A. Penjerap / Fase diam

Penjerap yang paling sering digunakan pada TLC adalah silika dan serbuk selulosa, sementara

mekanisme sorpsi-desorpsi (suatu mekanisme perpindahan solut dari fase diam ke fase gerak

atau sebaliknya) yang utama pada TLC adalah partisi dan adsorbsi. Lapisan tipis yang digunakan

sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin penukar ion, gel

eksklusi, dan siklodekstrin yang digunakan untuk pemisahan kiral. Beberapa penjerap TLC

serupa dengan penjerap yang digunakan pada HPTLC. Kebanyakan penjerap dikontrol keajegan

ukuran partikel dan luas permukaannya. Beberapa prosedur kromatografi, terutama pemisahan

yang menggunkan larutan pengembang anhidrat, mensyaratkan adanya kontrol kandungan air

dalam silika. Kandungan air yang ideal adalah antara 11-12 % b/b.

Lempeng silika gel dapat dimodifikasi untuk membentuk penjerap fase terbalik dengan cara

membacemnya menggunakan parafin cair, minyak silikon, atau dengan lemak. Lempeng fase

terbalik jenis ini digunakan untuk identifikasi hormon-hormon steroid.

Ringkasan berbagai macam agen pembacem silika sbb :4]

Bahan pembacem Tujuan

Carbomer Identifikasi neomisin sulfat

Tetradekana Identifiksi sepradin dan atau

identifikasi sefaklor

Tembaga sulfat

2% dan

etilendiamin 2 %

Pemisahan 7 senyawa barbiturat

Tembaga sulfat

0,1%

Pemisahan obat-obat golongan

sulfonamida

Seng asetat 1% Pemisahan 7 obat golongan

antihistamin

EDTA Pemisahan serotonin, epinefrin, dan

nor-epinefrin

B. Fase Gerak pada KLT

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena

waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut

organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa

sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam

memilih dan mengoptimasi fase gerak :

Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan

teknik yang sensitif.

Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-

0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase

gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf.

Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non

polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.

Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai

fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu.

Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing-masing akan meningkatkan solut-

solut yang bersifat basa dan asam.5]

C. Aplikasi (Penotolan) Sampel

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan

sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur

kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan

resolusi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih

daripada penotolan secara manual terutama jika sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15 μl.

Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak

ganda. Berdasarkan pada tujuan analisis, berbagai macam jumlah sampel telah disarankan

untuk digunakan dan diringkas pada tabel dibawah ini.

Untuk memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 μl. Jika

volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl maka penotolan harus dilakukan

secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan.

D. Pengembangan

1. Konvensional dan KLT-kinerja tinggi

Pengembangan pelarut biasanya dilakukan dengan cara menaik (ascending), yang mana ujung

bawah lempeng dicelupkan ke dalam pelarut pengembang. Untuk menghasilkan reprodusibilitas

kromatografi yang baik, wadah fase gerak (chamber) harus dijenuhkan dengan uap fase gerak.

Jarak pengembangan fasegerak biasanya kurang lebih 10-15 cm, akan tetapi beberapa ahli

kromatografi memilih mengembangkan lempeng pada jarak 15 – 20 cm. Untuk lempeng KLT-

kinerja tinggi (HPTLC), yang mempunyai ukuran partikel lebih kecil, maka pengembangan

lempeng dilakukan ada jarak antara 3- 6 cm.

2. Pengembangan 2 dimensi

KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-

komponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga

hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat

berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga

memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang

berbeda.

3. Pengembangan Kontinyu

Pengembangan kontinyu (pengembangan terus menerus) dilakukan dengan cara mengalirkan

fase gerak secara terus-menerus pada lempeng KLT melalui suatu wadah (biasanya alas tangki)

melalui suatu lapisan dan dibuang dengan cara tertentu pada ujung lapisan

4. Pengembangan gradient

Pengembangan ini dilakukan dengan menggunakan komposisi fase gerak yang berbeda-beda.

Lempeng yang berisi analit dapat dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang berisi fase

gerak tertentu lalu komponen fase gerak selanjutnya ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam

bejana dan diaduk sampai homogen.

Tujuan utama sistem ini adalah untuk mengubah polaritas fase gerak. Meskipun demikian untuk

memperoleh komposisi fase gerak yang reprodusibel sangatlah sulit sehingga teknik

kromatografi ini kurang begitu popular.

E. Deteksi

Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk

penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika, maupun biologi. Cara kimia yang biasa

digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan

sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak

adalah dengan pencacahan radioaktif dan fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi sinar

ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluoresensi maka bercak akan terlihat jelas.

Jika senyawa tidak dapat berfluoresensi maka bahan penyerapnya akan diberi indikator yang

berfluoresensi, dengan demikian bercak akan kelihatan hitam sedang latar belakangnya akan

kelihatan berfluoresensi. Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak :

1. Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi secara kimia

dengan seluruh solut yang mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak

menjadi berwarna. Kadang-kadang lempeng dipanaskan terlebih dahulu untuk

mempercepat reaksi pembentukan warna dan intensitas warna bercak.

2. Mengamati lempeng di bawah lampu ultra violet yang dipasang panjang gelombang

emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap atau bercak

yang berfluoresesnsi terang pada dasar yang berfluoresensi seragam. Lempeng yang

diperdagangkan dapat dibeli dalam bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa

fluoresen yang tidak larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk memberikan dasar

fluoresensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen fluoresensi

setelah dilakukan pengembangan.

3. Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu dipanaskan

untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak sebagai bercak hitam sampai

kecoklat-kecoklatan.

4. Memaparkan lempeng dengan uapa iodium dalam chamber tertutup.

5. Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer, suatu instrumen

yang dapat mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari permukaan lempeng

ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar tampak. Solut-solut yang mampu

menyerap sinar akan dicatat sebagai puncak (peak) dalam pencatat (recorder).2,5] 

Daftar Pustaka

1. Settle, F (Editor), 1997, Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry,

Prentice Hall PTR, New Jersey, USA.

2. Mulya, M., dan Suherman, 1995, Analisis Instrumen, Airlangga University Press,

Surabaya.

3. Gritter, R.J., Bobbit, J.M., Schwarting, 1991, Introduction to Chromatography,

diterjemahkan oleh Padmawinata, Edisi II, Penerbit ITB Bandung.

4. Adamovics, J.A., 1997, Chromatographic Analysis of Pharmaceuticals, 2nd Edition,

Marcel Dekker, New York.

5. Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS Scientific

Publishers Limited, New York.