JURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HALU OLEOKENDARI

2016

Kelompok 5 :

IRWAN (F1C1 13072) LA ODE AGUS SALIM (F1C1 13068)AMINA SARI MUIS (F1C1 13006)WIWI DAYANTI (F1C1 13074)

“BIOTEKNOLOGI MOLEKULER”

SEKUENSING DNA

SEJARAH SEKUENSING

SUB MATERI

PENDAHULUANPRINSIP

SEKUENSING

METODE SEKUENSING

DNA (DEOXYRIBO NUCLEIC ACID

PENDAHULUAN

Suatu Asam Nukleat yang menyimpan segala informasi biologis dari setiap makhluk hidup yang menentukan jenis rambut, warna kulit dan sifat-sifat khusus dari manusia

DNA dapat mereplikasi membentuk salinannya sendiri dan setiap untainya berisi atas

unit berulang yang disebut nukleotida

Metode Penentukan urutan basa nukleotida, adenin, guanin, citosin, timin pada sepotong DNA.Sekuensing

Urutan Basa Nukleotida

Urutan Asam Amino

Struktur Protein Dan Fungsinya

Perubahan Sequence

DNA

Perubahan Protein

Protein Non Fungsional

SEJARAH SEKUENSING DNA

Robert Holley (1965) Cornell University di New York, Amerika

Serikat

Mempublikasikan sekuens tRNA alanin dari khamir yang terdiri atas 77 nukleotida selama 7 tahun dan hasilnya merupakan sekuens DNA yang pertama kali dipubilkasikan adalah DNA sepanjang 12 nukleotida dari bakteriofag lambda (1971)

Federick Sanger dan Alan Coulson (1975)

Medical Research Council Inggris

Mempublikasikan metode sekuensing DNA secara langsung disebut teknik plus-minus. Dan berhasil melakukan sekuensing DNA

sebagian besar Genom bakteriofog sepanjang 5.375 nukleotida dan dipublis

pada tahun 1977

Februari 1977, Allan Maxam dan Waltert Gilbert dari Harvard University

mempublikasikan sekuensing DNA mereka

PRINSIP DASAR SEKUENSING DNA

DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya.

DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template)

kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR,

namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu seperti buffer, dNTPs dan ddNTP. Proses ini

dinamakan cycle sequencing

KOMPENEN-KOMPONEN SEQUENSING

Bahan-bahan sekuensing DNA Fungsi

DNA Template/ DNA Strand Sebagai Cetakan DNA

DNA Primer Beberapa pasang basa pada DNA

DNA Polimerase I Enzim yang merepikasi DNA, berfungsi memperpanjang

dNTP Bahan pembentuk sintesis DNA

ddNTPs (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP)

Menghentikan reaksi pemanjangan untai DNA atau sintesis DNA

Maxam Gilbert Method (REAKSI KIMIA)

Sanger Method (REAKSI ENZIMATIK)

Next Generation Sequensing

Maxam Gilbert Method (Reaksi Kimia)

♦ Metode pengakhiran rantai (chain termination) dan degradasi kimia.

♦ Didasarkan pada pembelahan nukleotida oleh bahan kimia yang spesifik.

♦ tidak mmerlukan DNA untai ganda sehingga tidak memerlukan primer untuk mensintesi untai baru kembali.

♦ Pemotongan DNA terjadi secara kimia sehingga reagen kimia tertentu harus ditambahkan kedalam sistem reaksi.

• piperidin • Hidrazin

• Dimetil sulfat • Asam format

SENYAWA KIMIA METODE MAXAM- GILBERT

Tahapan Metode Maxam Gilbert

► Sekuen molekul DNA untai ganda yang akan digunakan dipotong bagian posisi ikatan antara fosfat dan guladeoksiribosa menggunakan piperidin

► Fragmen DNA diberilabel pada salah satu ujungnya atau pada nukleotida 3’ menggunakan fosfat radioaktif

► Basa dimodifikasi dengan spesifik menggunakan bahan kimia tertentu. a.Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa Gb. Asam format menyerang A dan G c.Hidrazin akan menghidrolisis C dan Td.Hidrazin, piperidin dan garam bekerja pada C

► Kemudian akan diperoleh empat fragmen yang berbeda masing-masing ujungnya adalah G, A atau G, C atau T dan C.

► Dilihat laju migrasi masing-masing fragmen dalam bentuk pita. Dengan cara membandingkan lajur pertama dan kedua, serta lajur ketiga dengan keempat.

► Diurutkan berdasarkan lajur migrasinya dari yang terkecil ke yang besar.

Reaksi Purin dengan dimetil sulfat Reaksi Pirimidin dengan dimetil sulfat

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN

KELEBIHAN KEKURANGAN

Memiliki Tekhnik yang Rumit

Menggunakan Bahan Kimia yang berbahaya seperti hydrazine yang bersifat

neurotoxin

Kesulitan dalam Scale-up

Dapat digunakan baik untuk DNA ganda maupun tunggal

Menghasilkan fragmen yang bermacam-macam

Metode Sanger

Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975, yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang masing-masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan.

Metode Sanger menggunakan dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs) yang

memiliki sebuah H pada karbon-3 dari gula ribosa. Yang normal memiliki OH pada

deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).

Dideoxynucleotides merupakan penghenti rantai. Dalam reaksi sintesis jika

dideoxynucleotide ditambahkan dan bukan normal deoxynucleotide, sintesis akan

berhenti karena 3’OH yang diperlukan untuk penambahan nukleotida berikutnya

tidak ada.

Metode Sanger

1. DNA utas sebagai template DNA

2. Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan

template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi

3. DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida

baru ke ujung 3 dari template

4. Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan

pewarna fluorescent)6.Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara random dideoxy nukleotida diambil (dipasangkan).

7. Penambahan dideoxynukeotida menyebabkan reaksi berhenti. Khusus

untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap

tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C

jika ddCTP dan T jika ddTTP.

8. Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang

berbeda selama elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan

1

2

3

4

• kelebihAN DAN KEKURANGAN

• VIDEO

Ekstraksi DNAUntuksekuensing DNA

Sekuensing menggunakan Dye

Terminator Sekuensing Dengan

bahan Kimia

Faktor Penentu keberhasilan sekuensing

DNA

FAKTOR PENENTU KEBERHASILAN

SEKUENSING DNA

Sekuensing menggunakan Dye primers

Nex Generation

Teknik pemetaan DNA yang berdasarkan deteksi terhadap pirofosfat (PPi) yang dilepaskan selama sintesis DNA.Teknik ini memanfaatkan reaksi enzimatik yang dikatalisis oleh ATP sulfurilase dan luciferase untuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahan nukleotida.

Pyrosequencing

Metode sekuensing ini ditemukan oleh perusahaan Illumina. Sekuensing Illumina menggunakan primer yang akan berkomplemen dengan adaptor yang telah disediakan oleh perusahaan pada sebuah plat.Proses sekuensing ini menggunakan teknik bridge PCR, yaitu terbentuknya jembatan pada saat elongasi. Nukleotida penghenti akan diberikan dan pendaranan fluoresens akan direkam oleh kamer

Ilumina

Aplikasi Sekuensing DNA

untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui.

riset dasar biologi

Kedokteran

bioteknologi

forensik

Sekuensing DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatan penyakit genetik

ilmu pengobatan

Sebagai Contoh :

ALAT-ALAT SEKUENSING DNA

APPLIED BIOSYSTEMS PRISM 3100 (CAPILLARY, 16 CAPILLARIES) APPLIED BIOSYSTEMS PRISM 3700

(CAPILLARY, 96 CAPILLARIES)

Metode untuk sekuensing protein umumnya melibatkan pemutusan ikatan yang diikuti dengan identifikasi asam amino.

SEKUENSING PROTEIN

Sekuensing protein atau sekuensing peptida adalah penentuan urutan asam amino pada suatu protein atau peptida (oligopeptida maupun polipeptida

Senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain oleh ikatan peptida

PROTEIN

Metode Klasik Metode Modern

Edman Degradation

Mass Spectrometry

Metode Sekuencing Protein

Setelah setiap pemotongan, residu asam amino yang telah dipotong tersebut dapat diidentifikasi menggunakan kromatografi

METODE KLASIK

DEGRADASI EDMAN

metode degradasi Edman, residu pada ujung-N (ujung amino) protein dipotong satu per satu dengan reaksi kimia

Metode Degradasi Edman

Reaksi Edman untuk memotong dan menderivatisasi asam amino yang terpenggal. Derivat asam amino diidentifikasi menggunakan kromatografi atau elektroforesis dengan standar 20 asam amino derivat.

METODE MODERN

MASS SPECTROSCOPY

Metode ini memanfaatkan spektrometri massa yang mampu mengukur massa peptida dengan tepat

Protein yang hendak di-sekuensing dipotong-potong secara enzimatik maupun kimia menjadi peptida-peptida yang kemudian dianalisis menggunakan spektrometri massa.

Dalam proses spektrometri massa, peptida-peptida tersebut dipecah secara ionisasi, misalnya dengan bantuan laser

MS PROCEDURES FOR SEQUENCE IDS

PROTEIN SEQUENCING: OVERLAPPING SEQUENCES

PROTEIN SEQUENCE FROM DNA SEQUENCE

APLIKASI SEKUENSING DNA DAN PROTEIN

Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk :

-Mengidentifikasi tersangka potensial yang mungkin cocok dengan DNA bukti di TKP-Mencocokkan donor organ dengan penerima dalam program transplantasi-Menentukan silsilah untuk benih atau bibit ternak.

Sekian dan Terima Kasih