A. METODE NON ENZIMATIK (SAMPEL : DARAH)

B. METODE NON ENZIMATIK (SAMPEL : KUNING TELUR)

C. METODE ENZIMATIK (CHOD–PAP) (SAMPEL : DARAH)

2

DASAR TEORI

HO

• Kolesterol : senyawa sterol tak jenuh• Merupakan konstituen dari batu empedu dan kuning telur, terdapat sebagai deposit pada dinding pembuluh darah. • Banyak terdapat dalam organ tubuh lainnya.• Kolesterol terdapat dalam jaringan hewan dan tidak terdapat pada tumbuhan.

• Kegunaan kolesterol : - Prekursor hormon steroid (testosteron, progesteron, estrogen) - Prekursor pembentukan asam folat. - Diperlukan dalam perkembangan embrio.• Kelebihan kolesterol : aterosklerosis• Pengetahuan kadar kolesterol : menegakkan diagnosis genetik - Kadar kolesterol naik, trigliserida normal kenaikan LDL - Kadar trigliserida naik, kolesterol normal kenaikan VLDL

3

ANALISA KUALITATIF(SAMPEL : KUNING TELUR / DARAH)

1. Uji Salkowski :

HO

H2SO4

- H2O

SO3Hkolesterol 3,5-kolastadienaAsam 3,5-kolastadiena sulfonat

- H2O

H2SO4

HO HO

Sesuai sampel pada uji kuantitatif

4

Bahan Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3Kuning telor 5 tetes - -Kolesterol 0,5% - - 2 mLKloroform 2 ml 2 ml 2 mLAsam asetat anhidrat 10 tetes 10 tetes 10 tetesH2SO4 pekat 2 tetes 2 tetes 2 tetes

Prosedur :1. Diambil bahan seperti pada tabel :

2. Kocok tabung perlahan-lahan

Lapisan kloroform : merahLapisan asam :kuning, flouresensi : hijau

3. Catat hasilnya ! Bandingkan dengan standard !

5

2. Uji Liberman Burchard :

HO

(CH3COO)2O

- CH3COOHH2SO4

-H2Okolesterol

3-asetokolesterolAsam 3-aseto-5-kolesterol sulfonat

H3CCOO H3CCOOSO3H

6

Prosedur :1. Diambil bahan seperti pada tabel :

Bahan Tabung 1 Tabung 2

Tabung 3

Kuning telur 5 tetes - -Kolesterol 0,5% - - 2 mLKloroform 2 ml 2 ml 2 mLAsam asetat anhidrat 10 tetes 10 tetes 10 tetesH2SO4 pekat 2 tetes 2 tetes 2 tetes

2. terjadi warna merah (cepat)

berubah menjadi biru

Hijau

3. Catat hasilnya ! Bandingkan dengan standard !

7

ANALISA KUANTITATIFMETODE NON ENZIMATIK (Sampel : kuning telur)

Dasar Metode

Intensitas warna hijau : berbanding lurus dengan kadar dapat diukur secara kuantitatif

HO

(CH3COO)2O

- CH3COOH

H2SO4

-H2O

kolesterol

3-asetokolesterol

Asam 3-aseto-5-kolesterol sulfonat

OS OO

OH

Gugus kromofor yang dapat diukur secara spektrofotometri visibel

OC

OCH3 C

OH3C

8

Langkah2 penentuan kadar

1. Penentuan waktu operasi (OT)

- Tujuan dilakukan penentuan OT : untuk mencari waktu pembacaan serapan yang stabil

Prosedur : - Salah satu larutan baku kolesterol (misalnya 0,3 mg/mL) - Diambil 2,0 mL + 2 mL pereaksi Liberman-Burchard - Dibaca absorbansinya pada λ maks yang sudah dicari sebelumnya)

Contoh :

0 10 30 50 70 100 120 140 160 180 200 220 2400

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Waktu (detik)

Absorbansi

OT : 100 – 200 detik waktu pengukuran sampel & standard antara 100 – 200 detik setelah pereaksi ditambahkan

9

2. Penentuan panjang gelombang maksimum (λ maks)

- Tujuan dicari λ maks: untuk mencari panjang gelombang yang menghasilkan serapan maksimum.

Prosedur : - Salah satu larutan baku kolesterol (misalnya 0,3 mg/mL) - Diambil 2,0 mL + 2 mL pereaksi Liberman-Burchard - Dibaca absorbansinya pada λ antara 661 – 680 nm

Contoh :

660 662 664 666 668 670 672 674 678 680 6820

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

(λ nm)

Absorbansi

λ maks : 670 nm

10

3. Pembuatan kurva baku

- Kegunaan kurva baku: untuk menghitung kadar

- Buat baku kolesterol 1 mg/mL (dalam dikloroetana). - Buat seri larutan baku kolesterol, misal : 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5

mg/mL (dalam dikloroetana). - @ diambil 2,0 mL + 2 ml pereaksi Liberman-Burchard. - Tempatkan dalam ruang gelap ad warna hijau (sesuai hasil OT). - Baca serapannya dengan spektrofotometer visibel pada λ maks

Contoh

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.70

0.050.1

0.150.2

0.250.3

0.350.4

0.45

C (mg/mL)

Absorbansi

LRy = 0,4216 x + 0,09183R : 0,9844

4. Preparasi dan penentuan kadar sampel

1 butir telur ditimbangcangkangKuningPutih

ditimbang

1 g kuning telur10 mL aseton: alkohol (1:1)

w. b

disentrigugasi 15' pd 2500 rpm

dinginkan

diambil & diuapkan

Residu + 1 mL dikloroetana + 2 mL pereaksi Liberman-Burchard

di Ruang gelap sesuai OTDibaca abs pd lambda maks

12

5. Perhitungan kadar sampel

y = 0,4216 x + 0,09183 y : Absorbansi sampel x : kadar sampel (mg/mL)

W = x mg/ mL X 2 mL W = .... mg g

Kandungan kolesterol =berat kolesterol (W)

berat bahanX 100%

13

Sampel : darah1. Penentuan λ maks (seperti sampel kuning telur)

2. Penentuan OT (seperti sampel kuning telur)

3. Penentuan kadar kolesterol

a. Diambil reagen seperti pada tabel : preparasi darah = metode enzimatik

b. Ditempatkan ruang gelap sesuai OT dan dibaca serapannya pd λ maks

c. Hitung kadar kolesterol

blanko Larutan sample/standard

Supernatan darah/ standard - 200 µlAquadest 200 µl -Pereaksi Liberman-Burchard 2000 µl 2000 µl

Kadar kolesterol =AsAb

x Kadar standard (mg/dL)

14

METODE ENZIMATIK Cholesterol Oxidase Phenol Aminoantipyrin (CHOD-PAP)

Dasar Metode :

• Penguraian kolesterol dan esternya menjadi peroksida dengan hidrolisa dan oksidasi enzimatik. • Perooksida kemudian bereaksi dengan 4-aminoantipyrin dan fenol Quinoneimine

Reaksi :

H2OCholesterol ester Cholesterol Fatty acid

Cholesterol O2CHO

Cholesterol teroksidasi H2O2

2 H2O2 4-Aminoantipyrin Phenol POD Quinoneimine 4 H2O

CHE

15

1. Penentuan lambda maks

2. Preparasi sampel darah

Darah disentrifugasi 20' pd 3200 rpm

200 mikro L + reagen pengendapdiamkan pd T kamar

disentrigugasi 15' pd 2500 rpm, diamkan 2 jam

diambil

16

2. Penentuan kadar kolesterol a. Diambil reagen seperti pada tabel :

b. Diinkubasi 20’ suhu 20–25°C atau 10’ suhu 37°C, serapan dibaca 60’ terhadap blanko pd λ maks

c. Hitung kadar kolesterol :

Kadar kolesterol =AsAb

x Kadar standard (mg/dL)

blanko Larutan sample/standardSupernatan / standard - 10 µlAquadest 10 µl -Reagen CHOD-PAP 1000 µl 1000 µl

17

SEKIAN

TERIMA KASIH