Download - Laporan Isolasi DNa - Copy
Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Selasa, 12 November 2013
Biokimia Waktu : 09:00-10:40 WIB
PJP : Syaefudin,M.si
Asisten : Lusianawati,S.si
Resti Siti Muthmainah,S.si
ISOLASI DNA KROMOSOM
Kelompok 2
Mhd Ali Aman.Siregar J3L112002
Indryani Rahayu Kuswardhani J3L112080
Emilia Anisa J3L112153
PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIAPROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR
2013
Pendahuluan
Isolasi DNA adalah tahap awal dalam mempelajari DNA sequence yang spesifik dengan
populasi DNA yang lengkap, dan dalam analisa struktur gen dan ekspresi gen (Miller 2000).
DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana
dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik
secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan
untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan.
DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi (Robinson
1975).
Isolasi DNA kromosom secara umum dibagi atas 3 tahap yaitu pemecahan sel atau
jaringan/sel dilisis untuk membebaskan isinya, ekstrak sel diberi perlakuan untuk menghilangkan
semua komponen kecuali DNA,dan pemekatan larutan DNA yang telah diperoleh (Miller 2000).
Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Pemecahan dinding sel secara
mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil.
Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair
dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang
berisi DNA (Brush 1994).
Sentrifugasi adalah metode sedimentasi untuk memisahkan partikel-partikel dari suatu
fluida berdasarkan berat jenisnya dengan memberikan gaya sentripetal (Robinson 1975).
Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan sel menjadi organel-organel utama sehingga fungsinya
dapat diketahui (Miller 2000). Substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan
substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Miller 2000). Substansi hasil sentrifugasi
terbagi menjadi dua, yaitu supernatan dan pelet.
Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih
rendah. Posisis dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya lebih jernih. Sementara
pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih tinggi. Posisisnya
berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan warnanya lebih keruh. Sentrifugasi bertujuan
untuk memisahkan sel menjadi organel-organel utama sehingga fungsinya dapat diketahui
(Miller 2000). Sentrifugasi ini biasa digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang
perbedaan densitasnya hingga 0,02 g/mL/ molekul-molekul tersebut seperti molekul protein,
DNA, dan RNA yang densitasnya pada larutan sesium klorida ialah 1.3 g/mL , 1.6-1.7 g/mL, dan
1.75-1.8 g/Ml (Collen et al 1996).
Tujuan
Percobaan bertujuan menunjukan sifat dan struktur DNA memlalui proses isolasi, dan
melatih dalam proses isolasi DNA dengan umbi bawang.
Alat dan Bahan
Alat alat yang digunakan yaitu Pipet mikro,corong pisah, mortar,tabung reaksi,gelas piala
100 mL, pisau, Sentrifus kecepatan tinggi, tabung sentrifius, Penangas air.
Bahan-bahan yang digunakan yaitu Umbi bawang merah, NaCl, Larutan lisis, SDS 10%,
Buffer elusi/buffer TE, dH2O steril, larutan EtOH.
Prosedur percobaan
Pembuatan larutan. Larutan lisis terdiri dari 50 mM Tris HCl, pH 8.0 yang mengandung
50 mM EDTA. Sedangkan larutan elusi atau buffer TE dibuat dari 10 mM Tris-HCl pH 8,0 yang
mengandung 0.1 mM EDTA pH 8.0. Setelah itu, larutan disimpan di pendingin.
Prosedur isolasi DNA kromosom. Sebanyak 25 gram umbi bawang digerus dengan
menggunakan mortar, ditambahkan 40 mL larutan lisis dan 0.5 gram garam dapur digerus
sampai halus. Setelah itu, dituang ke dalam gelas piala 250 mL dan ditambahkan 5 mL larutan
SDS 10%. Larutan dicampur secara homogen dan diinkubasi pada suhu 60°C dalam water bath
selama 20 menit. Hasil inkubasi lalu disaring ke dalam gelas beaker yang ditempatkan diatas es
sehingga larutan tersebut segera menjadi dingin. Setelah larutan menjadi dingin kemudian
ditambahkan 0,5 gram protease, aduk secara sempurna dan biarkan selama 15 menit. Kemudian
larutan dibiarkan 5 menit lalu diambil larutan atas dengan menggunakan pipet tetes dan
dipindahkan ke dalam 4 tabung baru.
EtOH dingin sebanyak 10 mL ditambahkan melalui sisi tabung. Kemudian, tabung
ditempatkan secara perlahan di atas es dan dibiarkan selama 2-5 menit. DNA kromosom akan
mengendap pada bagian atas dari EtOH dan tampak sebagai benang-benang putih. DNA
kromosom diambil dengan pipet tetes secara hati-hati dengan sesedikit mungkin larutan EtOH
yang terambil dan ditempatkan pada 2 tabung eppendorf 1.5 mL. Keempat tabung disentrifugasi
selama 1 menit dengan kecepatan 10.000 atau 13.000 rpm. EtOH dibuang pada lapisan atas
secara hati-hati tanpa merusak pellet dan ditambahkan 1 mL EtOH ke pellet DNA kromosom.
Resuspen pelet DNA kromosom dengan cara vortex dalam 1 mL EtOH dan disentrifugasi
kembali selama 1 menit. EtOH dituang dan DNA kromosom dikeringkan dalam bech selama 10
menit. Setelah kering, buffer TE atau dH2O steril 1 mL untuk melarutkan DNA kromosom. Ukur
absorbansi DNA pada panjang gelombang 260 dan 280 nm dengan spektrofotometri.
Data dan Hasil Percobaan
Tabel 1 Data hasil pengukuran konsentrasi DNA dari umbi bawang
Larutan A 260 A 280 A koreksi
260
A koreksi
280
[DNA] [RNA] [DNA/RNA]
Sampel 1 0.7775 0.7972 0.7775 0.7972 38.875 39.875 0.974
Sampel 2 0.7905 0.7978 0.7905 0.7978 39.750 39.890 0.996
Sampel 3 0.7808 0.7972 0.7808 0.7972 39.040 39.875 0.979
Sampel 4 0.7590 0.7981 0.7590 0.7981 37.950 39.905 0.951
Blanko(TE) 0 0
Contoh perhitungan:
A koreksi = A sampel – A blanko
=0.7775 -0
=0.7775
[DNA] = A 260 x 50 mg/mL
= 0.7775 x 50 mg/mL
= 38.875 mg/mL
[RNA] = A 280 x 50 mg/mL
= 0.7972x 50 mg/mL
= 39.875 mg/mL
Pembahasan
Prinsip isolasi DNA kromosom itu sendiri didasarkan pada pemisahan DNA kromosom
dari pengotor lain berupa protein atau RNA menggunakan teknik sentrifugasi. Secara umum
isolasi DNA kromosom terbagi atas tiga tahapan proses yaitu pemecahan sel atau pelisisan sel,
menghilangkan komponen lain selain DNA kromosom, dan pemekatan larutan DNA yang
diperoleh (David et al. 1983).
Isolasi DNA kromosom merupakan tahap yang paling penting yang harus dilakukan. Hal
ini dikarenakan DNA kromosom merupakan sumber DNA yang umumnya kita kehendaki untuk
diklon yang harus bersih dari pengotor-pengotor seperti protein dan RNA. Sumber DNA dapat
berasal dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia (Brush 1994).
Isolasi DNA kromosom dilakukan pada umbi bawang merah pada praktikum kali ini.
Penggunaan umbi bawang merah sebagai sumber pengisolasian DNA kromosom disebabkan
umbi bawang memiliki sedikit pati sehingga DNA akan terlihat akan lebih jelas dan mudah
diisolasi (David et al. 1983).
Percobaan ini terlebih dahulu bawang merah diris dengan pisau,hal ini dilakukan agar
memperkecil umbi bawang dan merperluas permukaannya sehingga mempercepat penggerusan.
Setelah itu umbi bawang digerus dengan mortal dan ditambahkan dengan larutan lilis 40 Ml dan
1,5 gram garam dapur. Penambahan larutan lisis yang berfungsi melisis dinding sel,dan
penambahan garam dapur untuk melarutkan DNA pada umbi bawang, kemudian masukkan
ekstrak kedalam gelas piala 250 mL dan di tambahkan larutan SDS 10% sebanyak 5 mL. Hal ini
dilakukan untuk memecahkan dinding sel dengan mengemulsi lipid dan protein merusak
interaksi polar pada membran sel, kemudian larutan di inkubasi dalam water batch pada suhu 60 OC selama 10 menit. Tahapan ini dilakukan untuk mengoptimalkan kerja buffer ekstrak yang
ditambahkan ke dalam sampel, setelah selesai larutan disaring dan ditempatatkan di atas es agr
lebih cepat dingin.
Setelah selesai dingin ditambahkan 0,5 gram NaCl, NaCl ini dapat menyebabkan DNA
menjadi larut karena ion Na+ mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat
DNA yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak menolak satu sama lain
sehingga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA. Hal ini akan
menyebabkan DNA akan terkumpul (Doyle & Doyle 1990).
Biarkan larutan selama 15 menit,dan larutan paling atas dipindahkan pada tabung lain dan
ditambahkan dengan 10 mL larutan EtOH melaluai sisi tabung. Penambahan alkohol dingin pada
ekstrak ekstrak sel melalui dinding tabung akan membentuk gumpalan putih. Etanol dingin
berfungsi dalam pengikatan strand DNA yang telah terkumpul kerena pemekatan oleh garam.
Hal ini karena kerapatan alkohol lebih kecil dibandingkan kerapatan air maka alkohol akan
berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol
akan nampak sebagi benang-benang putih yang terapung di atas filtrat. Benang-benang DNA
berwarna putih pada lapisan atas larutan diambil dan dimasukkan dalam tabung eppendorf 1.5 ml
untuk selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm.
Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan DNA kromosom dari komponen lain seperti
protein ataupun RNA. Pemisahan dengan sentrifus didasarkan perbedaan bobot molekul. DNA
kromosom yang memiliki bobot molekul lebih besar akan berada dibagian dasar setelah
disentrifugasi. Pada tahap akhir pelet dikering-anginkan untuk menghilangkan EtOH dan DNA
kromosom yang didapatkan ditambahkan dengan dH2O steril.
Larutan diukur dengan sperofotmotri dengan A 260 dan 280 nm,hal ini karena DNA dan
RNA menyerap pada panjang gelobang maksimal 260 nm, sementara kebanyakan protein
menyerap kuat pada 180 nm. Namun asam nukleat juga menyerap secara signifikan pada 280 nm
(50%-50% dari absorbansi pada 260 nm) dan sebagian protein dapat menyerap kuat pada 260
nm. Dengan demikian , untuk mengukur secara akurat konsentrasi DNA, RNA,dan protein dalam
campuran yang komples bias menjadi sulit. Namun mengukur pada absorbansi 260 dan 280 nm
dapat memberikan validasi kemurnian sampelasam nukleat rasio A260/A280 di atas 1,8 untuk
DNA dan 2,0 untuk RNA mengindikasikan sampel yang murni, nilai rasio yang rendah
menunjukan adanya protein dan kontaminan lainnya. (teare 1997).
Simpulan
Proses isolasi DNA kromosom pada umbi bawang merah memiliki empat tahap, yaitu:
pemecahan sel, pengendapan DNA, penghilangan komponen lain selain DNA, dan pemekatan
DNA. DNA kromosom memiliki bobot molekul yang besar dibandingkan molekul dalam sel
lainnya.
Daftar pustaka
Brush A. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Jakarta: Gramedia.
David AM, Freyer GA, Crotty DA. 1983. DNA Science: A First Course. New York: Laboratory Press.
Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow. 12(1):13-15.
Miller J.N. 2000. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 4th ed. Harlow:
Prentice. Hall.
Robinson J.R. 1975. Fundamental Of Acid-Base Regulation, 5th edition. Oxford: Blackwell
Scientific Publication.
Teare, J.M. et al. 1997. Measuremen of Nucleic Acid Concentration Using the DyNa QuanTM and the GenequantTM . BioTechniques.