80

LAMPIRAN

81

Lampiran 1. Prosedur Pengujian Analisis

1.1 Purifikasi Pati Pisang Kapas

Tujuan: Memurnikan pati pisang kapas sehingga tidak terkontaminasi zat lain

Prosedur:

- Persiapan sampel sebanyak 300 gram dilarutkan dalam 900 mL etanol 80%

- Pengadukan menggunakan stirrer selama 10 menit

- Pemisahan menggunakan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 x g selama 10

menit

- Endapan pati pisang dicampurkan dengan 900 mL etanol 80%

- Pengadukan menggunakan stirrer selama 10 menit

- Pemisahan kembali menggunakan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 x g

selama 10 menit

- Endapan pati dilarutkan dalam 600 mL etanol 96%

- Pengeringan pada suhu ruang hingga pati menjadi kering dan bebas etanol

1.2 Pembuatan Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4

Tujuan: Membuat media pertumbuhan enzim sehingga dapat bekerja secara

maksimal

Prosedur:

- Penimbangan tablet PBS sebanyak 1 buah

- Pelarutan dengan air deionisasi sebanyak 1 Liter

- Sterilasi menggunakan autoklaf

82

1.3 Pembuatan Kurva Standar Maltosa

Tujuan: Membuat kurva standar maltosa

Prosedur:

- Penimbangan bubuk maltosa sebanyak 90 mg

- Pencampuran dengan 25 mL PBS pH 7,4 yang sudah steril

- Konsentrasi maltose diencerkan hingga 10 µM, 20 µM, 30 µM, 40 µM, 50 µM,

60 µM, 70 µM, 80 µM, 90 µM, dan 100 µM.

- Pencampuran dengan enzim porcine pancreatic α-amilase konsentrasi 5 nM

- Pencampuran dengan Na2CO3 0,3 M (1:1)

- Pengujian menggunakan metode Prussian blue

- Pembuatan kurva standar

y = 0.0036x - 0.0211

R² = 0.9676

-0.05

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0 20 40 60 80 100 120

Abso

rban

si

Konsentrasi (µM)

Kurva Standar Maltosa

83

1.4 Uji Daya Cerna Pati (Butterworth et al., 2012)

Tujuan: Mengetahui daya cerna pati pada pati pisang kapas alami dan termodifikasi

menggunakan enzim α-amilase.

Prosedur:

- Persiapan sampel sebanyak 75 mg pati dilarutkan dalam 15 mL PBS (Phosphate

Buffer Saline) (pH 7,4) dalam tabung sentrifuse 50 mL.

- Pencampuran sampel dan pengondisian sampel dilakukan menggunakan rotary

mixer dan inkubator dengan suhu 37˚C.

- Pengambilan sampel sebanyak 600µL untuk inkubasi 0 menit.

- Pencampuran dengan enzim porcine pancreatic α-amilase konsentrasi 5nM

yang telah dilarutkan di larutan PBS yang terdapat Bovine Serum Albumin

(BSA) sebanyak 0,1%.

- Inkubasi pada suhu 37ºC dengan waktu 5 menit, 9 menit, 13 menit, 18 menit,

23 menit, 26 menit, 30 menit, 40 menit, 50 menit, 60 menit, 75 menit, 90 menit,

105 menit, dan 120 menit. Selama inkubasi berlangsung sampel mengalami

pemutaran menggunakan alat rotary mixer.

- Pencampuran 600µL sampel dengan reagen 0,3M Na2CO3 dingin dalam

microfuge tube dimana perbandingan sampel dengan reagen tersebut sebesar

1:1 yang berfungsi untuk menonaktifkan enzim porcine pancreatic α-amilase.

- Penyimpanan sampel dalam freezer dengan suhu -20˚C dan dilakukan thawing

terlebih dahulu sebelum proses sentrifugasi.

- Sentrifugasi dilakukan sehingga didapatkan supernatan pada kecepatan 13.000

x g selama 5 menit.

84

- Pengujian gula pereduksi dengan metode Prussian blue

1.5 Uji Gula Pereduksi Metode Prussian blue (Slaughter et al., 2001)

Tujuan: Mengetahui jumlah gula pereduksi yakni maltose yang terbentuk selama

proses daya cerna pati.

Prosedur:

- Supernatan sampel sebanyak 0,3 mL dalam tabung reaksi

- Penambahan 300 µL reagen A (16 mM KCN; 0,19 M Na2CO3) dan 300 µL

reagen B (1,18 mM K3Fe6(CN)6)

- Pemanasan pada water bath yang mendidih selama 15 menit

- Pendinginan pada suhu ruang selama ± 5 menit

- Setelah dingin, dilakukan penambahan 1,5 mL reagen C (3,11 mM NH4Fe

(SO4)2 ; 0,1% Sodium Dodecyl Sulphate; 0,42% v/v H2SO4)

- Didiamkan selama ±2,5 jam dimana setiap 100 menit, 120 menit dan 150 menit

di vortex sehingga terjadi perubahan warna yang lebih merata.

- Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 690 nm menggunakan

spektrofotometer.

1.6 Uji Gugus Karboksil (Chattopadhyay, Singhal, dan Kulkarni, 1997)

Tujuan: Mengetahui jumlah gugus karboksil yang terbentuk setelah proses ozonasi

berlangsung

Prosedur:

- Persiapan sampel sebanyak 2 gram dimana pati alami digunakan sebagai blanko

85

- Pencampuran dengan 25 mL HCl 0,1 N dan di aduk selama 30 menit

menggunakan magnetic stirrer

- Filtrasi menggunakan vakum filter yang memiliki media pori sebesar 150 mL

dan pencucian menggunakan 400 mL akuades

- Cake sampel dimasukkan ke beaker glass 500 mL dan dicampurkan dengan

akuades hingga mencapai volume 300 mL

- Slurry sampel dipanasakan dalam water bath yang mendidih dengan

pengadukan secara terus menerus selama 15 menit

- Sampel yang masih panas ditambahkan akuades hingga volume mencapai 450

mL

- Titrasi menggunakan 0,01 N NaOH hingga mencapai pH 8,3

- Gugus karboksil dihitung dalam satuan jumlah gugus karbonil per 100 unit

glukosa. Nilai yang diperoleh dimasukkan ke dalam rumus berikut.

COOH/100 GU = (Vs - Vb)x M x 0,045 x 100

W sampel

Keterangan:

Vs = Volume titrasi sampel

Vb = Volume titrasi blanko

M = Molaritas NaOH

1.7 Pengujian Differential Scanning Calorimetry (DSC) (Oladebeye et al.,

2013)

Tujuan: Mengetahui suhu awal gelatinisasi (To), suhu transisigelas (Tg), dan

entalpi gelatinisasi (ΔHg)

86

Prosedur:

- Peletakan sampel diatas pan alumunium dan pan alumunium digunakan sebagai

standar

- Pembuatan slurry dengan penambahan air 1:3 (pati:air) kemudian ditutup rapat

- Sampel didiamkan selama 1 jam sebelum dianalisis menggunakan instrument

DSC

- Pemanasan sampel pada rentang suhu 20-120ºC dengan peningkatan suhu

5ºC/menit.

- Suhu awal gelatinisasi (To), suhu puncak (Tp), entalpi gelatinisasi (ΔH), dan

suhu akhir (Te) dianalisa menggunakan DSC software TA instrument New

Castle USA.

1.8 Pengujian X-ray Diffraction (Kawabata et al., 1994)

Tujuan: Mengetahui tipe kristal dan kristalinitas granula pati yang diamati dari

difraktogram sinar-X menggunakan difraktogram sinar-X (X-ray

diffractometer, XRD 7000 Maxima dari Shimadzu)

Prosedur:

Sejumlah kecil sampel diletakan dalam wadah sampel kemudian dimasukan

dalam alat difraktometer sinar-X. Kondisi pengukuran adalah radiasi

monokromatik yang digunakan Cu dengan panjang gelombang 1,54060 A yang

dihasilkan dari difraktometer X-ray pada 40 kV dan 30Ma. Daerah scanning

difraksi pada sudut 2 theta adalah 5-35º dengan step interval 0,02º dan kecepatan

scan 2,0º/menit. struktur dilihat dari puncak yang dihasilkan. Kristalinitas (%)

87

dinyatakan sebagai presentase rasio dari daerah difraksi puncak dengan difraksi

total.

88

Lampiran 2. Dokumentasi Pembuatan Pati Pisang Kapas

Pisang Kapas

Pengupasaan

Pengecilan Ukuran

Perendaman dalam larutan natrium metabisulfit

Penghancuran

89

Bubur Pisang

Penyaringan

Pengendapan dan Pencucian Pati

Pati Basah

90

Pati Kering

Penggilingan

Pengayakan

Penyimpanan dalam Zip lock Metalized

91

Lampiran 3. Pati Pisang Kapas Alami dan Termodifikasi Oksidasi

a. Perbedaan Pati Pisang Kapas Alami dan Termodifikasi Oksidasi

b. Pati Pisang Kapas Alami

c. Pati Pisang Kapas Termodifikasi Ozonasi 10 Siklus

d. Pati Pisang Kapas Termodifikasi Ozonasi 20 Siklus

92

Lampiran 4. Hasil Pengujian Karboksil Menggunakan Metode Titrasi

Perlakuan Ulangan Rata-Rata

(%) 1 2

Alami 0,00000 0,00000 0,00000

Ozonasi 10 Siklus 0,02639 0,03396 0,03018 ± 0,005

Ozonasi 20 Siklus 0,04964 0,06338 0,05651 ± 0,010

Ulangan Perlakuan

Berat

Sampel

(g)

Volume

Sampel

(mL)

Volume

Blanko

(mL)

Konsentrasi

NaOH (N)

Gugus

Karboksil

(%)

Rata-

Rata

(%)

I

Alami x 2.4962 3.5

3.35

0.0099

0.0000 0.0000 Alami y 2.4962 3.2

Ozonasi

10 Siklus x 2.4476 4.9 0.028212

0.02639 Ozonasi

10 Siklus y 2.4476 4.7 0.024572

Ozonasi

20 Siklus x 2.3784 6.5 0.059003

0.04964 Ozonasi

20 Siklus y 2.3783 5.5 0.040274

II

Alami x 2.4578 4.1

4

0.0000 0.0000 Alami y 2.4579 3.9

Ozonasi

10 Siklus x 2.4268 5.8 0.033044

0.03396 Ozonasi

10 Siklus y 2.4269 5.9 0.034878

Ozonasi

20 Siklus x 2.3198 7.2 0.061454

0.06338 Ozonasi

20 Siklus y 2.3196 7.4 0.0653

Keterangan: Blanko = Pati pisang kapas alami

93

Lampiran 5. Grafik Uji Sifat Kristalinitas Menggunakan X-Ray Diffraction

a. Pati Pisang Kapas Alami

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 342Theta (°)

0

100

200

300

400

500In

tensity (

counts

)

94

b. Pati Pisang Kapas Ozonasi 10 Siklus

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 342Theta (°)

0

100

200

300

400

500In

tensity (

counts

)

95

c. Pati Pisang Kapas Ozonasi 20 Siklus

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 342Theta (°)

0

100

200

300

400

500

Inte

nsity (

counts

)

96

Lampiran 6.. Grafik Sifat Termal Menggunakan Differential Scanning Calorimetry

a. Pati Pisang Kapas Alami

97

b. Pati Pisang Kapas Ozonasi 10 Siklus

98

c. Pati Pisang Kapas Termodifikasi Ozonasi 20 Siklus

99

Lampiran 7. Data Gula Pereduksi Pati Pisang Kapas Alami dan Termodifikasi

Oksidasi

Perlakuan

Gula Pereduksi Bebas (µM)

Ulangan Rata-Rata

I II

Alami 6,000 10,259 8,130 ± 3,012

Ozonasi 10 Siklus 41,556 35,431 38,4931 ± 4,419

Ozonasi 20 Siklus 97,833 90,611 94,222 ± 5,107

Perlakuan

Absorbansi

Ulangan

I II

Alami 0,0005 0,0158

Ozonasi 10 Siklus 0,1285 0,1060

Ozonasi 20 Siklus 0,1550 0,1420

Perhitungan:

Persamaan kurva standar Maltosa: y = 0.0036x - 0.0211

Gula pereduksi=(A+0,0211)x Fp

0.0036

Keterangan:

A = Absorbansi

Fp = Faktor pengenceran

100

Lampiran 8. Hasil Pengujian Daya Cerna Pati Menggunakan First Order

Kinetics

Perlakuan

K (min-1) C∞ (%)

Ulangan Rata-Rata

Ulangan Rata-Rata

I II I II

Alami 0,0081 0,0110 0,00955 ±

0,0021 0,9574 0,747

0,8520 ±

0,1491

Ozonasi 10 Siklus 0,0310 0,0187 0,02485 ±

0,0087 0,8389 1,0510

0,9449 ±

0,1500

Ozonasi 20 Siklus 0,0259 0,0266 0,02625 ±

0,0005 1,6283 1,247

1,4375 ±

0,2699 Keterangan:

K = Laju kinetika enzim; C∞= Banyaknya pati yang terhidrolisis

Perhitungan:

lndC

dt = ln(C∞k)-kt

Keterangan:

ln(C∞k) = intersep

-k = slope

101

Lampiran 9. Grafik Hasil Pengujian Daya Cerna Pati Menggunakan LOS Plot

Data Ulangan I

t ABS [maltosa] [MALTOSA] Nilai X

(mg/mL) %Hidrolisis

t

(t2+t2/2) dc/dt ln(dc/dt)

0 0.0005 6 0

5.19792

0 6.5 0.006554 -5.02763

13 0.049667 19.65741 13.6574074 0.08520588 15.5 0.008434 -4.77549

18 0.074 26.41667 20.4166667 0.12737557 22 0.005993 -5.11711

26 0.101667 34.10185 28.1018519 0.17532192 33 0.005075 -5.28339

40 0.142667 45.49074 39.4907407 0.24637496 45 0.005257 -5.24824

50 0.173 53.91667 47.9166667 0.29894265 62.5 0.00513 -5.27271

75 0.247 74.47222 68.4722222 0.42718472 90 0.005372 -5.2265

105 0.34 100.3056 94.3055556 0.5883538 112.5 0.002311 -6.07022

120 0.36 105.8611 99.8611111 0.62301382

y = -0.0081x - 4.8594

R² = 0.6712y = -0.011x - 4.8021

R² = 0.8056

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 20 40 60 80 100 120

LO

S

Waktu (menit)

Pati Pisang Kapas Alami

Ulangan I

Ulangan II

Linear (Ulangan

I)

Linear (Ulangan

II)

102

Data Ulangan II

t ABS [maltosa] [MALTOSA] Nilai X

(mg/mL) %Hidrolisis

t

(t2+t2/2) dc/dt ln(dc/dt)

0 0.015833 10.25926 0

5.19792

0 2.5 0.006643 -5.01417

5 0.035 15.58333 5.32407407 0.03321585 7 0.007365 -4.91098

9 0.052 20.30556 10.0462963 0.06267687 11 0.010254 -4.58013

13 0.075667 26.87963 16.6203704 0.10369122 31.5 0.005402 -5.22099

50 0.191 58.91667 48.6574074 0.30356399 55 0.005026 -5.29319

60 0.22 66.97222 56.712963 0.35382102 67.5 0.003466 -5.66475

75 0.25 75.30556 65.0462963 0.40581104 82.5 0.002349 -6.05369

90 0.270333 80.9537 70.6944444 0.44104873 97.5 0.003774 -5.5796

105 0.303 90.02778 79.7685185 0.49766009 112.5 0.002426 -6.02143

120 0.324 95.86111 85.6018519 0.53405311

103

Data Ulangan I

t ABS [maltosa] [MALTOSA] Nilai X

(mg/mL) %Hidrolisis

t

(t2+t2/2) dc/dt ln(dc/dt)

0 0.1285 41.55556 0

5.09796

0 2.5 0.028331 -3.56381

5 0.208667 63.82407 22.26852 0.14165300 11.5 0.011599 -4.45687

18 0.294 87.52778 45.97222 0.29243540 22 0.009939 -4.61126

26 0.339 100.0278 58.47222 0.37194956 43 0.009637 -4.64215

60 0.251667 151.537 109.9815 0.69960679 67.5 0.004555 -5.39155

75 0.271 162.2778 120.7222 0.76793007 82.5 0.002513 -5.98626

90 0.281667 168.2037 126.6481 0.80562567 97.5 0.002034 -6.19776

105 0.1865 173 131.4444 0.83613555 112.5 0.000353 -7.94792

120 0.1875 173.8333 132.2778 0.84143649

y = -0.031x - 3.6494

R² = 0.8855y = -0.0187x - 3.9295

R² = 0.9586

-9

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 20 40 60 80 100 120

LO

S

Waktu (menit)

Pati Pisang Kapas Ozonasi 10 Siklus

Ulangan I

Ulangan II

Linear (Ulangan I)

Linear (Ulangan II)

104

Data Ulangan II

t ABS [maltosa] [MALTOSA] Nilai X

(mg/mL) %Hidrolisis

t

(t2+t2/2) dc/dt ln(dc/dt)

0 0.106 35.30556 0

5.09796

0 2.5 0.022853 -3.77867

5 0.170667 53.26852 17.96296 0.114264791 7 0.017817 -4.0276

9 0.211 64.47222 29.16667 0.185533037 13.5 0.012369 -4.39257

18 0.274 81.97222 46.66667 0.296852859 22 0.011706 -4.44763

26 0.327 96.69444 61.38889 0.390502868 38 0.008548 -4.76208

50 0.211 128.9444 93.63889 0.595649397 62.5 0.007351 -4.91297

75 0.263 157.8333 122.5278 0.779415452 82.5 0.005183 -5.26234

90 0.285 170.0556 134.75 0.85716263 97.5 0.003016 -5.80394

105 0.1915 177.1667 141.8611 0.902397351 112.5 0.00212 -6.15616

120 0.1975 182.1667 146.8611 0.934203015

105

Data Ulangan I

t ABS [maltosa] [MALTOSA] Nilai X

(mg/mL) %Hidrolisis

t

(t2+t2/2) dc/dt ln(dc/dt)

0 0.155 97.83333 0

4.953573

0 6.5 0.030401 -3.49327

13 0.263667 158.2037 60.37037 0.395217459 18 0.019506 -3.93702

23 0.2045 188 90.16667 0.590280309 41.5 0.014671 -4.2219

60 0.304 270.9167 173.0833 1.133098154 67.5 0.012729 -4.36384

75 0.339 300.0833 202.25 1.324039104 82.5 0.00982 -4.62335

90 0.366 322.5833 224.75 1.471336409 97.5 0.003273 -5.72196

105 0.375 330.0833 232.25 1.520435511 112.5 0.001091 -6.82058

120 0.378 332.5833 234.75 1.536801878

y = -0.0259x - 3.166

R² = 0.819 y = -0.0266x - 3.4064

R² = 0.7936

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 20 40 60 80 100 120

LO

S

Waktu (menit)

Pati Pisang Kapas Ozonasi 20 Siklus

Ulangan I

Ulangan II

Linear (Ulangan I)

Linear (Ulangan II)

106

Data Ulangan II

t ABS [maltosa] [MALTOSA] Nilai X

(mg/mL) %Hidrolisis

t

(t2+t2/2) dc/dt ln(dc/dt)

0 0.142 90.61111 0

4.953573

0 4.5 0.039198 -3.23912

9 0.239 144.5 53.88889 0.352786137 11 0.027277 -3.6017

13 0.269 161.1667 70.55556 0.461895251 18 0.01302 -4.34124

23 0.196167 181.0556 90.44444 0.592098795 41.5 0.007421 -4.90339

60 0.2465 223 132.3889 0.866690066 82.5 0.010062 -4.59896

105 0.3295 292.1667 201.5556 1.319492891 112.5 0.00097 -6.93836

120 0.332167 294.3889 203.7778 1.334040773