LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA(KI3061)

PERCOBAAN 3ISOLASI DNA DARI BUAH DAN ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Nama: Muhamad Gidry AbdurrazakNIM: 11213016Kelompok: 4Tanggal Percobaan: 6 Maret 2015Tanggal Laporan: 27 Maret 2015Asisten: Nurani HasanelaNIM Asisten: 20514043

LABORATORIUM BIOKIMIAPROGRAM STUDI KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMINSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG2015

1. Tujuana. Menentukan pola migrasi DNA dari buah strawberry dan bawang bombayb. Menentukan ukuran DNA buah strawberry dan bawang bombay

2. Teori DasarDNA merupakan materi genetik yang menentukan sifat dari suatu organisme. DNA merupakan suatu polinukleotida yang tersusun atas monomer dATP, dTTP, dGTP, dan dCTP yang saling terikat melalui ikatan fosfodiester. Struktur 3D DNA yang dikemukakan oleh Watson dan Crick (dalam Nelson dan Cox, 2008) terdiri atas dua rantai DNA yang saling berpilin atau bisa disebut double helix. Tiap rantai DNA sendiri memiliki gugus hidrofilik dengan ujung fosfat menghadap ke luar rantai dan basa nitrogen berada di dalam putaran rantai. Kedua rantai DNA dihubungkan dengan basa-basa nitrogen yang menghadap ke dalam ini melalui ikatan hidrogen.DNA memiliki muatan yang negatif. Muatan yang negatif ini terdapat pada gugus-gugus fosfatnya (Hart dkk., 2010). DNA akan bermigrasi pada gel agarosa dalam buffer dan medan listrik tertentu. DNA hasil elektroforesis divisualisasikan dengan merendam gel agarosa dalam larutan etidium bromida. DNA yang mengikat etidium bromida akan mengalami fluoresensi jika diberi sinar UV. Adapun untuk mengetahui ukuran DNA sampel pada elektroforesis, digunakan DNA standar yang telah diketahui ukurannya. Campuran berisi DNA-DNA standar yang diketahui ukurannya ini disebut DNA marker.

3. Data Pengamatan

Tabel 3.1 Data jarak terjauh fragmen-fragmen DNANo.Sampel DNAJarak yang ditempuhGambarFragmen Strawberi 2

IStrawberry 1-Fragmen Strawberi 1

Gambar 3.1 Fragmen DNA strawberi

Strawberry 2-

IIBawang bombay 1+++Fragmen bawang bombai 2

Fragmen bawang bombai 1

Gambar 3.2 Fragmen DNA bawang bombay

Bawang bombay 2+++

IIIKontrol/Standar++++Fragmen Kontrol

Gambar 3.3 Fragmen DNA kontrol

Keterangan : tingkat terjauh fragmen DNA 1= +2= ++3= +++4 = ++++

4. PembahasanPercobaan kali ini menggunakan DNA strawberry dan bawang bombay untuk elektroforesis. Yang pertama kali dilakukan adalah penggerusan. Penggerusan dilakukan untuk merusak dinding sel dan membran sel secara mekanik. Sehingga materi-materi di dalam sel dapat diperoleh dengan mudah, terutama molekul DNA yang cukup besar.Hal yang dilakukan setelah penggerusan adalah penambahan NaCl, detergen, dan air. NaCl sendiri berperan dalam mengendapkan protein dan karbohidrat supaya DNA lebih mudah diperoleh. Ion Na+ dari NaCl sendiri dapat membentuk ikatan dengan gugus fosfat DNA yang bermuatan negatif dan membuat DNA terkumpul dan memekat. NaCl juga berfungsi mempertahankan pH larutan agar tetap konstan. Penambahan detergen sendiri berfungsi untuk melisiskan dinding dan membran sel yang terbentuk dari fosfolipid bilayer (Sweeney, 2015). Detergen dapat merusak membran sel melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran sel dan membentuk kompleks lipid protein-deterjen. Penambahan air sendiri dilakukan untuk melarutkan DNA, karena DNA sendiri merupakan senyawa polar.Penyaringan kemudian dilakukan untuk memisahkan endapan buah strawberry atau bawang bombay dari filtrat yang berisi DNA. Kemudian filtrat dipindahkan ke tabung reaksi sebanyak 6 mL dan ditambahkan isopropanol dingin. Isopropanol dingin berfungsi untuk memicu terjadinya presipitasi pada larutan DNA. Pada awalnya DNA larut dalam air, namun setelah ditambahkan isopropanol dingin DNA akan terpresipitasi di isopropanol dingin. Hal ini akan menyebabkan molekul-molekul DNA menggumpal dan saling berikatan, membentuk struktur seperti gelatin putih. Kemudian gelatin putih ini dililitkan pada batang pengaduk dan dilarutkan kembali dalam air pada tabung mikrosentrifuga.Kemudian larutan DNA dalam mikrosentrifuga dicampur dengan gliserol dan brom fenol biru. Gliserol berfungsi sebagai pemberat sehingga sampel DNA dapat tenggelam ke dasar sumur gel agarosa dan tidak melayang keluar. Bromo-fenol berfungsi sebagai zat warna dalam gel agarosa saat elektroforesis. Senyawa ini berfungsi sebagai penanda kemajuan sampel DNA pada gel agarosa selama proses elektroforesis (tracking dye) dan menentukan kapan saatnya harus menghentikan proses elektroforesis.Elektroforesis pada percobaan ini menggunakan gel agarosa sebagai medium. Gel agarosa sendiri dibuat dari rumput laut. Menurut Bowen (2000), gel agarosa juga bersifat nontoksik, sehingga relatif aman digunakan. Kemudian senyawa TAE buffer ditambahkan pada tangki elektroforesis yang berisi gel agarosa. TAE Buffer pada percobaan kali ini berfungsi sebagai fasa gerak dari elektroforesis dan melengkapi gel agarosa sebagai fasa diam. Selain itu TAE buffer juga berfungsi untuk menjaga pH agar tetap stabil. Hal ini diperlukan karena fragmen DNA dapat terdenaturasi akibat adanya perubahan pH. Perubahan pH ini disebabkan oleh perubahan kesetimbangan ion H+ dan OH- dari elektroda. Denaturasi ini sendiri dapat merusak elektromobilitas DNA pada medium. Selain itu ditambahkan pula larutan etidium bromida (EtBr). Etidium bromida digunakan sebagai pewarna, karena EtBr yang ditambahkan dalam gel agarosa berinteraksi dengan basa nitrogen dari molekul DNA dan menghasilkan sifat fluoresensi yang dapat terlihat dengan paparan sinar UV. Struktur kimia dari etidium bromida ditunjukkan oleh Gambar 4.1

Gambar 4.1 Struktur kimia etidium bromidaElektroforesis dimulai saat kabel dihubungkan dengan power supply dan tangki elektroforesis pun ditutup. Elektroforesis dilakukan pada 50-70 volt. Sumur DNA pada gel agarosa terletak di sisi kutub negatif alat elektroforesis, karena DNA yang bermuatan negatif diharapkan akan bergerak ke arah kutub positif alat elektroforesis (Martin, 1996). Lampu UV pada alat elektroforesis pun dinyalakan dan akan terlihat sifat fluoresensi yang diakibatkan oleh etidium bromida dalam bentuk warna pink pucat. Kemudian ketika warna dari tracking dye sudah sampai pada batas ujung bawah gel agarosa, power supply dimatikan. Hasil elektroforesis kemudian dibandingkan dengan DNA marker yang ikut dielektroforesis. DNA marker pada percobaan ini terletak pada sumur paling kiri dari gel agarosa apabila dilihat dari sisi gel yang paling dekat dengan sumur-sumur yang ada. DNA marker berfungsi sebagai pembanding atau kontrol yang menunjukkan ukuran fragmen DNA yang kita ingin ketahui. DNA marker terdiri atas sekumpulan fragmen DNA yang ukurannya telah diketahui sebelumnya. DNA marker yang terdapat pada ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi fragmen DNA sampel yang bermigrasi. Posisi fragmen DNA sampel dicocokkan dengan DNA marker yang memiliki jarak tempuh yang sama dari sumurnya masing-masing, kemudian disesuaikan dengan data ukuran DNA marker yang ada (dalam satuan kilobasa / kb) untuk mendapatkan ukuran fragmen DNA sampel. Pada percobaan kali ini, digunakan 1kb DNA Ladder sebagai DNA marker. Adapun ukuran fragmen-fragmen DNA pada 1kb DNA Ladder ditunjukkan pada Gambar 4.2.

Gambar 4.2 Ukuran fragmen DNA pada 1kb DNA Ladder

Berdasarkan data pengamatan, didapat bahwa fragmen DNA strawberry tidak bermigrasi sama sekali dari sumurnya, sedangkan fragmen DNA bawang bombay bermigrasi sampai jarak migrasi fragmen 1kb DNA ladder terjauh. Fragmen DNA strawberry yang tidak bergerak dari sumurnya dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, salah satunya adalah DNA strawberry memiliki ukuran diatas 10.000 bp. Sedangkan untuk DNA bawang bombay, jarak tempuh migrasi fragmen DNAnya pada elektroforesis menunjukkan bahwa kira-kira ukuran fragmen DNAnya adalah sekitar 1.000 1.500 bp. Hal ini dapat disimpulkan setelah posisi migrasi fragmen DNAnya dicocokkan dengan DNA markernya, yakni 1kb DNA Ladder.

5. Kesimpulan Pola migrasi DNA strawberry pada percobaan ini dapat dilihat pada Gambar 3.1, sedangkan pola migrasi DNA bawang bombay pada percobaan ini dapat dilihat pada Gambar 3.2 Ukuran DNA strawberry diatas 10.000 bp, sedangkan ukuran DNA bawang bombay diperkirakan berada dalam rentang 1.000 1.500 bp.

6. Daftar PustakaBowen, R. 2000. Principles of Gel Electrophoresis (online). Tersedia: http://www.vivo.colostate.edu (26 Maret 2015)Hart, David J. dkk. 2010. Organic Chemistry: A Short Course (13th edition). Belmont:Brooks/Cole, Cengage Learning.Martin, R. 1996. Gel Electroforesis: Nucleid acids. Oxford: Bros Scientific Publishers Ltd.Nelson, David L. dan Michael M. Cox.2008. Lehninger: Principles of Biochemistry. New York: W.H. Freeman Company.Sweeney, Diane. 2015. DNA Isolation from Strawberries (online). Tersedia: http://www.gs.washington.edu/outreach/dhillon_dnaprocedure.pdf (26 Maret 2015)