dan filtrat. Filtrat dipindahkan ke tabung polipropilen baru dan ditimbang dengan neraca digtal. Penimbangan ini bertujuan untuk mengetahu massa dari filtrate yang didapatkan. Setelah ditimbang, disentrifus selamat 5 menit dengan kecepatan 1000 rpm. Setrifugasi berfungsi untuk memisahakan organel-organel berdasarkan ukuran dan densitasnya. Setelah selesai disentrifus, kemudian antara supernatant dan pellet dipisahkan. Supernatan yang telah dipisahakan kemudian diberi perlakuan yang sama, mulai dari penambahan sucrose-buffer solution sampai pemisahan pellet dan supernatant baru. Langkah tersebut terus dilakukan hingga dihasilkan supernatant 3 dan pellet 3. Tiap sentrifugasi, kecepatan dan waktunya dinaikkan dua kali lipat dari sebelumnya. Fungsi sentrifus dengan kecepatan bertingkatnya adalah agar tiap organel tertentu dapat terpisah-pisah sesuai dengan koefisien sedimentasinya. Pada pellet 2 dan pellet 3, diambil sampel untuk dijadikan preparat. Pada preparat tersebut ditetesi iodin sebagai indikator keberadaan amilum. Sehingga pada saat diamati di mikroskop, butir-butir amilumnya akan nampak karena bereaksi dengan iodin.

Selain untuk preparat, masing-masing dari pellet 2 dan 3 diambil sampel sebanyal 1 ml untuk diuji dengan larutan Tetrazolium chloride. Pada saat uji ini, sampel yang sudah diberi tetrazolium chloride perlu diinkubasi dengan suhu 37 0C. Suhu tersebut merupakan suhu optimum pada sel atau organel-organel, dimana belum terjadi lisis. Inkubasi dilakukan dengan tujuan untuk mempercepat reaksi tetrazolium chloride (…)

3.2. Analisa Hasil

3.2.1. Uji IodinPada uji Iodin, dengan melakukan pengamatan pada preparat pellet 2 (p-2)

ditemukan butir-butir amilum yang berbentuk oval berwarna kehitaman. Bulatan-bulatan hitam ini terjadi karena amilum tersebut beraksi positif dengan iodin sehingga memunculkan warna gelap. Butir-butir amilum dapat dilihat pada gambar berikut

Gambar 1. Foto pengamatan butir amilum pada sampel p-2

Berdasarkan pada foto pengamatan tersebut, selain amilum terdapat segerumbulan substan berwana kuning, yang merupakan debris atau kotoran sisa penggerusan (pecahan dinding sel)

Pada pellet 3, yang merupakan hasil sentrifugasi terakhir ternyata masih ditemukan butir-butir amilum. Berikut adalah gambar pengamatan pada sampel p-3 :

Gambar 2. Foto Pengamatan butir amilum pada sampel p-3

Uji iodin merupakan uji yang dilakukan untuk mendeteksi keberadaan amilum. reaksi antara keduanya dapat menghasilkan warna biru kehitaman atau bahkan hitam. hal tersebut dikarenakan unit-unit glukosa dalam amilum membentuk rantai heliks karena adanya ikatan dengan konfigurasi pada tiap unit glukosa (Poedjiadi, 1994).

Jika dibandingkan ukuran amilum yang ditemukan pada p-2 dan pada p-3, lebih besar amilum yang ada di p-2. Amilum yang ditemukan pada p-3 hanya berupa serpihan yan lebih kecil daripada amilum di p-2. Hal ini mengacu pada saat sentrifugasi terjadi proses sedimentasi berdasarkan ukuran dan densitas substan, sehingga amilum yang masih ditemukan di pellet 3 dikarenakan ukurannya yang lebih kecil, sehingga ikut tersedimentasi di p-3 yang merupakan hasil sentrifugasi terakhir.

Ada beberapa faktor yang mempengaruhi keberadaan amilum di pellet 3 yang seharusnya sudah tidak ada amilum, yang diantaranya faktor kesalahan teknis. Pada saat proses sentrifugasi berlangsung, alat sentrifus sempat eror sehingga proses sentrifugasi terhenti dan mengulang dari awal lagi. Sehingga kesalahan ini mengakibatkan sentrifugasinya tidak optimum. Ada faktor lain, yakni pada saat pemisahan pellet 3 dengan supernatant 3, masih terdapat supernatant yang tersisa dan bercampur dengan pellet 3. Selain itu juga, pada saat pengambilan sampel, yang tersedot oleh pipet adalah bagian yang banyak supernatannya.

3.2.2. Uji TetrazoliumBerdasarkan uji tetrazolium chloride pada sampel p-2 dan p-3,

menunjukkan hasil yang negatif. Dimana tidak ditemukan cincin merah yang merupakan indikator keberadaan aktivitas respirasi oleh mitokondria. Kegagalan ini kemungkin disebabkan oleh trouble yang terjadi selama proses sentrifugasi. Proses sentrifugasi sempat terhenti karena terjadi trouble pada sentrifugator. Selain itu juga karena teknik pemisahan supernatant dan pellet yang salah, serta teknik pengambilan sampel untuk preparat.

Jika terdapat mitokondria, akan muncul cincin berwarna merah muda. Cincin yang menandakan keberadaan mitokondria tersebut merupakan hasil reaksi dari tetrazolium dan NAD, yang hanya diproduksi di mitokondria. Tetrazolium tereduksi oleh NAD. NADH merupakan komponen kritis yang sering dihasilkan dari respirasi seluler (Badran, 2013).

Diharapkan pada pelaksanaan praktikum ini dikemudian hari, untuk memerhatikan kondisi alat dan juga lebih berhati-hati dalam melakukan teknik pemisahan dan pemindahan supernatant dengan pellet agar tidak kembali bercampur. Jika hal-hal tersebut terjadi, sangat memungkin kan bahwa kegagalan seperti pada praktikum kali ini akan terulang kembali.

JAWABAN PERTANYAAN

1. Homogenasi untuk pemisahan sel dari jaringan penyusunnya serat pelepasan organel dari selnya

2. Sentrifugasi untuk pemisahan organel sel berdasarkan ukurannya dilakukan dengan beberapa tahap berdsarkan kebutuhannya

3. Perbedaan masa jenis, komponen dengan masa jenis lebih besar akan mengendap lebih cepat daripada partikel yang lebih kecil.

4. Sebab jika dilakukan hanya satu kali sentrufugasi dengan keceptan maksimal maka organel yang memiliki berat jenis besar hingga kecil akan bercampur menjadi satu. Sehingga hal tersebut menyulitkan untuk idenktifikasi.

5. Karena biji tempat terjadinya regenerasi sel yang terdapat pada jaringan meristem dan biji juga mengandung amilum.