LAPORAN PRAKTIKUMGENETIKA DAN PEMULIABIAKAN BIOTA AIR

ANALISIS DNAPADA UDANG WINDU (Panaeus monodon)

OLEH

NAMA : ANDI MASRIAHSTAMBUK : L22110902KELOMPOK : VIII (DELAPAN)ASISTEN : MUSYARRAFAH MANSYAH, S.Pi

PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRANJURUSAN PERIKANAN

FAKULTAS ILMU KELAUTAN DAN PERIKANANUNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR2013

I. PENDAHULUAN

Latar Belakang

Sumberdaya hayati perairan merupakan salah satu modal dasar

pembangunan Nasional yang sangat penting. Kontribusi subsektor perikanan

telah nyata terhadap penerimaan devisa negara dan di masa datang perlu lebih

ditingkatkan. Sejalan dengan itu, Direktorat Jendral Perikanan telah

mencanangkan PROTEKAN (Program Peningkatan Ekspor Perikanan) 2003,

dengan nilai US $ 7.6 milyar; dan sebesar US $ 6.78 milyar berasal dari budidaya

udang windu (Prihatman, 2003).

Sistem PCR yang memanfaatkan DNA dari organisme telah diaplikasikan

dalam bidang perikanan. Terutama dalam pendeteksian jenis penyakit yang

menyerang udang windu. Namun analisis DNA dengan sistem PCR tidak hanya

dapat digunakan pada pendeteksian penyakit (virus) saja, tetapi juga dapat

digunakan dalam identifikasi dan pembacaan sumber informasi pada level

molekuler.

Terdapat tiga jenis penanda genetik dalam menganalisis genom, yaitu

penanda morfologi, penanda protein dan penanda DNA. Untuk menjadi penanda

genetik, lokus dari penanda harus lokus yang secara eksperimen dapat

mendeteksi variasi diantara individu di dalam pengujian populasi. Perbedaan

jenis penanda bisa mengidentifikasi polimorfisme yang berbeda juga (Liu, 1998

dalam Kusumawaty, 2001).

Analisis DNA bertujuan untuk mengarakterisasi DNA makhluk hidup untuk

mengidentifikasi susunan DNA-nya. Barang bukti DNA dapat diambil dari barang

bukti biologis, baik dalam keadaan utuh maupun tidak utuh lagi. Analisa DNA

banyak digunakan untuk karakterisasi sifat genetik pada level molekuler yang

secara langsung mencerminkan sifat genotip (materi genetik) yang dimiliki oleh

organisme tertentu. Analisis DNA ini terdiri dari tiga tahap yaitu ekstraksi DNA,

PCR, dan elektroforesis (Nuraisyah, 2012).

Sejak ditemukan penanda DNA, penanda ini menjadi populer digunakan

dalam mempelajari filogenetik molekuler. Penanda DNA adalah sebagian kecil

DNA yang dapat menunjukkan polimorfisme diantara individu yang berbeda. Ada

dua macam pendekatan yang dilakukan pada analisis penanda DNA ini,

diantaranya pendekatan dengan hibridisasi dan PCR (Kusumawaty, 2001).

Tujuan dan Kegunaan

Tujuan dari Praktikum Analisis DNA pada Udang Windu (Panneus

monodon) adalah agar mahasiswa mampu untuk melakukan ekstraksi DNA

secara sederhana dan mengamati presipitasi DNA pada Udang Windu (Panneus

monodon).

Kegunaan dari Praktikum Analisis DNA pada Udang Windu (Panneus

monodon) adalah agar mahasiswa mampu untuk melakukan secara langsung

ekstraksi DNA secara sederhana dan mengamati presipitasi DNA pada Udang

Windu (Panneus monodon).

II. TINJAUAN PUSTAKA

Udang Windu (Penaeus monodon)

A. Deskripsi dan Sistematika Udang Windu (Penaeus monodon)

Udang windu digolongkan ke dalam keluarga Penaeid pada filum

Arthropoda. Terdapat ribuan spesies dalam filum ini, namun yang mendominasi

perairan berasal dari subfillum Crustacea. Berikut tata nama udang windu

kompilasi dari Motoh (1981) dan Landau (1992) dalam Education, 2011:

Kingdom : Animalia

Subkingdom : Metazoa

Fillum : Arthropoda

Subfillum : Crustacea

Kelas : Malacostraca

Ordo : Decapoda

Famili : Penaeidae

Genus : Penaeus

Spesies : Penaeus monodon

Gambar 1. Morfologi Udang Windu

Udang merupakan jenis ikan konsumsi air payau, badan beruas

berjumlah 13 (5 ruas kepala dan 8 ruas dada) dan seluruh tubuh ditutupi oleh

kerangka luar yang disebut eksosketelon. Umumnya udang yang terdapat di

pasaran sebagian besar terdiri dari udang laut. Hanya sebagian kecil saja yang

terdiri dari udang air tawar, terutama di daerah sekitar sungai besar dan rawa

dekat pantai. Udang air tawar pada umumnya termasuk dalam keluarga

Palaemonidae, sehingga para ahli sering menyebutnya sebagai kelompok udang

palaemonid. Udang laut, terutama dari keluarga Penaeidae, yang bisa disebut

udang penaeid oleh para ahli (Prihatman, 2003).

Udang merupakan salah satu bahan makanan sumber protein hewani

yang bermutu tinggi. Bagi Indonesia udang merupakan primadona ekspor non

migas. Permintaan konsumen dunia terhadap udang rata-rata naik 11,5% per

tahun. Walaupun masih banyak kendala, namun hingga saat ini negara produsen

udang yang menjadi pesaing baru ekspor udang Indonesia terus bermunculan

(Prihatman, 200).

B. Pengembangan Budidaya Udang Windu (Penaeus monodon)

Pemuliaan Dalam Pengembangan Budidaya Tambak

Sebagaimana halnya dengan kegiatan budidaya lainnya, pengembangan

budi-daya udang windu menghadapi beberapa kendala diantaranya masalah

penyakit. Ken-dala lainnya adalah masalah yang berkaitan dengan nutrisi dan

kualitas air (Kurniawan, 2003).

Penyakit infeksi merupakan penyakit yang sering dikaitkan dengan

kegagalan produksi baik dipembenihan maupun ditambak-tambak pembesaran

udang windu. Hingga kini, penyakit virus dan bakteri merupakan penyakit utama

yang dihadapi para petambak dan sering menyebabkan kegagalan panen

(Kurniawan, 2003).

Pengendalian penyakit infeksi diantaranya dilakukan dengan

memproduksi benih yang rentan terhadap penyakit. Tindakan ini merupakan

tindakan internal terhadap biota yang dilaksanakan dengan cara konvensional

dan dengan menggunakan teknologi maju. Upaya ini merupakan kegiatan

pemuliaan udang windu yang diharapkan unggul dari aspek kesehatan terutama

untuk memperoleh Specific Pathogen Free (SPF) (Wyban, 1992). Meskipun

demikian aspek nutritif, pertumbuhan dan reproduktif juga harus dipertimbangkan

dalam pemuliaan hewan (Kurniawan, 2003).

Pemuliaan Dengan Teknologi Transgenik

Alternatif lain untuk menghadapi kendala dalam budidaya adalah

pemuliaan dengan teknologi transgenik. Devlin et al. (2001) mengungkapkan,

bahwa teknologi transgenik dapat memacu pertumbuhan ikan Rainbow trout

(Onchorhynchus mykiss) liar. Hal ini dilakukan dengan konstruksi gen

pertumbuhan (OnMTGHI) melalui mikroinjeksi telur. Atas dasar itu, teknologi

transgenik mungkin dapat diterapkan pada pemuliaan udang windu untuk

memperoleh udang unggulan. Udang transgenik adalah udang yang telah

mengalami perubahan secara buatan pada gennya dengan cara mengubah

susunan asli genom aslinya dengan tehnik rekombinan DNA (Kurniawan, 2003).

DNA (DEOXIRIBO NUCLEAT ACID)

A. Gambaran Umum DNA

Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (bahasa Inggris:

deoxyribonucleic acid), adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul

utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya

terletak di dalam inti sel. Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel

adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala

aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme. Di antara perkecualian

yang menonjol adalah beberapa jenis virus (dan virus tidak termasuk organisme)

seperti HIV (Human Immunodeficiency Virus) (Suparmuji, 2012).

Rangka utama untai DNA terdiri dari gugus fosfat dan gula yang

berselang-seling. Gula pada DNA adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu 2-

deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan

fosfodiester antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon

kelima pada gula lainnya. Salah satu perbedaan utama DNA dan RNA adalah

gula penyusunnya; gula RNA adalah ribosa (Suparmuji, 2012).

B. Sturktur DNA

DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur heliks ganda.

Pada struktur heliks ganda, orientasi rantai nukleotida pada satu untai

berlawanan dengan orientasi nukleotida untai lainnya. Hal ini disebut sebagai

antiparalel. Masing-masing untai terdiri dari rangka utama, sebagai struktur

utama, dan basa nitrogen, yang berinteraksi dengan untai DNA satunya pada

heliks. Kedua untai pada heliks ganda DNA disatukan oleh ikatan hidrogen

antara basa-basa yang terdapat pada kedua untai tersebut. Empat basa yang

ditemukan pada DNA adalah adenina (dilambangkan A), sitosina (C, dari

cytosine), guanina (G), dan timina (T). Adenina berikatan hidrogen dengan

timina, sedangkan guanina berikatan dengan sitosina. Segmen polipeptida dari

DNA disebut gen, biasanya merupakan molekul RNA (Suparmuji, 2012).

Gambar 2. Ilustrasi Struktur Molekul DNA (Suparmuji, 2012)

Gambar 3. Struktur DNA

C. Fungsi DNA

DNA merupakan polimer yang amat penting dalam kehidupan suatu sel

karena DNA inilah yang mengekspresikan sifat genetika, DNA merupakan

pembawa informasi genetik yang hasil akhir ekspresinya berupa suatu protein

atau RNA. Gen adalah bagian dari DNA yang berperan sebagai pembawa

informasi genetika melalui pembentukan molekul protein secara tidak langsung.

Jika terjadi mutasi pada DNA suatu gen maka hasil ekspresinya dapat

mengalami perubahan susunan asam amino pada posisi tertentu sehingga dapat

mengakibatkan perubahan sifat maupun aktivitas protein yang dihasilkan (Admin,

2011).

DNA dari berbagai spesies mempunyai jumlah pasangan basa dan

jumlah gen yang berbeda. Organisme tingkat tinggi mempunyai jumlah gen yang

lebih banyak dibandingkan organisme tingkat rendah. DNA suatu spesies atau

organisme tertentu mempunyai perbandingan dan urutan unit mononukleotida

yang khas. Sel prokariotik yang hanya mengandung 1 kromosom mempunyai

DNA yang merupakan suatu makromolekul tunggal sedangkan sel eukariotik

mempunyai beberapa atau banyak kromosom dengan berat molekul yang besar

pula (Admin, 2011).

PCR ( Polymerase Chain Reaction)

PCR adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul

DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang

berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan enzim dan

oligonukleotida sebagai primer, dan dilakukan di dalam thermocycler. Panjang

target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya

diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum target disebut primer

forward dan primer yang berada setelah target disebut primer reverse. Enzim

yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru disebut sebagai

enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR,

diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasa Adenine),

dCTP (nukleotida berbasa Cytosine) dan dTTP (nukleotida berbasa Thymine)

(Muladno, 2002).

PCR adalah suatu metode yang menggunakan komponen‐komponen

replikasi DNA untuk mereplikasi suatu fragmen DNA yang spesifik di dalam

tabung reaksi. Metode ini dikembangkan untuk mempercepat isolasi DNA

spesifik tanpa membuat dan melakukan pustaka genom. Dua primer

oligonukleotida pendek digunakan untuk mengapit daerah DNA yang akan

diamplifikasi. Primer menguatkan dan mencangkok target sequens, satu dari

setiap strand dari double strand DNA molekul. Primer menetapkan limit daerah

yang akan diamplifikasi dan DNA polymerase mereplikasi DNA diantara primer

menggunakan empat deoksiribonukelotida (dGTP, dATP, dCTP, dTTP) yang

disediakan di dalam tabung reaksi dengan penambahan dNTPs. Di dalam

sebuah siklus amplifikasi (=replikasi), DNA template didenaturasi pada

temperature tinggi, annealing primer dilakukan dengan menurunkan temperature

dan DNA polymerase memperpanjang DNA dari primer. Pengulangan siklus

denaturasi, annealing primer, dan sintesis DNA menghasilkan DNA melalui

amplifikasi secara eksponensial. Sekitar 25 sampai 40 siklus pada umumnya

digunakan di dalam thermalcycler, yaitu sebuah instrumen yang secara otomatis

mengontrol temperature dan waktu. Suatu DNA polymerase khusus – Taq

polymerase, yang diisolasi dari suatu bakteri thermofilik, Thermus aquaticus,

yang hidup di hot spring – yang stabil pada temperature tinggi digunakan untuk

mendenaturasi DNA template. Produk yang dihasilkan dari PCR dianalisa

menggunakan elektroforesis gel agarose (Barnum, 2005).

Beberapa komponen yang penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR

adalah : DNA target, primer, enzim Taq DNA polymerase, deoksinukleoside

triphosphat dan larutan penyangga (buffer). Molekul DNA yang targetnya akan

dilipatgandakan jumlahnya dapat berupa untai tunggal atau untai ganda. Jumlah

yang digunakan dalam proses PCR tidak terlalu berpengaruh terhadap kualitas

hasil PCR, tetapi jumlah dalam ukuran pikogram sudah cukup. DAlam

menentukan jumlah ini, dapat pula dilakukan ujicoba dengan berbagai ukuran,

misalnya 10, 100, atau 1000 pikogram sehingga diperoleh kualitas PCR yang

paling baik. Apabila target yang digunakan berupa total DNA genom, sebaiknya

DNA tersebut dipotong terlebih dahulu dengan enzim tertentu sehingga potongan

DNA yang dihasilkan masih berukuran cukup besar, misalnya enzim Sal I atau

Not I yang mempunyai sedikit situs pemotongan di dalam total DNA genom.

Primer atau oligonukleotida sebaiknya berukuran paling pendek 16 basa dan

biasanya berkisar antara 18 – 24 basa (Muladno, 2002).

Gambar 4. Rangkaian Alat PCR

Elektroforesis DNA

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang

biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan

untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga

20.000 pasang basa (bp) (Pramono, 2012).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan

bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran

molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA

dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi

fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui

ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar

ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan

etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di

dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet

(Pramono, 2012).

Gambar 5. Rangkaian Alat Elektroforesis DNA

Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu

cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA

dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan

migrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel

disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang

terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr), kemudian dilihat di atas

sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga

pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA, sehingga

molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. DNA

merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan

listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi

ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii) prosentase/kerapatan gel yang dilalui

DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin

kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin rapat media

yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka semakin lambat DNA

bermigrasi. Semakin besar arus yang diberikan, maka semakin cepat DNA

bermigrasi (Anam, 2010).

Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA

berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul

menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti

memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis

mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif.

Ketika diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif

(anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda) (Anam, 2010).

Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus

ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas,

sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur; ii) pewarna untuk

memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, iii) agar dapat bergerak

ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan

sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol

blue dan xylene cyanol. Selain itu, pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah

diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan

DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA

(Suharsono dan Widyastuti, 2006 dalam Anam, 2010).

III. METODE PRAKTIKUM

Waktu dan Tempat

Praktikum Analisis DNA pada Udang Windu (Penaeus monodon)

dilaksanakan bertepatan pada hari Rabu 1 Mei 2013 pukul 08.00 WITA

bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Perikanan, Fakultas Ilmu

Kelautan dan Perikanan, Universitas Hasanuddin, Makassar.

Alat dan Bahan

Alat dan Bahan yang digunakan pada praktikum Analisis DNA pada

Udang Windu (Penaeus monodon) adalah sebagai berikut:

Tabel 1. Alat yang digunakan dalam Praktikum Analisis DNA pada Udang Windu (Penaeus monodon)No.

Alat Fungsi

1 Microwave Untuk memanaskan gel agarose.2 Mikropipet beserta

tipnyaUntuk engambil sampel.

3 Vortex Untuk menghomogenkan bahan dalam ekstraksi DNA.

4 Seperangkat alat elektroforesis

Pembuatan gel agarose.

5 UV transluminator Untuk mengamati pita DNA.6 Freezer Untuk mengawetkan sampel.7 PCR Untuk mengetahui deteksi DNA.8 Mikrotube Untuk memisahkan supernatan dengan DNA.9 Sisir/Comb Sebagai cetakan sumur/well elektroforesis.10 Labu erlenmeyer Tempat larutan agarose.11 Kertas parafilm Tempat pencampuran sampel ekstraksi DNA

dengan loading dye sebelum dimasukkan pada sumur gel agarose.

Tabel 2. Bahan yang digunakan dalam Praktikum Analisis DNA pada Udang Windu (Penaeus monodon)No. Bahan Fungsi1 Sampel DNA Sampel yang akan diamati pita

DNAnya.2 Nucleus lysis buffer 500 – 600 µL Larutan untuk menambah densitas

agar tedapat dalam sumur.3 Proteinase K 4,3 µL Enzim dalam ekstraksi DNA.4 Larutan protein perification 200 Larutan dalam pembuatan ekstraksi

µL DNA.5 Isopropanol 300µL Larutan untuk pemisahan superatan

DNA.6 Ethanol 70%, 600 µL Larutan untuk mencuci.7 Larutan TAE Bahan pembuatan gel agarose.8 Loading dye Menambah densitas, sehingga DNA

akan selalu berada di dasar sumur; memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA.

9 Marker DNA Sebagai pemberat agar sampel tidak mengapung pada gel agarose.

10 TNES Urea Membersihkan ampas-ampas dna.11 SDS 10% Memisahkan DNA.12 TE Buffer Menjaga pH pada nilai tertentu.13 Gel red Pengganti etidium bromida, sebab

etidium bromida bersifat karsinogenik.

Prosedur Kerja

A. Isolasi DNA Udang Windu (Panaeus monodon)

Penghancuran Sel (Cell Lysis)

Semua peralatan yang akan digunakan dalam pembuatan ekstraksi DNA

diautoclave. Sampel udang ditimbang sebanyak 10-20 mg, lalu dimasukkan ke

dalam tabung evendorf (1,5 ml). 100-200 µl Cell Lysis Solution ditambahkan ke

dalam tabung yang diletakkan di atas es lalu jaringan digerus hingga homogen.

Kemudian 200 µl Cell Lysis Solution kembali ditambahkan ke dalam tabung dan

dihomogenkan. 0,5 µl Proteinase K ditambahkan ke dalam tabung dan diaduk

dengan menggunakan pipet. Tabung berisi suspensi kemudian diinkubasi pada

suhu 55 ºC selama 3-24 jam.

Eliminasi RNA

10,5-1 µl Rnase dimasukkan ke dalam setiap tabung lalu diaduk dengan

membolak-balikkan tabung sebanyak 25 kali. Kemudian diinkubasi pada suhu 37

ºC selama 15-60 menit. Setelah inkubasi selesai, homogenat didinginkan pada

suhu ruang.

Pengendapan Protein

30-40 l Protein Precipitation Solution ke dalam larutan homogenat lalu

divortex pada kecepatan tinggi selama 20 detik. Kemudian homogenat

disentrifuse pada kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit hingga terbentuk

endapan protein dan larutan yang mengandung DNA.

Pengendapan DNA

Larutan supernatan yang terbentuk dituangkan dengan hati-hati ke dalam

tabung baru yang telah berisi 200 l Larutan Isopropanol 100 %. Tabung yang

berisi larutan DNA ini kemudian diaduk dengan membolak-balikkan tabung

sebanyak 50 kali hingga terlihat untaian pita DNA yang berwarna putih.

Kemudian tabung tersebut disentrifuse dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1

menit hingga terbentuk pelet DNA di dasar tabung. Larutan supernatan dibuang

dan tabung dikeringkan di atas kertas tissue. 200 µl Larutan Etanol 70 % dingin,

kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang berisi pelet DNA. Lalu tabung

dibolak-balik beberapa kali untuk membilas sisa-sisa DNA yang berada di dinding

tabung. Tabung disentrifuse pada kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit.

Kemudian larutan etanol dibuang dengan hati-hati, lalu tabung dikeringkan diatas

kertas tissue dan dibiarkan kering udara selama 15 menit. Pelet DNA yang

terbentuk dilarutkan kembali dengan menambahkan 20 µl akuades steril (SDW)

ke dalam tabung. Kemudian larutan DNA disimpan dalam freezer atau langsung

digunakan untuk proses selanjutnya.

Pengukuran Konsentrasi DNA dan RNA

Larutan DNA diencerkan terlebih dahulu 10-20 kali (tergantung pada hasil

ekstraksi). Alat Gene Quant dinyalakan, dan kuvet dikeluarkan dari tempat

penyimpanan lalu dibilas dengan akuades. Kalibrasi dilakukan dengan mengukur

absorbansi pelarut (SDW untuk DNA), dengan memasukkan 70 l pelarut

tersebut ke dalam kuvet. Kemudian kuvet dimasukkan ke dalam alat, lalu tekan

tombol “set ref”, hasil pembacaan akan menunjukkan nilai absorbansi 0,000.

Dilanjutkan dengan pengukuran konsentrasi DNA atau RNA. Kuvet yang akan

digunakan, dibilas terlebih dahulu dengan 20 µl larutan DNA yang akan diukur.

Setelah itu larutan asam nukleat yang akan diukur dimasukkan ke dalam kuvet

sebanyak 70 µl dan kuvet ditempatkan di dalam alat. Setelah tombol “sample”

ditekan dan konsentrasi larutan sudah terbaca, kuvet dikeluarkan dan dibilas

dengan akuades.

B. Elektroforesis Gel Agarose

Membuat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5

ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades. Membuat gel agarosa 1% dengan cara

menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan e dalam bufer TAE 1x hingga volume

20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna. Menyiapkan baki gel

agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (memastikan bahwa

selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki).

Memasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi

hampir menyentuh dasar baki. Memeriksal suhu larutan agarosa dengan cara

menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar

50-60 0C, tambahkan 1 μl jel red. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar,

kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan

berubah menjadi gel yang padat. Mengambil sisir dengan hati-hati, lepaskan

selotip dari ujung-ujung baki. Memasukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke

dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x

(pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE).

Menyiapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki

elektroforesis.Memasukkan 10 μl sampel DNA dan 2 μl loading dye 6x ke dalam

sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih

dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet. Membuat

catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.

Menghubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa

kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak

demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). Menyalakan sumber arus,

aturlah volatse dan waktu running hingga diperoleh angka 80 V dan 45 menit

dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. Menjalankan

elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber

arus. Elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis,

yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki

dari tangki elektroforesis. Mengeluarkan gel dan letakkan di atas UV

transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator).

Menyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

IV.HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Gambar 6. Pita DNA pada Udang Windu (Panaeus monodon)

Pembahasan

Hasil gambar di atas menunjukkan atau menejelaskan bahwa

hasilekstraksi DNA pada udang windu (Panaeus monodon) memiliki kemurnian

karena tampak jelas pita DNAnya. Berdasarkan hasil uji PCR udang windu

(Panaeus monodon) dengan menggunakan primer F.

Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan merusak dinding dan

membrane sel dan juga membrane inti. Berdasarkan hasil pengamatan, larutan

yang berisi strawberry dan buffer berwarna merah sesuai dengan warna buah

strawberry. Penambahan buffer ekstraksi ini berfungsi untuk melisiskan membran

sel. Dan penambahan SDS 20% bertujuan untuk melisiskan dinding sel dan

mendenaturasi protein sehingga DNA pada jaringan buah strawberry dapat

diisolasi. Larutan dalam tabung tersebut dihomogenkan dengan menggunakan

vorteks.

Dewasa ini, perkembangan ilmu pengetahuan, khususnya dalam bidang

bioteknologi dan biologi molekuler berlangsung sangat pesat. Berawal dari

terungkapnya struktur dan fungsi DNA (Deoxyribonucleic acid) oleh Francis Crick

M 1 2 3 3

pada tahun 1958, kemudian disusul dengan ditemukannya enzim restriksi,

pembuatan pustaka gen berdasarkan situs restriksi, cloning sekuen DNA pada

organisme prokaryot, penggunaan berbagai macam penanda DNA (DNA marker)

sampai akhirnya sintesis dan penggandaan DNA secara in vitro serta sekuen

genom dan analisisnya (Kususwaty, 2007).

Kajian keragaman genetik yang berdasarkan DNA mitokondria saat ini

sangat berkembang karena DNA mitokondria mempunyai jumlah turunan yang

tinggi (high copy number), mempunyai jumlah salinan sebesar 103-104 molekul

DNA mitokondria/sel somatik. Ukuran DNA mitokondria kecil sehingga dapat

dipelajari secara utuh. Genom DNA mitokondria mempunyai laju evolusi 5-10 kali

lebih cepat dari DNA inti. Daerah D-loop DNA mitokondria adalah control region,

yaitu daerah yang tidak mengkode protein. Dinamakan D-loop karena pada

fragmen tersebut terdapat fragmen DNA dengan sruktur 3-rantai (membentuk

hairpin), terbentuk akibat terciptanya rantai berat (H-strand) yang menggantikan

rantai induk dan membentuk struktur tripleks D-loop (3-strand). Daerah yang

membentuk hairpin/D-loop berdekatan dengan gen tRNAphe dan terdapat

promotor (Heavy Strand Promotor/HSP dan Light Strand Promotor/ LSP) yang

berfungsi sebagai transkripsi genom mitokondria, juga terdapat daerah OH

(Origin of Replication) untuk rantai berat yang berfungsi awal replikasi (Clayton,

1992 dalam Sulandari dan Zein, 2008).

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul DNA ditempatkan ke dalam

sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, kemudian

dialirkan listrik dengan kutub yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Molekul-

molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu

kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah

pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif

alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju

perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu

panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk

menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi

dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein

tersebut berbentuk linear dan bermuatan negatif pada sisi luarnya sehingga pada

saat dielektroforesis akan menuju ke kutub positif secara seragam. Setelah

proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar

molekul sampel yang telah terpisah dapat dideteksi. Dalam praktikum ini kami

menggunakan Etidium bromida sebagai zat pewarnanya,. Etium bromida akan

berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan akan memberikan warna orange

fluoresance yang dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet (Anonim, 2010).

Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet akan terlihat pita-pita (band) pada

lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel; satu lajur merupakan arah pergerakan

sampel dari sumur gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir

elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama

elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang berarti bahwa molekul-

molekul tersebut berukuran sama. Penanda (marker) yang merupakan campuran

molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan

ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis penanda tersebut

pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marker tersebut

dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak

pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.

Dalam Hasil pengamatan terlihat bahwa terdapat fragmen DNA yang terlihat

terurai dan tidak terurai. Semakin sedikit DNA yang terurai, maka semakin baik

hasil elektroforesis DNA nya (Anonim, 2010).

V. PENUTUP

Kesimpulan

Dari hasil praktikum mengenai Analisis DNA pada Udang Windu

(Panaeus monodon) dapat disimpulkan bahwa hasil ekstraksi DNA Udang windu

(Panaeus monodon) adalah memilki kemurnian DNA karena tampak jelas pita

pada gel agarose dalam pembacaan di UV transiluminator.

Saran

Untuk pelaksanaan praktikum selanjutnya semoga dapat dilakukan

proses ekstraksi DNA dan proses PCR secara langsung agar tidak lagi adanya

kekurangan pengetahuan mengenai penggunaan teknologi.

DAFTAR PUSTAKA

Admin. 2011. Asam Nukleat. Online http://perikanan-hangtuah.blogspot.Com /2011/02/asam-nukleat.html. Pada hari kamis 2 mei 2013 pukul 23.46 di Universitas Hasanuddin.

Anam, Khairul. 2010. Laporan I (Isolasi dan Pemetaan DNA Plasmid). Institut Pertanian Bogor.

Anonim. 2010. Elektroforesis dan Isolasi DNA.

Kurniawan, Dedy. 2003. Pengembangan Budidaya Tambak Udang Windu Berkelanjutan Dalam Perspektif Perundangan.

Nuraisyah, Annisa. 2012. Analisis DNA. Online http://ichapiiz.blogspot.Com /2012/09/analisis-dna.html. Pada hari kamis 2 mei 2013 pukul 23.57 di Universitas Hasanuddin.

Kusumawaty, Diah. 2001. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Program Studi Biologi Jurusan Pendidikan Biologi UPI.

Kusumawaty. 2007. Prinsip-Prinsip Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Aplikasinya. Kursus Singkat Isolasi dan amplifikasi DNA – 20 Juni 2007.

Pramono, Hendro. 2012. Elektroforesis Gel Agarosa Online http:// 02bios2unsoed.wordpress.com/tentang/acara-praktikum/3-elelektroforesis -dna/. Pada Hari Sabtu 4 mei 2013 di Universitas Hasanuddin.

Prihatman, Kemal. 2000. Budidaya Udang Windu (Palaemonidae/ Penaeidae). Deputi Menegristek Bidang Pendayagunaan dan Pemasyarakatan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi.

Suparmuji. 2012. Insight Gen, DNA, dan Kromosom. Wahana Biologi.

Sulandari, S dan M.S.A Zein. 2008. Analisis D-loop DNA Mitokondria untuk Memposisikan Ayam Hutan Merah dalam Domestikasi Ayam di Indonesia. Bidang Zoologi, Pusat Penelitian Biologi-LIPI.