Kromatografi lapis tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya.KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatifatau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (Gritteret al,1991).KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografidan isolasi senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0.Pelaksanaan KLT1.Fase DiamFase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerapberukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 m. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalahadsorpsidanpartisi(Gandjar & Rohman, 2007).2.Fase GerakFase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :1.Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.2.Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.3.Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan (Gandjar & Rohman, 2007).Tabel 2.1.Beberapa Sistem Pemisahan dengan KLT dari Bahan Alam (Gibbons, 2006)EluenFase DiamKeterangan

Heksan : Etil asetatSilika GelSistem umum yang digunakan

Petrol : DietileterSilika GelSistem umum yang digunakan untuk senyawa nonpolar seperti terpen dan asam lemak

Petrol : KloroformSilika GelBerguna untuk pemisahan derivat asam sinamat dan kumarin

Toluen : Etil asetat : Asam asetat (TEA)Silika GelKomposisi 80:18:2 v/v atau 60:38:2 v/v baik untuk pemisahan metabolit asam

Kloroform : AsetonSilika GelSistem umum untuk produk dengan polaritas sedang

n-Butanol : Asam Asetat : AirSilika GelSistem polar untuk flavonoid dan glikosida

Metanol : AirC18Dimulai dengan metanol 100% dilanjutkan dengan penambahan konsentrasi air

Asetonitril : AirC18Sistem umumReverse phase

Metanol : AirSelulosaMemisahkan senyawa dengan kepolaran tinggi seperti gula dan glikosida

3.Penotolan SampelUntuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 l. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 l, maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan (Gandjar & Rohman, 2007).4.PengembanganBila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel.Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak sedikit mungkin,akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan. Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah mencapai ujung dari kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh (Gandjar & Rohman, 2007).

5.Deteksi BercakDeteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas (Gandjar & Rohman, 2007).Deteksi senyawa dilakukan dengan menggunakan detektor UV di bawah sinar UV 254 nm, indikator pada plat KLT akan memancarkan warna hijau dan pada UV 366 nm akan memancarkan warna ungu. Komponen yang menyerap cahaya pada 254 atau 366 nm akan tampak sebagai bercak gelap pada plat yang bercahaya (Gibbons, 2006). Metode deteksi lain adalah dengan menggunakan pereaksi semprot. Pereaksi semprot yang umum digunakan dapat dilihat pada tabel 2.2.Tabel 2.2. Beberapa Jenis Pereaksi Semprot untuk KLT (Gibbons, 2006)Pereaksi semprotKomposisiPerlakuanKeterangan

Vanilin asam sulfat1 gram vanilin dalam asam sulfat pekatDisemprot dan dipanaskan hingga muncul warnaPereaksi umum yang digunakan. Terpen akan menghasilkan warna merah atau biru

Asam fosfomolibdatAsam fosfomolibdat 5% b/v dalam etanolDisemprot dan dipanaskan hingga muncul warnaUntuk mendeteksi terpen dengan bercak biru berlatar kuning

Reagen Dragendorff10 mL larutan KI 40% ditambahkan dengan 10 mL larutan 0,85 gram bismuth subnitrat dalam 10 mL asam asetat dan 50 mL air. Larutan tersebut diencerkan dalam 10 mL asam asetat dan 50 mL airJika reaksi tidak spontan maka diperlukan pemanasanDeteksi alkaloid menghasilkan warna oranye pekat hingga merah

BAB IPENDAHULUAN

1.1.Latar BelakangBerbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat dilaboratorium kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan , dan kromatografi preparatif hanya dilakukan juka diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah : (1) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), (2) Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan), dan (3) Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian) (Roy, 1991).Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa teknik kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda (Anggraeni, Megawati, 2009).Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang berdasarkan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Uraian mengenai kromatografi pertama kali dijelaskan oleh Michael Tswett, seorang ahli biotani Rusia yang bekerja di Universitas Warsawa ( Sudarmadji, 2007 ). Pada saat itu, Michael Tswett melakukan pemisahan klorofil dari pigmen-pigmen lain dari ekstrak tanaman menggunakan kromatografi kolom yang berisi dengan kalsium karbonat. Pada kromatografi, komponen- komponen yang akan dipisahkan berada diantara dua fase yaitu fase diam ( stationary ) dan fase bergerak ( mobile ). Fase diam adalah fase yang akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak adalah fase yang akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal atau tidak bergerak sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat (Sudarmadji, 2007).Pemisahan komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap dengan sifat daya serap masing-masing komponen. Komponen yang terlarut akan terbawa oleh fase diam (penyerap) dengan membandingkannya dengan standar yang sangat memakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama. Dalam hal ini untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang sama (Gandjar, 2008).Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya menggunakan lapis tipis silica atau alumina yang seragam pada sebuah lempengan gelas atau logam atau plastic yang keras. Gel silica atau alumina mengandung substansi dimana substansi tersebut dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina (aluminum oksida). Sedangkan fase gerak kromatografi disebut juga dengan eluent. Eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Pemisahan komponen sangat dipengaruhi oleh adanya interaksi antara adsorbent dan eluen. Dalam kromatografi lapis tipis, eluen biasanya disebut sebagai larutan pengembang ( Kantasubrata, 1993 ).Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan 2 sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis. Nilai Rf dapat di jadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila di identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan bila nilai Rf nya berbeda, senyawa tersebut dapat di katakan merupakan senyawa yang berbeda (Lipsy, 2010).

1.2.Perumusan MasalahRumusan masalah dalam makalah ini antara lain:Apa pengertian kromatografi lapis tipis?Bagaimana prinsip kerja kromatografi lapis tipis?Bagaimana prosedur kerja pada pemisahan sampel menggunakan kromatografi lapis tipis?Apa saja fase diam dan fase gerak dalam kromatografi lapis tipis?Apa saja kelebihan dari kromatografi lapis tipis?Bagaimana aplikasi kromatografi lapis tipis dalam dunia farmasi?

1.3.Tujuan PenulisanTujuan dari penulisan makalah ini adalah agar mahasiswa dapat memahami mengenai kromatografi lapis tipis sehingga dapat mengaplikasikannya.

BAB IIPEMBAHASAN

2.1. Pengertian Kromatografi Lapis Tipis (KLT)Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya pembedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion. Atau secara sederhana kromatografi biasanya juga di artikan sebagai teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Kromatografi di gunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponen. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip ini.Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin di deteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisika-kimia dengan fase gerak (larutan pengembang yang cocok), dan fase diam (bahan berbutir) yang diletakkan pada penyangga berupa plat gelas atau lapisan yang cocok. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan) lalu hasil pengembangan di deteksi. Zat yang memiliki kepolaran yang sama dengan fase diam akan cenderung tertahan dan nilai Rf-nya paling kecil. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang.Pada identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah berwarna dapat langsung diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rfmerupakan nilai dari Jarak relative pada pelarut. Harga Rfdihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak tempuh oleh eluen (fase gerak) untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:Rfjuga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam. Karena itu Rfjuga disebut factor referensi.Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga Rf adalah :Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga Rfmeskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama, jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.Teknik percobaan.Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).Jumlah cuplikan yang digunakan.Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.Suhu.Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase.Kesetimbangan.Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.Semua kromatografi memilikifase diam(dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) danfase gerak(berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda.Sedangkan fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Namun, apabila di sinarkan dengan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.Sementara UV tetap di sinarkan pada lempengan, harus dilakukan penandaan posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Ketika sinar UV dimatikan, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.

Gambar:Bercak yang ditimbulkanolehsinar UV

Gambar : Sebelum dan sesudah di lakukannya kromatografi pada plat KLT

2.2. Prinsip Kerja KLTPada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadihubungan kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul.Pada kromatografi lapis tipis,eluentadalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antaraadsorbentdenganeluentsangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen secarakromatografi dipengaruhi oleh laju alireluentdan jumlah umpan.Eluentdapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenisadsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip like dissolved like.

2.3. Prosedur Kerja Pemisahan dengan KLTGel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan gel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.Jadi, pada permukaan gel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.

Permukaan gel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai di sekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.Pada kromatografi lapis tipis, fase diam berupa plat yang biasanya disi dengansilica gel. Sebuah garis pensil di gambar dekat bagian bawah fase diam dan setetes larutan campuran ditempatkan di atasnya. Garis pada fase diam berguna untuk menunjukkan posisi asli campuran.Pembuatan garis harus menggunakan pensil karena jika semua ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta juga akan bergerak sebagai kromatogram berkembang. Ketika titik campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri dalam gelas tertutup yang telah berisi fasa gerakdengan posisi fase gerakdi bawah garis. Digunakan gelas tertutup untuk memastikan bahwa suasana dalam gelas jenuh dengan uap pelarut.Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik, komponen-komponen yang berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna yang berbeda.

Gambar tersebut menunjukkan plat setelah pelarut telah bergerak. Pelarut diperbolehkan untuk naik hingga hampir mencapai bagian atas plat yang akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen pewarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.Jarak yang ditempuh pelarut

Untuk identifikasinya dapat di gunakan harga Rfmeskipun harga-harga Rfdalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Seperti halnya pada kertas harga Rfdidefinisikan sebagai berikut :

Harga-harga Rfuntuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rfyang diperoleh berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun daftar dari harga-harga Rfuntuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh.

2.4. Fase Diam dan Fase Gerak KLTPada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Semua kromatografi memilikifase diam(dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) danfase gerak(berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda.Fase DiamPelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika gel atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH.Fase GerakDalam kromatografi,eluentadalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antaraadsorbentdenganeluentsangat menentukan terjadinya pemisahan komponen.Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut.Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika).Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan tergantung pada:Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut, Hal ini bergantung pada bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya gel silika. Hal ini tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan gel silika.2.5. Kelebihan Metode Kromatografi Lapis TipisBeberapa keuntungan dari kromatografi lapis tipis ini adalah sebagai berikut :Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisaKetepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.Hanya membutuhkan sedikit pelarut.Waktu analisis yang singkat (15-60 menit)Investasi yang kecil untuk perlengkapan (Biaya yang dibutuhkan ringan).Preparasi sample yang mudahKemungkinan hasil palsu yang disebabkan oleh komponen sekunder tidak mungkinKebutuhan ruangan minimumAnalisis KLT banyak digunakan karena :Waktu yang diperlukan untuk analisis senyawa relatif pendekDalam analisis kualitatif dapat memberikan informasi semi kuantitatif tentang konstituen utama dalam sampelCocok untuk memonitor identitas dan kemurnian sampelDengan bantuan prosedur pemisahan yang sesuai, dapat digunakan untuk analisis kombinasi sampel terutama dari sediaan herbal.

2.6. Aplikasi Metode KLT Dalam Bidang FarmasiContoh penggunaan metode pemisahan secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat diterapkan dalam menganalisis adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat paten seperti poldanmig yang beredar di pasaran apakah memenuhi persyaratan mutu obat atau tidak. Sehingga dengan kadar yang tepat obat dapat memberikan efek terapi yang dikehendaki.Setiap komponen memiliki harga Rfsendiri-sendiri, dengan bantuan dari sinar ultraviolet maka dapat ditentukan noda yang tidak tampak oleh kasat mata. Cara yang biasa dilakukan dengan menyemprotkan KMNO4dalam H2SO4yang kemudian akan berinteraksi dengan komponen-komponen sampel baik secara kimia maupun berdasarkan kelarutan membentuk warna-warna tertentu.Noda kemudiandihitung harga Rf-nya. Harga Rf dihitung dengan menggunakan perbandingan jarak yang ditempuh solut dengan jarak yang ditempuh fase gerak. Nilai maksimum Rf adalah 1 dan nilai minimumnya 0. Dengan menggunakan silika gel sebagai fase diam, harga Rf 1 menunjukkan jika senyawa tersebut sangat nonpolar sedangkan harga Rf 0 menunjukkan bahwa senyawa tersebut sangat polar.

BAB IIIPENUTUP

3.1. KesimpulanKromatografi biasanya juga di artikan sebagai teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu.Kromatografi lapis tipismerupakan salah satuanalisiskualitatifdari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponensampelberdasarkan perbedaan kepolaran.Prinsip kerja kromatografi lapis tipis adalah terjadinyahubungan kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Semakin dekat kepolaran antara senyawa denganeluentmaka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut, sesuai dengan prinsip like dissolve like.Pada prosedur pengerjaannya Pelarut (fase gerak) perlahan-lahan bergerak naik, komponen-komponen yang berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna yang berbeda.Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak.Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet, Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisa, dan masih banyak lagi keuntungan lainnya.Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat diterapkan dalam menganalisis adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat paten seperti poldanmig.

Kromatografi Lapis Tipis ( KLT ) adalah suatu cara pemisahan yang berdasar pada pembagian campuran dua senyawa dalam dua fasa dimana fasa gerak bergerak terhadap fasa diam. Fasa diam berupa suatu bidang datar.

Keuntungan dari metode Kromatografi Lapis Tipis adalah :Pemisahan yang amat baik (noda yang dipisahkan lebih jelas dan terlokalisir)Waktu yang diperlukan lebih singkatAlat yang dipakai lebih sederhana dan relative murah

Kerugiannya :Sukar dalam penyimpanannyaKetelitian dan ketepatannya kurang baik

Teori Kromatografi Lapis Tipis umumnya sama dengan teori dari kromatografi kolom. Pada Kromatografi Lapis tipis derajad retensi dinyatakan sebagai faktor penghambatan (Retardation factor = Rf)

Jarak gerakan zat terlarut Jumlah mol zat terlarut dalam fasa gerak Rf =------------------------- =----------------------------------Jarak gerakan pelarut Jumlah mol zat terlarut dalam kedua fasaJarak gerakan pelarut diukur sampai bidang batas pelarutJarak gerakan zat terlarut diukur sampai tengah-tengah bercak atau titik kerapatan maksimum

Jarak lintasan yang ditempuh rata-rata molekul zat terlarut = kecepatan pelarut x waktu yang dihabiskan dalam fasa gerak. Faktor penghambatan (Rf) dapat dinyatakan sebagai perbandingan jumlah molekul dalam masing-masing fasa atau sebagai pembagian zat terlarut antara dua fasa.Harga Rf merupakan bentuk modifikasi dari tetapan keseimbangan dan bergantung pada ukuran-ukuran retensi seperti halnya pada kromatografi kolom.Nilai Rf dipengaruhi oleh beberapa variable seperti : penyerap, cara pengembangan, ukuran dan kadar cuplikan, jarak perjalanan bercak serta macam eluen yang dipakai. Oleh karena itu akan lebih baik jika digunakan nilai Rf relatif terhadap Rf baku yaitu perbandingan jarak perjalanan yang ditempuh bercak sampel dengan jarak perjalanan yang ditempuh zat baku dalam pengembangan yang sama.

2.TeknisEksperimentala.Garis Besar MetodaDibuat dahulu lapisan tipis dari bahan penyerap pada fasa pendukung yang inert (kaca). Serbuk bahan penyerap yang halus dibuat bubur dengan air atau pelarut organik yang mudah menguap. Bubur tersebut kemudian diratakan pada lempeng pendukung dengan suatu alat dan dengan ketebalan yang dapat diatur. Sesudah kering lempeng lapis tipis tersebut diaktifkan dengan cara dipanaskan pada suhu 100oC selama paling sedikit 30 menit. Jika aktivasi telah dijalankan lempeng disimpan dalam eksikator, atau tempat lain yang bebas dari kelembaban. Setiap kali akan digunakan lempeng sebaiknya diaktifkan lagi.Sampel dilarutkan dalam pelarut organik yang mudah menguap dan sesuai. Dengan pipet kapiler atau pipet micrometer, larutan sampel ditotolkan sedikit-sedikit dengan bercak sekecil mungkin. Dibiarkan kering sebentar, kemudian dimasukkan ke dalam bejana pengembangan yang telah dibuat jenuh dengan uap pelarut pengembang/solvent. Fasa gerak dibiarkan mengembang dan sedudah mencapai batas yang diinginkan lapisan tipis diambil dan dibiarkan kering, kemudian dilakukan penentuan lokasi dan identifikasi bercak dengan cara kimia, fisika atau biologi.

b.Fasa DiamFasa diam yang digunakan dalam Kromatografi Lapis Tipis adalah bahan penyerap (adsorbent). Sifat umum dari bahan penyerap untuk Kromatografi Lapis Tipis sama dengan yang digunakan untuk Kromatografi Kolom. Dua sifat penting yang harus diperhatikan untuk Kromatografi Lapis Tipis adalah besar/kecilnya (ukuran) serta homogenitasnya, sebab daya lekat pada pendukung sangat ditentukan oleh kedua sifat tersebut. Partikel yang kasar tidak dapat memberikan pemisahan yang baik dan untuk memperbaikinya dapat digunakan butiran yang halus. Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1 25 mikron. Berbeda dengan tujuan untuk kromatografi kolom, dimana partikel yang kecil dan halus dapat memperlambat aliran pelarut, sedang pada Kromatografi Lapis Tipis malahan akan mempercepat aliran pelarut.Beberapa macam bahan penyerap yang digunakan dalam Kromatografi Lapis Tipis :1)Silika gelPaling banyak dipakai dan bersifat asam, zat pengikatnya untuk memberikan kekutan pada lapisan dan menambah adisi pada gelas penyokong, biasanya dalah Kalsium sulfat (CaSO4 ) = Plaster of Paris = Gypsum.Dalam perdagangan biasanya silica gel telah diberi zat pengikat misalnya Silica gel G Merck. Suspensi silica gel yang G telah dicampur dengan air harus dipakai paling lambat 3 4 menit sesudah dibuat. Disamping Kalsium sulfat (CaSO4) semihidrat dapat pula dipakai tepung beras sebagai pengikatnya, tetapi kurang baik. Jika zat yang dipisahkan basa-basa, maka pelarut sebaiknya mengandung sedikit Amonium hidroksida atau dietilamin (1 % ). Jika asam-asam yang akan dipisahkan perlu ditambah asam asetat (1 % ). Asam dan basa ini bersifat pertolongan aditif sebagai buffer untuk zat yang akan dipisahkan akan tetap dalam bentuk non ionik, sehingga dapat memberikan noda yang kompak. Disamping air dapat pula dipakai pelarut organik misalnya aseton, atau kloroform dan metanol ( 2 : 1) untuk membuat pastanya. Untuk memudahkan identifikasi ditambah lagi dengan zat yang berfluoresensi sehingga dikenal Silica gel GF.Beberapa tipe silica gel :a)Silika gel G : Silika gel dengan zat pengikat, yang biasa digunakan adalah CaSO4 dengan kadar antara 5 15 %.b)Silika gel S : Silika gel yang menggunakan zat tepung (pati) sebagai zat pengikat. Tetapi penggunaan pati sebagai pengikat mempunyai kelemahan, terutama jika penentuan lokasi bercak dengan asam sulfat dan atau Iodium.c)Silika gel GF 254 : Silika gel dengan pengikat dan indikator fluoresensi. Jenis silica gel ini biasanya berfluoresensi kehijauan jika dilihat pada sinar ultra violet panjang gelombang pendek. Sebagai indikator biasanya digunakan Timah Kadmium Sulfida atau Mangan Timah Silika aktif.d)Silika gel H / N : Silika gel tanpa pengikat. LApisan ini dibandingkan dengan yang mengandung CaSO4, menunjukkan hasil yang lebih stabil.e)Silika gel HF254 : Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indikator fluoresensi.f)Silika gel PF 254 = 366 : Silika gel untuk keperluan preparatif yang mengandung campuran dua indikator untuk cahaya ultra violet panjang gelombang panjang dan pendek.g)Silika gel modifikasi Silika gel yang ditambah dengan polisiloxane biasanya disebut silika gel Silanised dan digunakan untuk Kromatografi Lapis Tipis fasa terbalik.2)AluminaAlumina atau aluminium oksida ( Al2O3 ) suatu adsorban yang sedikit bersifat basis.Tetapi kini dalam perdagangan ada juga yang bersifat asam dan netrala)Al2O3 bersifat basis ( pH = 9 )b)Al2O3 bersifat netral ( pH = 7,5 )c)Al2O3 bersifat asam ( pH = 4 )Daya menyerapnya tidak sekuat silika gel. Tidak baik untuk memisahkan asam-asam karena akan diikat lebih kuat pada adsorben dan sangat susah bergerak. Edge effect disebabkan penyerapan yang tidak rata dari pelarut. Komponen yang mudah menguap,pada sisi keping lapis lebih mudah daripada di tengahkarena itu harga Rf makin ke pinggir (sisi) makin besarperlu penjenuhan, dipakai kertas saring pada sisi bejana.Terutama dipakai untuk memisahkan basa-basa.3)SelulosaPenyerap jenis ini dapat digunakan dengan atau tanpa bahan pengikat. Pada Kromatografi Lapis Tipis, penyerap ini terdapat sebagai butiran-butiran yang halus dan ukurannya sama, berbeda seperti pada Kromatografi kertas dimana selulosa berupa serabut. Lapisan tipis yang dibuat dari sellulosa mempunyai ruang antara yang lebih kecil,akan tetapi lebih teratur sehingga aliran pelarut lebih cepat dan peristiwa difusi lebih sedikit.4)SephadexJenis penyerap ini yang digunakan pada Kromatografi Lapis Tipis mempunyai ukuran 10 40mm dan digunakan untuk pemisahan zat atas dasar perbedaan besar molekul seperti protein, hormon, enzim, asam amino dan lain lain.5)Kiesulguhr ( Diatomaceus earth )Adalah suatu adsorben yang netral, tetapi daya adsorpsinya lebih lemah daripada silika gel atau alumina dan mempunyai daya pemisahan lebih kecil. Dapat ditambahkan pada silika gel untuk mendapatkan bentuk yang kurang aktif, untuk memisahkan zat-zat yang sangat polar misalnya : karbohidrat, asam-asam amino.6)Magnesium silikat1 bagian Magnesium silikat dengan 3 bagian air dikocok dan dioleskan.

Bahan penyerap yang digunakan dalam Kromatografi Lapis Tipis

Bahan penyerapDigunakan untuk memisahkan

Silika gelAsam amino, alkaloid, gula, asam-asam lemak, lipida, mimyak menguap, anion dan kation organik, steroid dan terpenoid

AluminaAlkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin,karotenoid dan asam amino

KeisulguhrGula, oligosakarida, asam-asam lemak, trigliserida, asam-asam amino, steroid

Serbuk selulosaAlkaloid,asam amino dan nukleotid

Pati ( Amylum )Asam amino

SephadexAsam amino dan protein

PoliamidaProtein, asam-asam aromatik, antioksidan, antosianin dan flavonoid

c.Fasa GerakPemilihan fasa gerak untuk Kromatografi Lapis Tipis tergantung pada faktor yang sama pada pemilihan fasa gerak untuk keperluan Kromatografi Kolom penyerapan. Sebaiknya digunakan pelarut yang polaritasnya rendah sebab pelarut dengan polaritas yang tinggi sifat kromatografi berubah menjadi kromatografi pembagian, disamping itu pelarut tersebut dapat mempermudah lepasnya/rusaknya lapisan tipis. Selain pelarut tunggal dapat juga digunakan campuran pelarut tetapi sebaiknya jangan lebih dari 3 jenis pelarut sebab campuran yang lebih kompleks akan cepat mengalami perubahan-perubahan fasa terhadap perubahan suhu.Kemurnian pelarut penting karena dalam hal ini digunakan untuk pemisahan sampel dengan jumlah sedikit.

Skema hubungan antara fasa diam, gerak dan senyawa yang dipisahkanUntuk memisahkan senyawa hidrokarbon dengan cara kromatografi penyerapan, maka hidokarbon yang jenuh akan sukar diadsorpsi hingga perjalanannya paling cepat. Hidrokarbon yang mempunyai ikatan rangkap akan lebih kuat diserap dan banyak ikatan rangkapnya makin kuat penyerapannya. Adanya gugus fungsional akan menaikkan afinitas adsorpsi, dimana akan bertambah menurut urutan berikut : CH3, OR ( Alkali ), C=O ( Karbonil ), NH2 ( Amina ), OH ( Hidroksil ) dan COOH ( Karboksil ). Maka untuk memisahkan hidrokarbon yang banyak mempunyai ikatan rangkap diperlukan yang aktif dan pelarut yang polar. Untuk penentuan fasa gerak dan diam pada pemisahan suatu senyawa maka dapat dilakukan pergerakan dari segitiga ke tengah. Misalnya unrtuk pemisahan senyawa non polar (lipida), pertama-tama ujung segitiga digerakkan ke kata non polar dari senyawa yang dipisahkan. Dua ujung segitiga lain akan menuju angka I pada aktivitas fasa diam dan kata non polar pada deret Eluotropik pada fasa gerak. Artinya untuk memisahkan senyawa yang non polar ( misal lipida atau hidrokarbon ) harus digunakan bahan penyerap yang aktif dan pelarut yang kurang polar.

d.Pembuatan lapisan tipisPendukung yang biasa digunakan adalah kaca dengan ukuran 20 x20 cm atau 20 x 10 cm. Permukaan pendukung harus rata dan bebas noda lemak. Kadang-kadang untuk pemisahan secara cepat dan untuk keperluan kualitatif dapat digunakan obyek gelas yang digunakan pada mikroskop.Bahan penyerap dibuat bubur dengan air dengan perbandingan 1 bagian penyerap dengan 2 bagian air. Bila dipakai bahan penyerap yang mengandung bahan pengikat, maka pembuatan bubur sampai lapisannya harus selesai dalam waktu 4 menit, sebab setelah itu akan terjadi pengerasan. Kadang-kadang dapat ditambahkan pula suatu zat yang berfluoresensi.Pada kromatografi lapis tipis, tebal lapisan merupakan faktor penting pada pola pemisahan komponen, biasanya tebal lapisan 0,25 mm tetapi untuk keperluan preparatif tebal lapisan dapat lebih tebal ( 0,5 2,0 mm ).Pada waktu pemanasan, lapisan yang amat tipis memberikan hasil pemisahan yang tidak tetap.Pembuatan lapisan tipis dapat dilakukan dengan 4 cara :1)PembentanganCara yang biasa dilakukan adalah wadah tempat bubur, bahan penyerap digerakkan pada kaca yang berkedudukan tetap. Ada juga cara pembentangan dimana kaca yang bergerak.2)PenuanganBahan penyerap yang sangat halus, homogen dan tidak mengandung bahan pengikat dituangkan pada pendukung dan dibiarkan mengalir sampai rata. Cara penuangan ini biasanya dilaksanakan untuk alumina sebagai bahan penyerap dan sebagai cairan adalah pelarut yang mudah menguap3)PenyemprotanDengan cara ini sukar didapat lapisan yang rata dan ketebalannya sukar diketahui.4)PencelupanCara ini terutama untuk pembuatan lapisan dengan ukuran kecil seperti sebesar gelas mikroskop. Dapat dilakukan dengan mencelupkan pendukung ke dalam bubur bahan penyerap dalam pelarut yang mudah menguap.Tebal lapisan yang pasti tidak diketahui dan kadang-kadang kurang rata. Untuk kualitatif cara ini cukup memadai.

Lapisan tipis yang sudah jadi dan kering kemudian diaktifkan dengan jalan dipanaskan pada 100 oC selama 30 menit dan kemudian disimpan dalam eksikator. Pada saat ini telah banyak diperdagangkan lapisan tipis yang kebanyakan lebih baik, kompak, rata dan memberikan pemisahan yang sempurna.

e.PengembanganBila cuplikan telah ditempatkan maka kemudian lapisan dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan uap pelarut yang digunakan. Tepi bagian bawah dicelupkan ke dalam fasa gerak (pelarut) kira-kira 0,5 1 cm.Bejana kromatografi harus ditutup rapat, kalau dapat volumenya sekecil mungkin serta tidak berhubungan dengan atmosfir di luar bejana. Untuk penjenuhan bejana biasanya pada dindingnya dilapisi kertas saring yang tercelup dalam fasa gerak.

Ada tiga cara pengembangan dalam Kromatografi Lapis Tipis :1)MenaikCara yang umum digunakan2)MenurunDimaksudkan untuk memperpanjang jarak gerakan. Komponen yang mempunyai nilai Rf kecil dapat terpisah dengan baik. Lapisannya tebal, fasa geraknya kental.3)MendatarPengembangan mendatar dapat berupa pengembangan satu arah ataupun radial.

Pengembangan satu arah dimaksudkan untuk pemisahan dengan suhu yang lebih rendah dari suhu kamar, dapat dikerjakan dengan menggunakan alat pendingin. Pengembangan radial digunakan dengan memenfaatkan efek konsentrasi dan penyebaran zona-zona dalam garis-garis tipis dan bukan sebagai bercak-bercak. Dengan cara ini dapat dipisahkan komponen-komponen yang mempunyai harga Rf berdekatan. Pengembangan radial, fasa geraknya dialirkan dengan sumbu atau pompa melalui pipa kapiler di tengah lapisan, senyawa terlarut bergerak cepat dari tengah totolanlingkaran.

f.Deteksi Bercak PemisahanBercak pemisahan pada Kromatografi Lapis Tipis umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna dan untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika maupun biologi.1)Cara kimiaYang biasa digunakan adalah direaksikan dengan suatu pereaksi sehingga noda jadi tampak terlihat. Pada Kromatografi Lapis Tipis tidak dilakukan dengan cara pencelupan tetapi penyemprotan. Untuk senyawa organik dapat dilakukan dengan disemprot dengan asam sulfat pekat dan kemudian dipanaskan pada 200 oC selama 10 menit. Bercak dari senyawa organik akan berwarna hitam. Pereaksi lain untuk senyawa organik adalah Iod. Lapisan yang berisi hasil pemisahan diletakkan dalam bejana tertutup yang telah diisi dengan kristal Iod. Dibiarkan beberapa saat untuk memberi kesempatan terjadinya uap Iod. Warna bejana ungu, sedang bercak berwarna coklat, senyawa organik tidak jenuh akan tidak berwarna. Jika dikeluarkan, warna bercak akan cepat hilang, sehingga perlu cepat-cepat menandai bercak. Keuntungan Iod sebagai penampak bercak adalah tidak merusak senyawa. Untuk senyawa-senyawa lain, kadang-kadang dapat digunakan pereaksi yang spesifik untuk senyawa tersebut.2)Cara fisikaYang dapat digunakan untukmenampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif dan fluoresensi sinar ultra lembayung. Fluoresensi sinar ultra lembayung terutama untuk senyawa yang dapat berfluoresensi maka bercak akan terlihat jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluoresensi maka bahan penyerapannya yang diberi indikator yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan kelihatan hitam sedang latar belakangnya yang kelihatan berfluoresensi.3)Cara biologi4)Dapat digunakan untuk senyawa yang misalnya mempunyai aktivitas biologis, seperti anti bakteri atau dapat menghidrolisis.Lapisan hasil pemisahan dialiri dengan suspensi bakteri misalnya, maka pada bercak itu akan terlihat tidak adanya pertumbuhan bakteri.

g.Identifikasi Harga RfFaktor yang mempengaruhi harga Rf1)Bahan penyerap, sifat dan aktivitasnyaPenyerap yang berbeda memberikan hasil pemisahan yang berbeda walaupun fasa gerak dan bahan yang dipisahkan sama. Harga Rf dipengaruhi oleh aktivitas dari bahan penyerap karena dapat mempengaruhi daya adsorpsi. Aktivitas dapat dicapai dengan pemanasan yang berarti pengusiran terhadap molekul-molekul air.

2)Tebal dan kerataan dari lapisanKetidakrataan lapisan menyebabkan aliran fasa gerak tidak sama sehingga harga Rf juga tidak sama. Tebal baku yang biasa digunakan adalah 0,25 mm3)Kemurnian fasa gerakPelarut yang tidak murni akan memberikan pemisahan yang kurang baik. Demikian juga jika digunakan fasa gerak yang berupa campuran, maka perbandingan yang dipakai harus diperhatikan dan ditepati.4)Kejenuhan bejana kromatografiPemisahan yang dilakukan dalam dua bejana yang mempunyai kejenuhan tidak sama juga memberikan harga Rf yang tidak sama.5)SuhuPemisahan sebaiknya dilakukan pada suhu yang tetap, dimaksudkan untuk mencegah perubahan komposisi fasa gerak atau kejenuhan dari bejana.6)Jumlah cuplikan yang dianalisisJumlah cuplikan yang dianalisis jika terlalu banyak maka ada dianalisis jika terlalu banyak maka ada kecenderungan terjadi penyebaran-penyebaran bercak atau terjadinya ekor sehingga akan memperbesar kesalahan harga Rf.cuplikan 1020mg7)KesetimbanganFaktor kesetimbangan ini terlihat lebih nyata pada Kromatografi Lapis Tipis dibanding pada Kromatografi kertas,sehingga sangat perlu untuk kromatografi Lapis Tipis diusahakan ruangan di dalan bejana jenuh dengan uap pelarut. Ketidakseimbangan di dalam bejana akan terlihat dari permukaan fasa gerak yang berbentuk cekung atau fasa gerak lebih cepat pada bagian tepi dibanding bagian tengah.8)Struktur dan sifat kimia senyawa yang dipisahkanSifat kimia seperti mudah larut, tekanan uap dan kepolaran dapat mempengaruhi harga Rf dari suatu senyawa dibanding senyawa yang lain.9)Mutu pelarutHarus dipakai pereaksi yang pro analisa jika diperlukan pelarut campur, maka harus diperbaharui pada waktu-waktu tertentu,karena menguapnya pelarut yang mudah menguap akan mengubah susunan pelarut.10)TeknikSudut yang dibentuk waktu meletakkan plat/keping dalam bejana tidak begitu mempengaruhi harga Rf, tetapi bila dipakai metoda menurun atau mendatar/horisontal (tidak menaik) akan mempengaruhi

4. Variasi Kromatografi Lapis TipisDengan tujuan untuk mencapai pemisahan yang sempurna dan memperluas pemakiannya maka Kromatografi Lapis Tipis mengalami berbagai perubahan seperti :a.Kromatografi lepas tipisPada pendukung dari kaca, serbuk kering bahan penyerap dibentangkan dan diratakan. Cuplikan ditempatkan dan dilakukan pengembangan mendatar. Untuk penentuan lokasi dapat dilakukan penyemprotanb.Lapisan bertingkat ( gradient plate )Cara ini mempunyai daya adsorpsi yang berbeda sepanjang lapisan. Dapat dibuat dengan alat khusus yang disebut gradient spreader dimana diisi dengan dua macam bubur bahan penyerap misalnya A dan B. Lapisan berubah dari 100 % A ke 100 % B. Cara ini dapat digunakan untuk menemukan campuran bahan penyerap yang terbaik.

c.Pengembangan Bertingkat ( gradient elution )Komposisi fasa gerak selalu berubah selama pengembangan. Lapisan dapat dimasukkan ke dalam fasa gerak misalnya suatu pelarut dan kemudian fasa gerak yang kedua ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk-aduk.d.Pengembangan berganda ( multiple elution )Pengembangan dilakukan pada arah yang sama dan dilakukan berkali-kali baik dengan pelarut yang sama atau yang divariasi.e.Lapisan beralur ( grooved plates )Pendukung yang berasal dari kaca gelas yang diberi garis-garis, maka setelah bahan penyerap dibentangkan akan terjadi lapisan yang beralur. Pada tiap jalur ditempatkan bercak cuplikan.f.Lapisan dengan pendukung yang lenturLapisan ini sudah banyak diperdagangkan misalnya pendukung lembaran poliester dimana bahan penyerap dengan pengikat polivinil asetat dibentangkan di atasnya. Contoh pendukung lain adalah kertas selulosa yang dilapisi dengan bahan penyerap.g.Kromatografi fasa balik ( Reversed phase partition chromatography )Lapisan tipis yang sudah jadi dicelupkan dalam pelarut yang non polar tetapi mudah menguap atau pelarut tersebut dibiarkan mengalir melewati lapisan tadi. Dengan cara itu maka fasa diam bersifat non polar. Sebagai fasa gerak digunakan pelarut polar seperti air, metanol atau asetonitril.Hasil pemisahan berbeda dengan kromatografi normal dimana pada cara ini komponen yang paling polar terelusi lebih dahulu.

Perkembangan dari kromatograf lapis tipis (TLC) adalah kromatografi lapis tipis penampilan tinggi (HPTLC), perbandingan TLC dan HPTLC sebagai berikut

ParameterTLCHPTLC

Ukuran partikel12 50mm5 6mm

Tebal layer0,1 0,3 mm0,1 atau 0,2 mm

Jarak pengembangan10~15~20 cm3 6 cm

Jarak pemisahan100 120 mm50 mm

Volume penotolan0.5 5mL0,1 1mL

Ukuran sampel3 4 mm1 1,5 mm

Keuntungan HPTLC :Memperkecil difusi sehingga meningkatkan efisiensi pemisahanLOD menurun 1/10 hingga 1/15 x lebih kecilLebih ekonomis (plate / solven per sampel lebih kecil)