Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Selasa, 12 November 2013

Biokimia Waktu : 09:00-10:40 WIB

PJP : Syaefudin,M.si

Asisten : Lusianawati,S.si

Resti Siti Muthmainah,S.si

ISOLASI DNA KROMOSOM

Kelompok 2

Mhd Ali Aman.Siregar J3L112002

Indryani Rahayu Kuswardhani J3L112080

Emilia Anisa J3L112153

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIAPROGRAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2013

Pendahuluan

Isolasi DNA adalah tahap awal dalam mempelajari DNA sequence yang spesifik dengan

populasi DNA yang lengkap, dan dalam analisa struktur gen dan ekspresi gen (Miller 2000).

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana

dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik

secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan

untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan.

DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi (Robinson

1975).

Isolasi DNA kromosom secara umum dibagi atas 3 tahap yaitu pemecahan sel atau

jaringan/sel dilisis untuk membebaskan isinya, ekstrak sel diberi perlakuan untuk menghilangkan

semua komponen kecuali DNA,dan pemekatan larutan DNA yang telah diperoleh (Miller 2000).

Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Pemecahan dinding sel secara

mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil.

Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair

dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang

berisi DNA (Brush 1994). 

Sentrifugasi adalah metode sedimentasi untuk memisahkan partikel-partikel dari suatu

fluida berdasarkan berat jenisnya dengan memberikan gaya sentripetal (Robinson 1975).

Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan sel menjadi organel-organel utama sehingga fungsinya

dapat diketahui (Miller 2000). Substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan

substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Miller 2000). Substansi hasil sentrifugasi

terbagi menjadi dua, yaitu supernatan dan pelet.

Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih

rendah. Posisis dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya lebih jernih. Sementara

pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih tinggi. Posisisnya

berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan warnanya lebih keruh. Sentrifugasi bertujuan

untuk memisahkan sel menjadi organel-organel utama sehingga fungsinya dapat diketahui

(Miller 2000). Sentrifugasi ini biasa digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang

perbedaan densitasnya hingga 0,02 g/mL/ molekul-molekul tersebut seperti molekul protein,

DNA, dan RNA yang densitasnya pada larutan sesium klorida ialah 1.3 g/mL , 1.6-1.7 g/mL, dan

1.75-1.8 g/Ml (Collen et al 1996).

Tujuan

Percobaan bertujuan menunjukan sifat dan struktur DNA memlalui proses isolasi, dan

melatih dalam proses isolasi DNA dengan umbi bawang.

Alat dan Bahan

Alat alat yang digunakan yaitu Pipet mikro,corong pisah, mortar,tabung reaksi,gelas piala

100 mL, pisau, Sentrifus kecepatan tinggi, tabung sentrifius, Penangas air.

Bahan-bahan yang digunakan yaitu Umbi bawang merah, NaCl, Larutan lisis, SDS 10%,

Buffer elusi/buffer TE, dH2O steril, larutan EtOH.

Prosedur percobaan

Pembuatan larutan. Larutan lisis terdiri dari 50 mM Tris HCl, pH 8.0 yang mengandung

50 mM EDTA. Sedangkan larutan elusi atau buffer TE dibuat dari 10 mM Tris-HCl pH 8,0 yang

mengandung 0.1 mM EDTA pH 8.0. Setelah itu, larutan disimpan di pendingin.

Prosedur isolasi DNA kromosom. Sebanyak 25 gram umbi bawang digerus dengan

menggunakan mortar, ditambahkan 40 mL larutan lisis dan 0.5 gram garam dapur digerus

sampai halus. Setelah itu, dituang ke dalam gelas piala 250 mL dan ditambahkan 5 mL larutan

SDS 10%. Larutan dicampur secara homogen dan diinkubasi pada suhu 60°C dalam water bath

selama 20 menit. Hasil inkubasi lalu disaring ke dalam gelas beaker yang ditempatkan diatas es

sehingga larutan tersebut segera menjadi dingin. Setelah larutan menjadi dingin kemudian

ditambahkan 0,5 gram protease, aduk secara sempurna dan biarkan selama 15 menit. Kemudian

larutan dibiarkan 5 menit lalu diambil larutan atas dengan menggunakan pipet tetes dan

dipindahkan ke dalam 4 tabung baru.

EtOH dingin sebanyak 10 mL ditambahkan melalui sisi tabung. Kemudian, tabung

ditempatkan secara perlahan di atas es dan dibiarkan selama 2-5 menit. DNA kromosom akan

mengendap pada bagian atas dari EtOH dan tampak sebagai benang-benang putih. DNA

kromosom diambil dengan pipet tetes secara hati-hati dengan sesedikit mungkin larutan EtOH

yang terambil dan ditempatkan pada 2 tabung eppendorf 1.5 mL. Keempat tabung disentrifugasi

selama 1 menit dengan kecepatan 10.000 atau 13.000 rpm. EtOH dibuang pada lapisan atas

secara hati-hati tanpa merusak pellet dan ditambahkan 1 mL EtOH ke pellet DNA kromosom.

Resuspen pelet DNA kromosom dengan cara vortex dalam 1 mL EtOH dan disentrifugasi

kembali selama 1 menit. EtOH dituang dan DNA kromosom dikeringkan dalam bech selama 10

menit. Setelah kering, buffer TE atau dH2O steril 1 mL untuk melarutkan DNA kromosom. Ukur

absorbansi DNA pada panjang gelombang 260 dan 280 nm dengan spektrofotometri.

Data dan Hasil Percobaan

Tabel 1 Data hasil pengukuran konsentrasi DNA dari umbi bawang

Larutan A 260 A 280 A koreksi

260

A koreksi

280

[DNA] [RNA] [DNA/RNA]

Sampel 1 0.7775 0.7972 0.7775 0.7972 38.875 39.875 0.974

Sampel 2 0.7905 0.7978 0.7905 0.7978 39.750 39.890 0.996

Sampel 3 0.7808 0.7972 0.7808 0.7972 39.040 39.875 0.979

Sampel 4 0.7590 0.7981 0.7590 0.7981 37.950 39.905 0.951

Blanko(TE) 0 0

Contoh perhitungan:

A koreksi = A sampel – A blanko

=0.7775 -0

=0.7775

[DNA] = A 260 x 50 mg/mL

= 0.7775 x 50 mg/mL

= 38.875 mg/mL

[RNA] = A 280 x 50 mg/mL

= 0.7972x 50 mg/mL

= 39.875 mg/mL

Pembahasan

Prinsip isolasi DNA kromosom itu sendiri didasarkan pada pemisahan DNA kromosom

dari pengotor lain berupa protein atau RNA menggunakan teknik sentrifugasi. Secara umum

isolasi DNA kromosom terbagi atas tiga tahapan proses yaitu pemecahan sel atau pelisisan sel,

menghilangkan komponen lain selain DNA kromosom, dan pemekatan larutan DNA yang

diperoleh (David et al. 1983).

Isolasi DNA kromosom merupakan tahap yang paling penting yang harus dilakukan. Hal

ini dikarenakan DNA kromosom merupakan sumber DNA yang umumnya kita kehendaki untuk

diklon yang harus bersih dari pengotor-pengotor seperti protein dan RNA. Sumber DNA dapat

berasal dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia (Brush 1994). 

Isolasi DNA kromosom dilakukan pada umbi bawang merah pada praktikum kali ini.

Penggunaan umbi bawang merah sebagai sumber pengisolasian DNA kromosom disebabkan

umbi bawang memiliki sedikit pati sehingga DNA akan terlihat akan lebih jelas dan mudah

diisolasi (David et al. 1983).

Percobaan ini terlebih dahulu bawang merah diris dengan pisau,hal ini dilakukan agar

memperkecil umbi bawang dan merperluas permukaannya sehingga mempercepat penggerusan.

Setelah itu umbi bawang digerus dengan mortal dan ditambahkan dengan larutan lilis 40 Ml dan

1,5 gram garam dapur. Penambahan larutan lisis yang berfungsi melisis dinding sel,dan

penambahan garam dapur untuk melarutkan DNA pada umbi bawang, kemudian masukkan

ekstrak kedalam gelas piala 250 mL dan di tambahkan larutan SDS 10% sebanyak 5 mL. Hal ini

dilakukan untuk memecahkan dinding sel dengan mengemulsi lipid dan protein merusak

interaksi polar pada membran sel, kemudian larutan di inkubasi dalam water batch pada suhu 60 OC selama 10 menit. Tahapan ini dilakukan untuk mengoptimalkan kerja buffer ekstrak yang

ditambahkan ke dalam sampel, setelah selesai larutan disaring dan ditempatatkan di atas es agr

lebih cepat dingin.

Setelah selesai dingin ditambahkan 0,5 gram NaCl, NaCl ini dapat menyebabkan DNA

menjadi larut karena ion Na+ mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat

DNA yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak menolak satu sama lain

sehingga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA. Hal ini akan

menyebabkan DNA akan terkumpul (Doyle & Doyle 1990).

Biarkan larutan selama 15 menit,dan larutan paling atas dipindahkan pada tabung lain dan

ditambahkan dengan 10 mL larutan EtOH melaluai sisi tabung. Penambahan alkohol dingin pada

ekstrak ekstrak sel melalui dinding tabung akan membentuk gumpalan putih. Etanol dingin

berfungsi dalam pengikatan strand DNA yang telah terkumpul kerena pemekatan oleh garam.

Hal ini karena kerapatan alkohol lebih kecil dibandingkan kerapatan air maka alkohol akan

berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol

akan nampak sebagi benang-benang putih yang terapung di atas filtrat. Benang-benang DNA

berwarna putih pada lapisan atas larutan diambil dan dimasukkan dalam tabung eppendorf 1.5 ml

untuk selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm.

Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan DNA kromosom dari komponen lain seperti

protein ataupun RNA. Pemisahan dengan sentrifus didasarkan perbedaan bobot molekul. DNA

kromosom yang memiliki bobot molekul lebih besar akan berada dibagian dasar setelah

disentrifugasi. Pada tahap akhir pelet dikering-anginkan untuk menghilangkan EtOH dan DNA

kromosom yang didapatkan ditambahkan dengan dH2O steril.

Larutan diukur dengan sperofotmotri dengan A 260 dan 280 nm,hal ini karena DNA dan

RNA menyerap pada panjang gelobang maksimal 260 nm, sementara kebanyakan protein

menyerap kuat pada 180 nm. Namun asam nukleat juga menyerap secara signifikan pada 280 nm

(50%-50% dari absorbansi pada 260 nm) dan sebagian protein dapat menyerap kuat pada 260

nm. Dengan demikian , untuk mengukur secara akurat konsentrasi DNA, RNA,dan protein dalam

campuran yang komples bias menjadi sulit. Namun mengukur pada absorbansi 260 dan 280 nm

dapat memberikan validasi kemurnian sampelasam nukleat rasio A260/A280 di atas 1,8 untuk

DNA dan 2,0 untuk RNA mengindikasikan sampel yang murni, nilai rasio yang rendah

menunjukan adanya protein dan kontaminan lainnya. (teare 1997).

Simpulan

Proses isolasi DNA kromosom pada umbi bawang merah memiliki empat tahap, yaitu:

pemecahan sel, pengendapan DNA, penghilangan komponen lain selain DNA, dan pemekatan

DNA. DNA kromosom memiliki bobot molekul yang besar dibandingkan molekul dalam sel

lainnya.

Daftar pustaka

Brush A. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Jakarta: Gramedia.

David AM, Freyer GA, Crotty DA. 1983. DNA Science: A First Course. New York: Laboratory Press.

Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow. 12(1):13-15.

Miller J.N. 2000. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 4th ed. Harlow:

Prentice. Hall.

Robinson J.R. 1975. Fundamental Of Acid-Base Regulation, 5th edition. Oxford: Blackwell

Scientific Publication.

Teare, J.M. et al. 1997. Measuremen of Nucleic Acid Concentration Using the DyNa QuanTM and the GenequantTM . BioTechniques.