Praktikum Biokimia

LIPASE

Nama : Hestin PermatasariNIM : 10510035Tanggal Percobaan : 28 Februari 2013Tanggal Pengumpulan: Februari 2013Nama Asisten :

Program Studi Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Teknologi Bandung

Februari 2013

Lipase

I. Tujuan Percobaan

Mengekstrak enzim lipase dan menguji aktivitasnya

II. Teori Dasar

Enzim lipase bekerja secara spesifik bagi substrat yang memiliki gugus ester.

Enzim ini mengkatalisis hidrolisis dan sintesis bentuk ester dari gliserol dan asam

lemak rantai panjang. Pada penyiapan sampel dilakukan penambahan asam oleat.

Asam ini berfungsi sebagai emulgator dari substrat karena asam oleat sendiri

memiliki gugus hidrofil dan hidrofob didua muka yang berlainan. Gugus hidrofob ini

akan berikatan dengan asam lemak, sementara gugus hidrofilnya akan berikatan

dengan enzim. Hal ini sesuai dengan sifat enzim lipase yang memang larut dalam air.

Enzim ini juga berperan dalam transfer lipid antar membran. Hal ini dikarenakan

lipase memecah triasilgliserida (molekul yang besar) untuk bisa melewati membran

dalam mitokondria agar bisa dioksidasi lebih lanjut. Sayangnya enzim ini sedikit sulit

untuk diekstraksi dan tidak bekerja pada pH rendah.

Aktivitas enzim ini dapat diukur dengan dua metoda, Pada metoda perubahan pH

tidak memberikan akurasi yang baik, hal ini bisa dilihat dari nilai regresi dan juga

nilai pH yang tidak mengalami penurunan secara bertahap. Metode ini mengukur

langsung jumlah asam lemak yang dihasilkan kedalam larutan lewat perubahan pH.

Jika lipase masih memproduksi asam lemak maka larutan akan segera bertambah

asam. Ketika pH larutan menunjukan nilai konstan pada pH yang makin asam maka

aktifitas lipase dalam memprosuksi asam lemak telah berhenti. Perubahan pH yang

tidak signifikan inilah yang membuat galat pengukuran menjadi besar.

III. Data Pengamatan

enzim tanpa

pemanasan

Enzim dengan pemanasan

t(menit) pH t(menit) pH

2 6.874 2 7.036

4 6.866 4 7.089

6 6.937 6 7.14

8 6.92 8 7.13

10 6.931 10 7.138

12 6.948 12 7.144

14 6.927 14 7.144

16 6.908 16 7.247

18 6.934 18 7.241

20 6.946 20 7.241

22 6.937 22 7.249

24 6.936 24 7.246

26 6.92 26 7.246

28 6.961 28 7.246

30 6.948 30 7.246

IV. Pengolahan Data

Grafik aktivitas lipase terhadap perubahan pH adalah sebagai berikut:

0 5 10 15 20 25 30 356.6

6.7

6.8

6.9

7

7.1

7.2

7.3f(x) = 0.00719642857142859 x + 7.07039047619047R² = 0.815456653181808

f(x) = 0.00194285714285716 x + 6.89511428571429R² = 0.434747351287187

enzim tanpa pemanasanLinear (enzim tanpa pe-manasan)enzim dengan pemanasanLinear (enzim dengan pemanasan)

time

PH

V. Pembahasan

Enzim merupakan polimer biologik yang mengatalisis lebih dari satu proses

dinamik yang memungkinkan kehidupan seperti yang kita kenal sekarang. Setiap

enzim mempunyai nomor kode (EC) yang mencirikan tipe reaksi ke dalam kelas

(digit pertama), subkelas (digit kedua), dan subsubkelas (digit ketiga). Digit keempat

adalah untuk enzim spesifik. Lipase (EC 3.1.1.3) memiliki nama sistematik

triacylglycerol hydrolase yang berfungsi menghidrolisis triasilgliserol menjadi

gliserol dan asam lemak. Enzim ini bekerja secara spesifik bagi substrat yang

memiliki gugus ester. Enzim lipase pada percobaan ini diekstrak dari kacang.

Pemilihan kacang sebagai sumber lipase karena mudah ditemui dan harganya murah.

Selain kacang, sumber lipase lainnya tersaji dalam tabel berikut:

Ektraksi merupakan salah satu tahap dalam pemurnian protein. Tahapan kuci

dalam pemurnian protei antara lain: Pelepasan protein target dari bahan dasar,

Penghilangan material padat dan meninggalkan protein dalam supernatant,

Pemekatan protein, Penghilangan kontaminan untuk mendapatkan tingkat kemurnian

yang diinginkan, Menstabilkan protein target. Dalam bentuk bagan, ekstraksi dalam

pemurnian protein adalah sebagai berikut:

Setelah dilakukan ekstraksi lipase dari kacang tanah yang ekstrak kasarnya

menyerupai cream, selanjutnya dilakukan uji aktivitas. Dalam uji aktivitas, sampel

dalam bentuk emulsi. Dilakukan dalam bentuk emulsi karena enzim lipase

merupakan enzim yang larut dalam air, sedangkan minyak olive yang non polar tidak

akan larut dalam air sehingga digunakan asam oleat sebagai emulgator agar enzim

dan minyak dapat “bertemu” dan bereaksi. Asam oleat memiliki gugus hidrofil dan

hidrofob didua muka yang berlainan. Gugus hidrofob ini akan berikatan dengan asam

lemak, sementara gugus hidrofilnya akan berikatan dengan enzim lipase. Bila dalam

tubuh, yang berperan sebagai emulgator adalah garam empedu. Selain itu secara

kinetic menurut percobaan Sarda and Desnuelle pada tahun 1958, aktivitas

antarmuka lipase akan tinggi bila dilakukan pada supersubstrat yang salah satunya

adalah emulsi. Penambahan NaOH adalah untuk menambah kelarutan emulsi yang

terbentuk ini. Kemudian sebelum dilakukan penentuan aktivitas lipase, emulsi

dikondisikan terlebih dahulu pada pH 7 agar sesuai dengan pH optimum lipase.

Aktivitas enzim dipengaruhi pH dikarenakan protein enzim memiliki asam-asam

amino yang dapat diprotonasi atau dideprotonasi, sehingga konformasi dan aktivitas

enzim akan dipengaruhi oleh konsentrasi ion hidrogen di dalam larutan enzim.

Diantara beberapa jenis lipase adalah sebagai berikut:

1. Lipase Pankreas (Pancreatic Lipase) : Pada manusia, lipase penkreas disekresikan

oleh pankreas bersama dengan garam-garam empedu dan disimpan dalam kantong

empedu, yang akan dilepaskan ketika chime (makanan yang sudah dicerna sebagian)

memasuki usus kecil. Garam empedu berfungsi mengemulsikan lemak menjadi

molekul yang lebih kecil, sehingga memperluas area permukaan dan meningkatkan

efektivitas lipase dalam mengkatalisis pencernaan lemak.

2. Lipase Intraseluler (Intracellular Lipase) : Lipase juga melayani fungsi

intraseluler pada lisosom, organel yang membantu menghilangkan produk sampah

dari sel. Belum ada konsesus yang jelas mengenai peran spesifik lipase dalam

lisosom selain dari memecah lipoprotein dalam sel. Namun, peneliti dari Albert

Einstein College of Medicine menunjukkan bahwa lipase juga dapat berfungsi dalam

pengaturan penyimpanan lipid intraseluler.

3. Lipase pada Bakteri: Banyak spesies jamur dan bakteri yang menyekresi lipase

untuk membantu penyerapan nutrisi dari lingkungan. Hal ini dibuktikan pada

produksi keju dan yogurt dari bakteri yang memanfaatkan lipase sebagai sarana

memecah lemak susu. Selain penggunaannya dalam industri susu, lipase berpotensi

meningkatkan efektivitas produksi bahan bakar alternatif. Berbagai penelitian saat ini

sedang menguji produksi biofuel dari minyak tumbuhan menggunakan lipase dari

bakteri untuk memfasilitasi pemecahan minyak.

4. Fosfolipase: Berbagai macam serangga dan ular menggunakan lipase jenis tertentu

yang disebut fosfolipase untuk meningkatkan daya racun sengatan atau gigitan.

Adanya fosfolipase dalam racun (bisa) akan meningkatkan inflamasi (peradangan)

akibat sengatan atau gigitan melalui pencernaan lapisan ganda sel fosfolipid.

Pada semua lipase, terdapat tiga serangkai katalitik yaitu serine,histidin dan

spartat (atau glutamate pada beberapa enzim seperti lipase dari Geotrichum

candidum atau Candida rugosa). Enzim dapat berperan sebagai katalis karena

menurut teori keadaan transisi, reaksi kimia konversi substrat (S) menjadi produk (P)

harus melalui keadaan transisi (S‡) yang memiliki energi bebas lebih tinggi

dibanding S dan P. Beda energi bebas keadaan transisi dan substrat disebut energi

bebas aktivasi atau energi aktivasi (ΔG‡).

ΔG‡ = G(S‡) – G(S)

Enzim mempercepat reaksi dengan cara memfasilitasi pembentukan keadaan transisi.

Pembentukan kompleks ES adalah tahap pertama katalisis enzim. Bukti

pembentukan ES dalam reaksi yang dikatalisis enzim: Reaksi yang dikatalisis oleh

enzim memiliki kecepatan maksimum, bukti struktur kompleks ES oleh difraksi

sinar-X, dan adanya karakteristik spektrum dari kompleks ES.

Hasil yang didapatkan dalam percobaan ini kurang dapat dipertanggungjawabkan

karena metoda yang digunakan sangat tidak akurat. Metoda yang kami gunakan

adalah dengan memperhatikan perubahan pH terhadap waktu, perubahan pH ini

dipengaruhi oleh terbentuknya asam lemak sedangkan aktivitas enzim dipengaruhi

oleh perubahan pH seperti yang sudah saya sebutkan dan enzim bertindak sebagai

buffer sehingga menginhibisi perubahan pH. Ketidak akuratannya dapat dilihat

secara kasar dari grafik aktivitas lipase terhadap perubahan pH. Pada enzim yang

tidak dipanaskan, pH secara umum meningkat tapi di tengah pengukuran terdapat

banyak naik turun. Sedangkan pada enzim yang dipanaskan, seharusnya enzim

terdenaturasi dan tidak dapat mempunyai aktivitas, hal ini secara umum dapat dilihat

karena grafik cenderung membentuk garis horizontal. Kesalahan lain yang membuat

hasil percobaan ini tidak akurat karena pengukuran pH dilakukan oleh orang yang

berbeda dan alat yang bergantian dengan kelompok lain sehingga pH terukur dan

terdokumentasi bukan benar-benar pH saat pH meter ready.

Ada metoda lain untuk pengujian aktivitas enzim lipase yang lebih akurat untuk

pengujian kuantitatif, salah satu diantaranya adalah dengan cara Minyak sebanyak

1,0 mL dimasukkan ke dalam erlenmeyer 100 mL, lalu ditambahkan berturut-turut

0,5 mL CaCl2 0,1 M dan 4,5 mL bufer asetat 0,1 M (pH 5,5). Campuran reaksi

diinkubasi pada suhu 40°C selama 10 menit, kemudian ditambahkan enzim lipase

sebanyak 10% (v/v) dari masing-masing biakan dan diinkubasi kembali pada suhu

40°C dengan digoyang pada kecepatan 160 rpm selama 30 menit. Selanjutnya,

campuran reaksi ditambah 20 mL etanol dan 3 tetes indikator fenolptalin serta

dititrasi dengan NaOH 0,05 M sampai terjadi perubahan warna menjadi merah muda.

Satu unit aktivitas enzim lipase setara dengan 1 μmol asam lemak bebas yang

dihasilkan dari hidrolisis substrat yang dikatalisis oleh enzim lipase selama 30 menit.

Salah satu struktur lipase adalah sebagai berikut:

Diantara struktur tersier dari pancreatic lipase yang telah ditemukan, lipase ini

memiliki lid dengan residu 23 asam amino dan menunjukkan aktivasi antarmuka.

Pada lipase ini terdapat dua domain, yaitu domain N-terminal yang lebih besar

dengan 1-335 residu dan domain C-terminal yang lebih kecil dengan 336-449 residu.

pancreatic lipase secara langsung disekresikan sebagai enzim aktif dengan 449

residu asam amino dan berat molekul 50 kDa.

VI. Kesimpulan

1. Aktivitas lipase tanpa pemanasan cenderung meningkat dengan bertambahnya

waktu

Figure 2. Structure of Mucor miehei lipase in closed (A, C) and open form (B, D). A and B (side view): thecatalytic triad (yellow) and secondary structure elements showing the a/b-hydrolase fold common to all lipases.C and D (top view): space-filling model, colored by decreasing polarity (dark blue ± light blue ± white ± light red ±dark red). Upon opening of the lid, the catalytic triad (yellow) becomes accessible (D), and the region binding to the interphase becomes significantly more apolar.

2. Aktivitas lipase dengan pemanasan cenderung meningkat kemudian berhenti

dengan bertambahnya waktu

VII. Daftar Pustaka

http://www.ijmer.com/papers/Vol2_Issue6/BV2642314234.pdf

http://www.au-kbc.org/beta/bioproj2/sources.htm

http://www.ejbiotechnology.info/content/vol9/issue1/full/9/

S. Mitsuda, S. Nabeshima, H. Hirhora, Appl. Microbiol. Biotechnol.1989, 31, 334 ±

337.

L. Cao, A. Fischer, U. T. Bornscheuer, R. D. Schmid, Biocatal. Biotrans. 1997, 14,

269 ± 283.