kloning jurnaal

7/21/2019 kloning jurnaal

http://slidepdf.com/reader/full/kloning-jurnaal 1/8

solasi dan ekspresi fungsional gen lipase baru diisolasi langsung dari tanah yang

terkontaminasi minyak

Sebuah SR1 gen lipase yang mengkodekan lipase ekstraseluler diisolasi dari tanah yang

terkontaminasi minyak dan dinyatakan dalam Escherichia coli. Gen berisi reading frame 1845-bp

dan dikodekan protein lipase 15-asam amino. !agian matang lipase yang diungkapkan dengantag histidin "-terminal di E. coli !#$1% dimurnikan dan ditandai biokimia. &asil penelitian

menun'ukkan bah(a lipase dimurnikan menggabungkan sifat-sifat )seudomonas chlororaphisn

dan lipase Serratia lainnya ditandai se'auh ini. )& optimum dan suhu untuk akti*itas hidrolisis

adalah masing-masing p& 5%5-8%+ dan , o. En/im menun'ukkan preferensi tinggi untuk

substrat rantai pendek 055%, $%8 2 3 g untuk 1+ minyak asam lemak dan menge'utkan itu

'uga ditampilkan akti*itas tinggi asam lemak rantai pan'ang. )rotein lipase SR1 dideduksi

mungkin dari Serratia% dan diselenggarakan sebagai prepro-protein dan milik keluarga lipase

GSG.

)engantar

#ipase 0E ,.1.1., memainkan peran penting dalam metabolisme lipid sebagai biocatalysts

untuk reaksi lipolitik. !anyak lipase telah dimurnikan dan kloning dari bakteri dan 'amur seperti

!urkholderia glumae% andida cylindracea% . rugosa% . albicans% . deformans% Geotrichum

candidum% 6richosporon fermentans% )seudomonas 7ragi% dan Staphylococcus aureus 0Gilbert et

al.% 11 9 :kastuka et al% 149. #ee et al% 149. hoo et al% 189. Gupta et al% $++49. ;im et al%

$++9. Shu et al% $++9.. #iu et al% $++8 . <ereka dapat mengkatalisis lipolitik% alkoholisis%

acidolysis% esterifikasi atau trans-esterifikasi reaksi di ba(ah kondisi yang berbeda 0=an et al.%

$++. <ereka menun'ukkan spesifisitas substrat yang luas dan menurunkan ester asil p-

nitrofenil% rema'a% dan fosfolipid dengan posisi% stereo dan rantai pan'ang selekti*itas 0>aeger etal% 149. 1. #ipase telah banyak digunakan di berbagai bidang termasuk proses makanan%

industri biomedis atau kimia% industri kulit dan industri kosmetik serta pengelolaan lingkungan

hidup 0>aeger et al% 149. 189 19 &anson et al% $++..

#ipase dari lingkungan yang ekstrim baru-baru ini menarik perhatian karena mereka panas 3

dingin toleran% menun'ukkan toleransi pelarut organik dan kegiatan katalitik khusus 07eller et al%

119.. >iang et al% $++9. #iu et al% $++89 ;iran et al% $++8.. <a//afera et al. 01 telah

melaporkan bah(a lipase dari Serratia marcescens diisolasi dari tanah di ba(ah budidaya kopi

dapat menurunkan kafein dan methyl?anthines terkait. !eberapa lipase 0seperti dari =arro(ia

lipolytica # 18+ atau :ureobasidium pullulans &"$-, dari lingkungan laut yang dinginditampilkan akti*itas lipolitik yang tinggi 0;im et al% $++9.. #iu et al% $++8. @alam tanah grease

terkontaminasi salmon% sebagian besar lipase berasal dari <yroide% :rthrobacter% !acillus dan

Serratia genus 0iudad et al.% $++8. <argesin et al. 01 telah menemukan bah(a pemantauan

akti*itas lipase mikroba tanah merupakan indikator yang berharga dari diesel biodegradasi

minyak tanah baru terkontaminasi. &asil ini menun'ukkan bah(a ada keragaman besar lipase



dalam lingkungan yang terkontaminasi minyak dan lipase ini dapat digunakan dalam

biodegradasi minyak 0>aeger et al% 19.. er*antes-Gon/Ale/ et al% $++4.

@alam laporan ini% kami menggambarkan kloning gen lipase dari tanah yang terkontaminasi

minyak dan pemurnian bentuk de(asa rekombinan nya-tag lipase tersebut. ;arakterisasi

biokimia lipase ini mengungkapkan bah(a sifat-sifatnya sangat berbeda dari orang-orang darilipase dilaporkan lainnya. Btu akti*itas hidrolitik tinggi terhadap minyak kacang tanpa akti*itas

esterifikasi trans. &omologi keselarasan menun'ukkan homologi tinggi lipase ini dengan lipase

Serratia lain kecuali sepuluh substitusi nukleotida. Gen lipase ini mungkin berasal dari Serratia

dan en/im dikodekan bisa menemukan digunakan dalam pengelolaan lingkungan hidup.

!ahan dan metode

Strain bakteri. Escherichia coli @&5a dan @&1+! digunakan untuk kloning gen lipase. )lasmid

p<@18-6 dan pE6-,$a digunakan sebagai *ektor kloning gen dan ekspresi protein% masing-

masing. 2ntuk pembangunan ekspresi plasmid% E. coli galur !#$1 digunakan.

#ipase kloning gen dan analisis urutan. <inyak 6erkontaminasi tanah dikumpulkan dari dasar

area pengolahan limbah minyak dan limbah di kantin 2ni*ersitas >iaotong Shanghai 0Shanghai%

hina. @": meta-genomik tanah terkontaminasi minyak diisolasi sesuai dengan metode Gabor

0$++4. @": mentah dimurnikan dengan elektroforesis gel agarosa menggunakan Gel E?traction

CB:E BB ;it 02S:. @imurnikan @": kemudian dicerna sebagian dengan Sau,:B 0)romega%

<annheim% >erman dan dipisahkan dengan elektroforesis D"1 gel agarosa. 7ragmen @":

dari $-5 kb kemudian diikat ke !am&B dicerna p<@18 06akara% >epang plasmid @":

menggunakan 64 @": #igase 0)romega% 2S:. )lasmid rekombinan electroporated ke E. coli

@&1+! untuk menghasilkan sebuah perpustakaan meta-genom 0&enne et al% $+++9.. &elen et al%$++59. #ee et al% $++.

Gene Bmages priming random label kit dan Gene Bmages @)-Star deteksi kit 0:mersham

)harmarcia% 2S: digunakan untuk probe pelabelan dan skrining perpustakaan. Sebuah fragmen

yang berasal dari daerah konser*asi 0GSG% G@S#% $++ bp dari keselarasan beberapa dari

lipase bakteri yang berbeda digunakan sebagai probe untuk menyaring perpustakaan @":. Bnsert

dari plasmid diisolasi dibariskan dengan <1, ma'u dan mundur primer. 2rutan nukleotida

seluruh gen lipase% yaitu sebagai SR1 telah disimpan dalam database Gen!ank dan menugaskan

:ksesi "o bankit 11$518. )rotein dan @": urutan diduga dari gen SR1 itu meledak di (eb

0httpF 33 "!B. nlm.nih.go*. :nalisis keselarasan dilakukan dengan #2S6:# 06hompson etal.% 14.

Ekspresi protein dan pemurnian. 2ntuk mengkarakterisasi lipase diduga dikodekan oleh gen

SR1% itu dinyatakan dalam E. coli !#$1. andida antarctica lipase ! 0:#! telah digunakan

dalam sintesis organik dengan berbagai aplikasi 0:nderson et al.% 18. >adi% gen :#!

digunakan sebagai kontrol. ;erangka baca terbuka gen lipase diamplifikasi dari p<@18-6.



)roduk )R dicerna dengan "coB 3 EcoRB dan subkloning ke plasmid pE6,$-a. )lasmid dari

klon positif kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli !#$1.

:kti*itas lipase dideteksi dengan menggunakan rhodamine !triolein agar piring dengan

langsung menerapkan 4 m< B)6G sel diinduksi untuk piring dengan 5+ mg 3 l ampisilin untuk

menyaring protein lipase mengekspresikan klon. :kti*itas lipase diamati ketika koloni men'adisangat merah setelah $4 'am budidaya pada , o.

Sebuah klon positif diinokulasi ke dalam cairan #! dengan 5+ mg 3 l ampisilin. Bsopropil-H-d-

thiogalactopyranoside 0konsentrasi akhir 4 m< ditambahkan ketika D@++ budaya mencapai

+%. Sel-sel yang lebih berbudaya selama , 'am dan dipanen dengan sentrifugasi pada 4 +++ rpm

pada suhu 4 I selama 1+ menit. )elet itu kembali ditangguhkan dalam 5+ m< 6ris 3 &l 0p&

%5 yang mengandung +%5 < "al dan 1 m< phenylmethylsulfonyl fluoride dan segaris dengan

sonikasi. Setelah sentrifugasi pada 15 +++ rpm pada 4 o selama ,+ menit% supernatan dianalisis

dengan sodium dodesil elektroforesis gel poliakrilamida-sulfat untuk menilai ekspresi protein

lipase. Supernatan dari klon yang sangat mengekspresikan kemudian dimuat ke-"ya tagSepharose-epat-7lo( gel kolom 0:mersham-)harmacia !iotech% 2S: dan dicuci dengan

gradien dari 1++ m< 1 < solusi mencuci untuk mengelusi protein rekombinan murni untuk

kegiatan analisis.

:nalisis akti*itas en/im. 2'i trans-esterifikasi protein lipaseF ;egiatan trans-esterifikasi terhadap

minyak kedelai diu'i dalam reaksi yang mengandung +%,, g minyak kedelai dan +.+,4 g en/im9

,% ml n-heptana dan 48%5 ml metanol ditambahkan ke 1-, *olume dengan bets setiap 'am.

Reaksi dilakukan pada , o selama $4 'am dengan 15+-rpm gemetar 07reedman et al.% 184.

2ntuk mengikuti reaksi trans-esterifikasi% ester metil asam lemak 07:<E produk dianalisis olehkromatografi gas :gilent 8+" dilengkapi dengan 5-&) 5 kolom fenil metil siloksan kapiler

0,+ m J +%,$ mm J +%$5 m% sebuah in'ector otomatis , dan detektor 7B@ 0)alo :lto% :%

2S:. Bn'ektor anddetector suhu 18+ o dan ,++ o% masing-masing. :nalisis sampel dilakukan

setidaknya tiga kali.

:nalisis akti*itas hidrolisis en/im lipase. ;egiatan hidrolisis en/im lipase diukur menurut

metode yang di'elaskan oleh inkler dan Stuckmann 01. p-nitrofenil kaprat adalah substrat

dalam penelitian ini. ampuran u'i mengandung 8 ml 6ris 3 &l penyangga 05+ m<% p& %5%

1+ ml larutan substrat 0$5 m< p-nitrofenil kaprat dalam @<SD% dan 1 ml larutan en/im 0+.++1

mg. aktu reaksi dibiarkan )R oceed selama 1+ menit dan kemudian dihentikan denganmenambahkan 1++ ml etanol. 6he :41+ dari terbebaskan p-nitrofenol diukur dengan p-nitrofenol

sebagai standar. Satu unit didefinisikan sebagai gunung en/im yang diperlukan untuk

melepaskan 1 umol dari p-nitrofenol per menit dalam kondisi assay 0#uisa-Rua et al.% 1.

Substrat spesifisitas lipase terhadap berbagai ester p-nitrofenil 0p")- ditentukan dengan metode

spektrofotometri dengan p-nitrofenil kaprat% laurat% miristat% palmitat dan stearat sebagai substrat.



)embebasan )n) diukur pada suhu kamar dengan membaca absorbansi pada 41+ nm 0Schmidt-

@annert et al.% 149 Khang et al.% $++,.

p& dan thermo-stabilitas analisis en/im SR1. Efek dari p& pada akti*itas lipase rekombinan

ditentukan dengan menginkubasi en/im rekombinan antara p& 4.+ 1+.+. !uffer yang digunakan

dalam penelitian ini adalah +%1 < asam sitrat 3 natrium sitrat penyangga 0p& 4.+- 5.5% +%1 < buffer kalium fosfat 0p& %+-8%+% dan +%1 < glisin 3 "aD& penyangga 0p& 8%5-1+. En/im

rekombinan telah diinkubasi dalam buffer untuk

$ 'am pada , o. Setelah inkubasi% buffer reaksi didinginkan di atas es untuk menentukan

akti*itas en/im yang tersisa. ;egiatan yang tersisa dari lipase rekombinan diukur segera setelah

pera(atan ini dengan metode standar seperti yang di'elaskan di atas.

Suhu optimal untuk akti*itas en/im ditentukan pada $5% ,+% ,5% 4+% 5+% + dan + o dalam

buffer yang sama pada p& %5. 6hermo-stabilitas en/im rekombinan diu'i dengan pre-inkubasi

en/im pada temperatur yang berbeda selama ,+ menit. :kti*itas en/im sisa diukur seperti

di'elaskan di atas.

&asil

#ipase kloning gen dari tanah minyak penahanan

@alam rangka untuk mengkloning gen lipase% tanah minyak penahanan @": sebagian dicerna

dengan Sau,:B yang mengakibatkan fragmen ukuran mulai dari $ sampai 5 kb sebagaimana

ditentukan dengan elektroforesis pada +%4 0b 3 * agarosa gel. @": yang dicerna kemudian

diikat dengan !am&B-dicerna p<@18 *ektor 06akara% >epang untuk menghasilkan sebuah

perpustakaan @": genomik meta-lingkungan dengan .+ J 1+5 klon. <enggunakan lipase-

homolog fragmen sebagai probe untuk layar perpustakaan ini% klon dengan memasukkan $1,,-

bp mengandung gen lipase lengkap diisolasi setelah tiga putaran Lskrining. @engan sekuensing

@":% memasukkan $.1,, nukleotida ditentukan 0Gbr. 1 dan diberi nama gen SR1.

:nalisis urutan gen SR1

:nalisis bioinformatika menun'ukkan bah(a gen SR1 mengandung kerangka baca terbuka dari

nukleotida 1,$-1% pengkodean protein dari 15 asam amino 0Gambar. 1. )erbandingan

database menggunakan urutan asam amino ini mengungkapkan kesamaan yang signifikandengan berbagai )seudomonas dan Serratia lipase. Bdentitas keseluruhan tertinggi ditemukan

dengan lipase K)M+15,4 0Serratia proteamaculans%

")M$55 0)hotorhabdus luminescens sub sp.% @an ::@$$4, 0)seudomonas chlororaphis%

berbagi 8% 5 dan identitas +% masing-masing. @ibandingkan dengan gen S#lip: kami



dilaporkan sebelumnya dari Serratia liNuefaciens S,, @!-1% gen SR1 memiliki enam mutasi

pada "-terminal dan empat nukleotida mutasi tersebut pada -terminal 0=ao et al.% $++8.



Gambar1. 2rutan pan'ang @": penuh dan urutan asam amino dideduksi dari SR1 lipase posisi

nukleotida protein yang diberikan pada sisi kiri urutan dalam 5 Lke ,L orientasi. :(al kodon :6G

dan 6:G kodon stop dalam huruf miring. 2rutan asam amino yang disimpulkan ditampilkan di

ba(ah urutan nukleotida dan asam amino diberi nomor di sisi kanan. <otif G J S J G

digarisba(ahi .... #ain GSSG mirip dengan motif G J S J G digarisba(ahi dengan panah tebal.

;aya Glycine motif konsensus kemas. Sebuah dibebankan (ilayah amphipathic diduga adalah

double-arro(ed. 2rutan gen lipase SR1 telah disimpan di Gen!ank 0:cc. "o. bankit11$518.

;eselarasan langsung dengan lipase lain mengungkapkan bah(a SR1 lipase tidak memiliki

peptida sinyal pada "-terminus. En/im ini memiliki empat motif berulang-kaya glisin. <otif ini

selalu hadir dalam keluarga toksin R6 dan protein yang dikeluarkan oleh 'alur kelas B sekresi

0#i et al.% 15. 2rutan asam amino yang berasal dari urutan nukleotida mengandung-lipase

spesifik konsensus aktif-situs% Gly--Ser--Gly% ditemukan di sebagian besar lipase bakteri dan

eukariotik. 6he Ser residu motif ini adalah elemen kunci dari situs aktif lipase acidesterification

lemak. !erdasarkan karakteristik ini% lipase SR1 diperkirakan milik keluarga GSG dari lipase

0Gbr. $.

Ekspresi dan pemurnian SR1 lipase

6erbuka bingkai encoding membaca SR1 de(asa lipase diamplifikasi dan diklon ke pE6-,$a.

Ekspresi plasmid pE6-,$a mengandung gen SR1 kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli

!#$1 regangan untuk mengekspresikan protein SR1. ;lon positif dikonfirmasi dengan )R.

Seratus dua puluh delapan klon positif maka dalam oculated men'adi media selektif untuk

mengkarakterisasi SR1 ekspresi lipase. ;lon mengekspresikan aktif SR1 lipase ditentukan oleh

lingkaran merah pada Rhodamine-6riglyceride- :garose piring dengan menambahkan 1 mlsupertant. Satu klon yang men'adi sangat merah setelah inkubasi selama $4 'am pada , o

digunakan dalam analisis selan'utnya kegiatan en/im 0Gambar. ,. Setelah mendorong dengan 4

m< B)6G selama 4 'am% supernatan dari klon yang berbeda dan kontrol 0tiruan dengan pE6-,$a

digunakan dalam analisis protein. >umlah protein yang diekstrak dari diinduksi #! dipisahkan

pada 15 S@S 3 &:#:<:" gel. &asil penelitian menun'ukkan bah(a orang-orang plasmid

0mengandung gen SR1 dikodekan lipase de(asa "ya-ditandai dengan massa molekul dihitung

dari 5 k@a 0Gambar. 4.

Bdentitas keseluruhan tertinggi ditemukan dengan K)M+15,4 lipase 0proteamaculans

Serratia% ")M$55 0)hotorhabdus luminescens sub sp.% @an ::@$$4, 0)seudomonaschlororaphis% berbagi 8% 5 dan identitas +% masing-masing. @ibandingkan dengan gen

S#lip: kami dilaporkan sebelumnya dari Serratia liNuefaciens S,, @!-1% gen SR1 memiliki

enam mutasi pada "-terminal dan empat nukleotida mutasi tersebut pada -terminal 0=ao et al.%

$++8.

;eselarasan langsung dengan lipase lain mengungkapkan bah(a SR1 lipase tidak memiliki

peptida sinyal pada "-terminus. En/im ini memiliki empat motif berulang-kaya glisin. <otif ini



selalu hadir dalam keluarga toksin R6 dan protein yang dikeluarkan oleh 'alur kelas B sekresi

0#i et al.% 15. 2rutan asam amino yang berasal dari urutan nukleotida mengandung-lipase

spesifik konsensus aktif-situs% Gly--Ser--Gly% ditemukan di sebagian besar lipase bakteri dan

eukariotik. 6he Ser residu motif ini adalah elemen kunci dari situs aktif lipase acidesterification

lemak. !erdasarkan karakteristik ini% SR1 lipase diperkirakan milik keluarga GSG dari lipase

0Gbr. $. Ekspresi dan pemurnian SR1 lipase terbuka bingkai encoding membaca SR1 de(asa

lipase diamplifikasi dan diklon ke pE6-,$a. Ekspresi plasmid pE6-,$a mengandung gen SR1

kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli !#$1 regangan untuk mengekspresikan protein

SR1. ;lon positif dikonfirmasi dengan )R. Seratus dua puluh delapan klon positif maka dalam

oculated men'adi media selektif untuk mengkarakterisasi SR1 ekspresi lipase. ;lon

mengekspresikan aktif SR1 lipase ditentukan oleh lingkaran merah pada Rhodamine-

6riglyceride- :garose piring dengan menambahkan 1 ml supertant.

Satu klon yang men'adi sangat merah setelah inkubasi selama $4 'am pada , o digunakan

dalam analisis selan'utnya kegiatan en/im 0Gambar. ,. Setelah mendorong dengan 4 m< B)6G

selama 4 'am% supernatan dari klon yang berbeda dan kontrol 0tiruan dengan pE6-,$a digunakan

dalam analisis protein. >umlah protein yang diekstrak dari diinduksi #! dipisahkan pada 15

S@S 3 &:#:<:" gel. &asil penelitian menun'ukkan bah(a orang-orang plasmid 0mengandung

gen SR1 dikodekan lipase de(asa "ya-ditandai dengan massa molekul dihitung dari 5 k@a

0Gambar. 4.

&idrolisis dan trans-esterifikasi oleh lipase yang

Sebuah u'i spektrofotometri akti*itas en/im dan spesifisitas terhadap berbagai p-nitrofenil ester

dengan dimurnikan SR1 lipase dilakukan. &asil penelitian menun'ukkan bah(a kemampuan

hidrolitik SR1 yang berbeda untuk berbagai pan'ang rantai asil )")S. ;etika pan'ang rantai asildari ester p-nitrofenil meningkat dari 1+ sampai 18% akti*itas menurun sesuai. ;egiatan

hidrolitik dari SR1 adalah 55%,+ $%8 2 3 mg saat p")1+ digunakan sebagai substrat% dan

$5. 1.1 2 3 mg untuk )") 18 substrat 06abel 1. @ibandingkan dengan kontrol :#! dan

SS@!1% akti*itas hidrolitik dari SR1 adalah sekitar $8 dan 4+ kali lebih tinggi% masing-masing%

ketika p")1+ digunakan sebagai substrat. &asil ini menun'ukkan bah(a lipase rekombinan

mentah memiliki aplikasi potensial dalam pencernaan lemak terutama asam pan'ang lemak rantai

sedang.

p& dan termo-stabilitas SR1 lipase

6hermo-stabilitas diselidiki oleh pre-inkubasi en/im murni dalam buffer yang sama seperti yang

di'elaskan dalam materi dan metode selama ,+ menit pada $+ o sampai + o dan kemudian

campuran itu digunakan untuk menentukan akti*itas hidrolitik nya. 6he dimurnikan akti*itas

lipase rekombinan adalah yang tertinggi di ,5 o-4+ o 0Gambar. 5. Seperti ditun'ukkan dalam

Gambar. 5% akti*itas lipase sisa masih sebesar dan 5 dari kontrol setelah perlakuan pada

$+ o dan ,+ o selama ,+ menit% masing-masing. Gambar 5 'uga mengungkapkan bah(a



en/im tersebut tidak aktif dengan cepat pada suhu yang lebih tinggi dari 5+ o dan tidak aktif

sama sekali pada + o dalam (aktu ,+ menit.

6he dimurnikan akti*itas lipase rekombinan diukur pada berbagai p& di buffer dengan

konsentrasi ion yang sama. stabilitas p& diu'i oleh $-h pre-inkubasi lipase rekombinan mentah di

buffer yang tepat yang memiliki konsentrasi ion yang sama pada p& yang berbeda mulai 4%+-1+%+ pada , o. &asil kami 0Gbr. menun'ukkan bah(a akti*itas maksimum diamati pada p&

%5-8%+. ;egiatan lipase menurun segera ketika p& melebihi 8%+% sedangkan en/im stabil di

kisaran p& 5%5-8%+

kloning jurnaal

Documents