konstruksi dan analisis kualitas pustaka genom … · dna. sekuensing dna merupakan teknik kunci...

43
KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA GENOM KENTANG (Solanum tuberosum L.) UNTUK SEKUENSING GENOM TOTAL YULIANA DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

Upload: lehanh

Post on 16-Mar-2019

215 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA

GENOM KENTANG (Solanum tuberosum L.) UNTUK

SEKUENSING GENOM TOTAL

YULIANA

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Konstruksi dan

Analisis Kualitas Pustaka Genom Kentang (Solanum tuberosum L.) untuk

Sekuensing Genom Total adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi

pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi

mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan

maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan

dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Oktober 2014

Yuliana

NIM G84100042

ABSTRAK

YULIANA. Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kentang (Solanum

tuberosum L.) untuk Sekuensing Genom Total. Dibimbing oleh I MADE

ARTIKA dan I MADE TASMA.

Salah satu usaha untuk meningkatkan produktivitas kentang yaitu melalui

informasi genetik kentang. Tujuan penelitian yaitu mengkonstruksi pustaka

genom dari empat genotipe kentang di Indonesia (CIP 392781, PT 29, Amudera

dan Margahayu) dan menganalisis kualitas pustaka genom untuk sekuensing

genom total. Konstruksi pustaka genom dilakukan secara in vitro dengan

menempelkan adaptor pada ujung fragmen DNA. Pustaka genom selanjutnya

diklasterisasi dan disekuensing menggunakan cBOT cluster generation dan NGS

HiSeq 2000. Pustaka genom yang berhasil dikonstruksi berukuran 300-600 bp

dengan konsentrasi 13.08-60.14 nM. Pustaka genom yang dikonstruksi telah

memenuhi persyaratan untuk sekuensing genom total. Jumlah basa yang

dihasilkan dari proses sekuensing yaitu sebanyak 287.2 x 109bp. Klaster pustaka

genom dengan nilai Q scores di atas 30 yang dihasilkan lebih besar dari 88.6%.

Tingkat kesalahan pembacaan basa selama proses sekuensing sebesar 0.28-

1.01%%. Secara keseluruhan hasil sekuensing genom termasuk ke dalam kategori

ideal.

Kata kunci : Kentang, Next Generation Sequencing, Pustaka genom, Sekuensing

genom total.

ABSTRACT

YULIANA. Construction and Quality Analysis of Potato (Solanum tuberosum L.)

Genomic Library for Whole Genome Sequencing. Under the direction of I MADE

ARTIKA and I MADE TASMA.

One of the efforts to improve productivity of the potato with the genetic

information. The purpose of this study was to construct genomic libraries of four

potato genotypes of Indonesia (CIP 392781, PT 29, Amudera and Margahayu)

and analyze the quality of genomic library for total genomic sequencing. Genomic

library construction was performed in vitro by attaching the adapter to the ends of

DNA fragments. This was followed by, clustering and sequencing of genomic

library using the cBOT claster Generation and NGS HiSeq2000. Genomic

libraries were successfully constructed with a size of 300-600 bp and

concentration of 13.08 – 60.14 nM. The genomic libraries have met the

requirements for total genome sequencing. The amount of base generated from the

sequencing process was 287.2 x 109 bp. Cluster of genomic library produced with

the value of Q scores above 30 was more than 88.6%. Base reading error rate

during the sequencing process was 0.28-1.01%. Over all result from this genomic

sequencing was belong to the ideal category.

Key words: Potato, Next Generation Sequencing, Genomic library, Whole

genome sequencing.

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains

pada

Departemen Biokimia

KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA

GENOM KENTANG (Solanum tuberosum L.) UNTUK

SEKUENSING GENOM TOTAL

YULIANA

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala yang

telah memberikan rahmat dan karunia-Nya. Shalawat dan salam semoga selalu

tercurah kepada Nabi Muhammad SAW beserta seluruh keluarga, sahabat dan

para pengikutnya sampai akhir zaman sehingga karya ilmiah ini sebagai salah satu

syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor berhasil

diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan

Desember 2013 hingga Juni 2014 ini ialah biologi molekuler, dengan judul

Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kentang (Solanum tuberosum

L.) untuk Sekuensing Genom Total.

Ucapan terimakasih penulis haturkan kepada kedua pembimbing penelitian

yaitu Dr I Made Artika MApp Sc dan Dr I Made Tasma MSc atas semua ilmu,

saran dan dukungan yang diberikan selama penyusunan karya ilmiah ini. Terima

kasih juga penulis ucapkan kepada Mbak Ida Rosdianti SSi, Bapak Dani

Satyawan MSi, Bapak Habib Rijzaani MSi dan Kak Ihsan yang telah banyak

membantu dalam teknis pelaksanaan penelitian, kepada kedua orang tua dan

seluruh keluarga yang selalu menginspirasi penulis untuk selalu berjuang keras

dan menjadi lebih baik.

Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Syahdan, Asep, Mbak

Titin, rekan-rekan Biokimia 47 dan penghuni 4S kostan atas dukungan, kritik,

bantuan dan sarannya selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Semoga

karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi penulis dan untuk perkembangan ilmu

pengetahuan umumnya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Oktober 2014

Yuliana

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ............................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... x

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ x

PENDAHULUAN ............................................................................................... 1

METODE ............................................................................................................ 2

Bahan dan Alat ................................................................................................. 2

Prosedur Penelitian ........................................................................................... 3

HASIL ................................................................................................................. 8

PEMBAHASAN ................................................................................................ 15

SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................... 26

Simpulan ........................................................................................................ 26

Saran .............................................................................................................. 26

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 26

LAMPIRAN ...................................................................................................... 29

RIWAYAT HIDUP ........................................................................................... 33

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Kuantitas dan kemurnian DNA genom total kentang. 8

2 Konsentrasi double stranded DNA hasil isolasi 9

3 Kuantitas dan kemurnian DNA 10

4 Kuantitas dan kemurnian DNA setelah tahapan adenilasi ujung 3’ 10

5 Kuantitas dan kemurnian DNA 11

6 Kualitas dan kuantitas pustaka 12

7 Kuantitas pustaka genom kentang diukur menggunakan qPCR 13

8 Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom 13

9 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing 14

10Tingkat kesalahan (error rate) 15

DAFTAR GAMBAR

1 Elektroforegram DNA genom hasil isolasi 8

2 Elektroforegram DNA genom kentang hasil fragmentasi 9

3 Elektroforegram DNA hasil purifikasi 10

4 Elektroforegram DNA genom kentang hasil amplifikasi 11

5 Elektroforegram pustaka genom kentang dengan analisis bioanalyzer 12

6 Kualitas pustaka genom kentang menggunakan photocap_MW 12

7 Histogram jumlah klaster 14

DAFTAR LAMPIRAN

1 Strategi penelitian 29

2 Hasil pengukuran kuantitas pustaka genom 30

3 Grafik intensitas persentase hasil sekuensing pustaka genom 31

4 Proses klasterisasi di dalam cBOT 31

5 Proses sekuensing DNA menggunakan NGS Hiseq 2000 (Huson 2010) 32

1

PENDAHULUAN

Kentang (Solanum tuberosum L.) merupakan salah satu komoditas sayuran

penting yang termasuk dalam subsektor hortikultura di Indonesia. Kentang

termasuk sayuran semusim, berumur pendek, dan berbentuk perdu dan merupakan

tanaman semusim karena hanya satu kali berproduksi dan setelah itu mati (Samadi

2007). Kentang merupakan salah satu pangan utama dunia sesudah padi, gandum

dan jagung yang punya asam amino lengkap dibandingkan padi dan gandum yang

kekurangan asam amino lisin dan jagung yang kekurangan asam amino triptofan.

Kentang juga memiliki nutrisi yang tinggi diantaranya karbohidrat, protein,

mineral, asam nukleat, beberapa vitamin C, vitamin B kompleks serta vitamin A.

kJ (Wagih dan Wiersena 1994 ; Wattimena 1996).

Produktivitas kentang di Indonesia masih tergolong rendah karena area

pertanamannya hanya di daerah tertentu saja. Menurut data Badan Pusat Statistik

(2014), produktivitas kentang di Indonesia pada tahun 2012 adalah sebesar 16.58

ton/Ha dengan jumlah produksi sebesar 1.094.240 ton pada luas areal lahan

65.989 Ha dan data sementara BPS untuk tahun 2013 produktivitas kentang

mengalami penurunan menjadi sebesar 16.27 ton/Ha dengan produksi kentang

sebesar 1.023.381 ton pada luas lahan panen 62.900 Ha. Data ini menunjukkan

penurunan terhadap kentang baik dari segi lahan maupun hasil produksi panen

kentang ini sendiri.

Menurut Listanto (2010), rendahnya produktivitas kentang disebabkan oleh

beberapa faktor antara lain : tidak tersedianya varietas super, mutu benih yang

rendah, serangan hama dan penyakit serta teknik budidaya maupun penanganan

pasca panen yang kurang tepat. Usaha-usaha untuk meningkatkan produktivitas

kentang telah banyak dilakukan. Perbaikan tanaman dan peningkatan produksi

lebih lanjut menurut Puspita (2002), dapat dicapai dengan pemanfaatan sumber

plasma nutfah, baik melalui pemuliaan tanaman secara konvensional maupun

rekayasa genetika. Produksi pangan pada masa mendatang akan lebih banyak

bergantung pada penerapan teknologi daripada peningkatan luas lahan pertanian.

Teknik yang banyak berkembang sekarang diantaranya adalah teknik rekayasa

genetika.

Penciptaan bahan unggul pada kentang ini dihubungkan dengan studi

genetik yang melibatkan peranan gen didalamnya. Pemuliaan dengan marka

molekuler nantinya dapat mengetahui gen yang menyandi ketahanan kentang

terhadap penyakit dan hama. Teknik yang berkembang saat sekarang dan juga

sangat banyak membantu dalam penanda molekuler adalah teknik sekuensing

DNA. Sekuensing DNA merupakan teknik kunci untuk berbagai perkembangan

ilmu pengetahuan diantaranya arkeologi, antropologi, ilmu genetika, bioteknologi,

biologi molekular dan ilmu forensik (Franca et al. 2002). Sekuensing DNA terdiri

dari dua jenis yaitu sekuensing fragmen DNA dan sekuensing genom total.

Perbedaan kedua jenis sekuensing tersebut terletak pada metode dan jumlah basa

yang akan disekuens. Sekuens fragmen DNA menggunakan untai DNA pendek

sekitar 100-1000 bp. Metode yang digunakan untuk sekuens fragmen DNA adalah

metode chain termination. Sekuensing genom total (whole genome sequencing)

adalah proses penentuan sekuen genom suatu organisme yang dilakukan pada satu

waktu.

2

Tahapan sekuensing genom total kentang diawali dengan mengkonstruksi

pustaka genom kentang. Konstruksi pustaka genom menggunakan Low

Throughput Protocol dari illumina dan disekuensing menggunakan NGS Illumina

Hiseq 2000. Konstruksi pustaka ini relatif sangat mudah dan singkat karena tidak

membutuhkan vektor untuk menyisipkan fragmen DNA dan juga tidak

membutuhkan ruangan khusus untuk penyimpanan. Konstruksi ini juga tidak

membutuhkan DNA dalam jumlah banyak hanya membutuhkan double stranded

DNA (dsDNA) dengan konsentrasi rendah (20 ng/uL).

Penelitian ini bertujuan mengkonstruksi dan menganalisis kualitas pustaka

genom total untuk mengetahui karakteristik genom kentang empat genotipe

kentang yang diteliti. Hipotesis penelitian ini adalah dapat mengkonstruksi

pustaka genom kentang dan kemudian disekuensing menggunakan NGS Hiseq

2000. Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini yaitu diperoleh informasi dan

studi keseluruhan tentang genom kentang. Manfaat lain yaitu urutan DNA yang

dihasilkan diharapkan mampu untuk menunjang program perbaikan genetika

tanaman untuk menunjang program pemuliaan tanaman kentang.

METODE

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah daun kentang yang

diambil dari Balai Penelitian Sayuran di Lembang dan yang ditanam di BB

Biogen dengan empat genotipe kentang (CIP 392781, PT 29, Amudra dan

Margahayu), es batu, etanol teknis, bufer ekstraksi CTAB (Cetil Trimetil

Amonium Bromida), NaOAc (natrium asetat), chisam (kloroform : isoamil

alkohol) dengan perbandingan 24 : 1, isopropanol, bufer TE, etanol absolut dan

etanol 70%, natrium bisulfit, dan 2% polivinilpirolidon. Bahan-bahan yang

digunakan untuk fragmentasi DNA adalah DNA hasil isolasi dan resuspension

buffer.

Bahan-bahan yang digunakan untuk modifikasi ujung fragmen DNA adalah

end repair control, end repair mix, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan

resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk adenilasi ujung 3’OH

DNA adalah A-tailing control dan A-tailing mix. Bahan-bahan yang digunakan

untuk ligasi adapter adalah ligase control, DNA ligase mix, DNA adapter index,

stop ligase buffer, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan resuspension buffer.

Bahan-bahan yang digunakan untuk pemurnian DNA hasil ligasi adalah serbuk

agarosa, buffer TAE 1X, SyBr Gold, loading dye, DNA ladder, dan nuclease free

water. Bahan-bahan yang digunakan untuk perbanyakan DNA adalah PCR Primer

Cocktail, PCR Master Mix, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan Resuspension

Buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk klasterisasi dan sekuensing genom

kentang adalah 2 N NaOH, 1 N NaOH, 0.1 N NaOH, bufer hibridisasi (HT1),

Tris-Cl, 10 nM, PhiX library, akuades, EtOH 70 %, buffer library, TruSeq SR

Cluster Kit v3- HS (cBot), Truseq SBS Kit-HS (200 cycle).

Alat-alat yang digunakan meliputi tabung eppendorf 15 mL, tabung 2 mL,

tabung 1.5 mL, inkubator thermostat, sentrifus 5810R eppendorf, tissue lyser,

3

tungsten bead, batang magnet, vortex, mikropipet, nanodrop thermoscientific

2000 spectrophotometer, instrument Covaris M220, tabung AFA Covaris

snap_cap dan srew_cap, microwave, mikrosentrifus, kotak es, sarung tangan karet,

neraca analitik, sudip, tabung Durant, parafilm, Vortex Maxi Mix II, power supply,

perangkat elektroforesis, instrument Agilent 2100 bionalyzer, High sensitivity

DNA chip Agilent Technologies, Qubit 2.0 Fluorometer invitrogen, realtime PCR

2000 Sequence detection system ABI PRISM, thermocycler Biometra, IKA MS 3

Vortexer, UV transilluminator High Performance 2UV, mesin pendingin, alat

pengering Thermoscientific Savant DNA 120 spedvac evaporator, cBot Cluster

Generation, Illumina Hiseq 2000.

Prosedur Penelitian

Isolasi DNA Genom Kentang (Modifikasi Metode Doyle dan Doyle 1987)

Daun kentang yang masih muda dan segar ditimbang sebanyak 50 mg dan

kemudian ke dalam tabung berisi daun ditambahkan buffer ekstraksi (CTAB 2%,

Na-bisulfid dan PVP 2%) sebanyak 400 µL. Dua butir tungsten bead dimasukkan

ke dalam tabung berisi sampel dan kemudian digerus menggukan tissue lyser

dengan frekuensi 25/5 selama 30 detik dan kemudian diulangi lagi dengan posisi

sebaliknya. Inkubasi sampel pada 650C selama 30 menit dan dibolak-balik secara

berkala (10 menit). Kemudian, ke dalam sampel yang telah dipanaskan tersebut

ditambahkan CHISAM (24:1) sebanyak 750 µL dikocok bolak-balik selama 5

menit. Campuran larutan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm

selama 15 menit pada suhu 250C dan supernatan dipindahkan ke dalam tabung

baru (lebih kurang 600µL supernatan). Selanjutnya ke dalam supernatan tersebut

ditambahkan 60µL Na-asetat 3M dan dibolak balik kemudian tambahkan 600 µL

isopropanol dingin dan disimpan di dalam pendingin -20 0C selama 1 jam dan

setelahnya dibolak balik perlahan kemudian didinginkan lagi selama 15 menit.

Setelah dikeluarkan dari pendingin, larutan kemudian disentrifugasi 12000

rpm selama 15 menit pada suhu 40C. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan

pelet yang dihasilkan kemudian dicuci dengan menambahkan 200 µL etanol 70%

dingin dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit

pada suhu 40C. Cairan kemudian dibuang dan pelet dikeringkan menggunakan

vakum evaporator selama 15 menit. Endapan hasil pengeringan kemudian

dilarutkan dengan 50 µL buffer TE pH 8.0 hingga larut atau dengan dipanaskan

pada 650C selama 15 menit. Enzim RNAse kemudian ditambahkan 1/50 kali

volume DNA atau sebanyak 1µL untuk menghilangkan RNA dan kemudian

diinkubasi kembali selama 37oC selama 30 menit. Tahap selanjutnya adalah uji

kualitas dengan menggunakan gel agarose 1%,, uji kuantitas untuk konsentrasi

asam nukleat menggunakan nanodrop spektrofotometer DNA dan uji double

stranded DNA dengan menggunakan fluorometer Qubit ds DNA BR.

Uji Kualitatif DNA Genom Kentang

Uji kualitatif DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel

agarosa 1%. Gel agarosa dibuat dengan menambahkan agarosa sebanyak 1.1 g ke

4

dalam 110 mL larutan TAE 1X. Larutan kemudian dipanaskan hingga larut dan

didinginkan pada suhu kamar hingga hangat dan dituang ke dalam cetakan gel

elektroforesis yang telah dipasangi sisir (cetakan sumur) hingga gel memadat. Gel

yang sudah padat dipindahkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi TAE 1X.

Selanjutnya dibuat loading buffer dengan campuran blue juice 6x sebanyak 2 μL,

SyBr Gold 100x 0.5 µL, molecular water 7.5 µL. Sampel yang akan

dielektroforesis pada penelitian ini sebanyak 2 µL sampel DNA pada parafilm.

Setelah tercampur maka campuran sampel diinjeksi ke dalam sumur gel agarosa.

Marker yang digunakan adalah 100 bp plus DNA ladder sebanyak 5.5 μL

ditambah 0.5 µL SyBr Gold 100x. Setelah semua sampel selesai diinjeksi maka

alat elektroforesis dihubungkan pada power supply yang dialiri tegangan listrik

100 volt selama 30 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan lampu UV

dalam trasnsilluminator dan didokumentasikan.

Uji Kuantitatif DNA Genom Kentang (Invitrogen 2010)

Uji kuantitatif untuk konsentrasi dan kemurnian asam nukleat dilakukan

dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific, USA dengan

blanko yang digunakan adalah larutan TE pH 8.0. Sebelum digunakan lubang

optik dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan nuclease free water.

Sebanyak 1 ul Larutan TE dimasukkan ke dalam lubang optik nanodrop

thermoscientific ditutup dan kemudian dipilih menu measure blank pada

komputer. Kemudian, lubang optik dibersihkan kembali dan sampel DNA

sebanyak 1 μL dimasukkan ke dalam lubang optik. Setelah itu, hasil pengukuran

akan muncul dalam konsentrasi ng/μL dan kemurnian DNA dapat dilihat langsung

dalam A280 dan A260. Uji kuantitas DNA dilakukan untuk mengetahui

konsentrasi dan kemurnian DNA dengan perbandingan A260/280 yang baik

sekitar 1.8 hingga 2.0.

Uji double stranded DNA (dsDNA) dilakukan dengan menggunakan

fluorometer Qubit ds DNA BR. Pengenceran larutan Qubit disiapkan dengan

perbandingan reagen 1: 200 dalam buffer Qubit. Beberapa tabung khusus

disiapkan dengan campuran larutan reagen dan buffer Qubit total 198 µL dan ke

dalamnya ditambahkan 2 µL DNA. Semua tabung yang sudah diisi dengan larutan

di vortex selama ± 3 detik dan kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 2

menit. Setelah diinkubasi, tabung kemudian dimasukkan pada alat Qubit 2.0

fluorometer dan konsentrasi dsDNA dapat dilihat pada layar dan dihitung

menggunakan rumus.

Konstruksi Pustaka Genom Kentang (TruSeq DNA low throughput protocol

(Illumina 2010a) )

Fragmentasi DNA. DNA diencerkan dalam resuspension buffer dengan

total keseluruhan volume yang telah dicampur 130 µL (berat DNA 2.6 ug).

Larutan dipipet dan dipindahkan ke dalam tabung Covaris sebanyak 130 µL dan

dimasukkan ke dalam alat instrument Covaris. Program dipilih secara manual

yaitu metode DNA 0300-130 µL_Snap_Cap tabung mikro yaitu program

pemotongan DNA dalam ukuran 300 bp. Tabung covaris dimasukkan ke dalam

alat dan running hingga 75 detik. Proses ini dilakukan dengan hati-hati karena

5

sensor alat ini sangat sensitif. Hasil dari fragmentasi Covaris dipindahkan ke

dalam tabung PCR sebanyak 50 µL (berat DNA 1 ug).

Modifikasi Ujung Fragmen DNA. Modifikasi diawali dengan pembuatan

Insert Modification Plate (IMP). Sebanyak 10 µL End repair control dan 40 µL

End Repair Mix ditambahkan ke dalam tabung yang mengandung 50 µL DNA

hasil fragmentasi. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara

dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan

diinkubasi dalam thermalcycler selama 30 menit pada suhu 300C.

Langkah selanjutnya yaitu pemurnian IMP yang diawali dengan

penambahan 160 µL AMPure XP Beads yang telah divorteks ke dalam sampel..

Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan

sebanyak 10 kali. Campuran sampel dan AMPure XP Beads diinkubasi selama 15

menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan keatas

batang magnet pada suhu ruang selama 15 menit. Sebanyak 127.5 µL supernatan

dibuang dengan hati-hati jangan sampai mengenai pelet yang terletak pada

dinding tabung. Tahapan sebelumnya diulangi kembali untuk menghilangkan

supernatan yang masih tersisa. Pada proses pencucian pelet, sebanyak 200 µL

etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik. Selanjutnya, etanol 80%

yang telah ditambahkan dibuang dan dilakukan sebanyak 2 kali ulangan. Pelet

kemudian dikeringkan selama 15 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari

batang magnet. Resuspension buffer sebanyak 17.5 µL ditambahkan ke dalam

tabung yang berisi pelet dan sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro

dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Selanjutnya, tabung berisi sampel

diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian

dipindahkan ke atas batang magnet pada suhu ruang selama 5 menit untuk

memisahkan supernatan dengan pelet. Sebanyak 15 µL supernatan dipindahkan ke

dalam tabung yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin. Tahapan

selanjutnya yang bisa dilakukan adalah pengukuran kuantitas dan kualitas hasil

modifikasi ujung jika supernatant di dalam tabung masih tersisa. Tahapan

pemurnian menggunakan AMPure XP Beads juga dilakukan pada proses tahapan

penempelan adaptor dan proses perbanyakan fragmen DNA.

Adenilasi Ujung 3’ DNA. A-tailing control 2.5 µL dan A-tailing mix 12.5

µL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Sampel dicampurkan

menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung

yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermalcycler selama 30 menit

pada suhu 370C dan setelahnya langsung dilanjutkan dengan tahapan penempelan

adaptor.

Penempelan Adaptor. Sebanyak 2.5 ul Ligase control, 2.5 µL DNA Ligase

Mix dan 2.5 µL dan DNA Adapter Index ditambahkan ke dalam tabung yang berisi

sampel. Sampel dicampurkan menggunakan pipet dengan cara dinaik turunkan

sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam

thermalcycler selama 10 menit pada suhu 300C. Sebanyak 5 µL Stop Ligase Mix

ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Kemudian sampel dicampurkan

menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali.

Langkah selanjutnya yaitu pemurnian sampel yang diawali dengan

penambahan 42.5 µL AMPure XP Beads dengan mengikuti prosedur yang sama

dengan sebelumnya. Selanjutnya resuspension buffer sebanyak 22.5 µL

ditambahkan ke dalam tabung yang berisi pelet. Sampel dicampurkan dan

6

diinkubasi pada suhu ruang. Sebanyak 20 µL supernatan dipindahkan ke dalam

tabung yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin. Tahapan selanjutnya yang

dilakukan adalah pengukuran kuantitas dan kualitas hasil adenilasi dan

penempelan adaptor jika supernatan di dalam tabung masih tersisa.

Pemurnian DNA Hasil Ligasi. Pemurnian hasil ligasi terdiri dari dua tahap

yaitu pemisahan ukuran fragmen DNA melalui elektroforesis dan ekstraksi gel.

Pemisahan ukuran fragmen DNA diawali dengan pembuatan gel agarosa 2%.

Sebanyak 1.2 gram bubuk agarosa ditimbang dan ditambahkan larutan TAE 1x

sebanyak 60 mL. Larutan kemudian dipanaskan dalam microwave sampai semua

agarosa larut. Setelah suhu larutan hangat, kemudian tambahkan 6 uL pewarna

SyBr Gold dan kocok hingga homogen. Kemudian larutan dituang ke dalam

cetakan yang telah disiapkan.

Elektroforesis diawali dengan disiapkannya seperangkat bak elektroforesis,

kemudian larutan TAE 1x dituangkan ke dalam bak hingga gel terendam bagian

bawahnya. Selanjutnya, ditempat terpisah sebanyak 4 ul loading dye 6x

ditambahkan ke dalam tabung berisi 20 ul sampel hasil ligasi. Sebanyak 12 ul

penanda DNA ladder 100 bp diinjeksikan pada sumur gel yang tersedia. Sampel

kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel yang tersedia. Cetakan agarosa di buat

dengan 2 kolom dimana pada kolom ke dua berisi nuclease free water sebanyak

25 ul. Sampel kemudian di elektroforesis pada kuat arus 100 volt selama 60 menit.

Hasil elektroforesis dilihat di atas lampu UV transiluminator dan

didokumentasikan. Saat telah mendekati ukuran 400 bp, nuclease free water yang

berada pada kolom kedua dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung baru (20 ul).

Ukuran fragmen DNA 300 bp, 400 bp dan 500 bp diiris dari gel agarosa dan

disimpan dalam tabung untuk digunakan pada tahapan selanjutnya yaitu ekstraksi

gel jika hasil validasi pustaka tidak mencukupi untuk konsentrasi minimum yang

dibutuhkan untuk proses sekuensing.

Perbanyakan fragmen DNA. Perbanyakan DNA diawali dengan

penambahan 5 µL PCR Primer Cocktail dan 25 µL PCR Master Mix ke dalam

tabung yang berisi sampel. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro

dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung kemudian disimpan dalam

mesin PCR untuk proses perbanyakan yang terdiri dari 10 siklus selama 20 menit

dengan rincian reaksi predenaturasi pada suhu 98°C selama 30 detik, denaturasi

pada suhu 98°C selama 10 detik, annealing pada suhu 60°C selama 30 detik,

extension pada suhu 72°C selama 30 detik, dan pasca pemanjangan primer pada

suhu 72°C selama 5 menit.

Tahapan selanjutnya yaitu pemurnian hasil PCR yang diawali dengan

penambahan 50 µL AMPure XP Beads dengan mengikuti prosedur pemurnian

yang sama dengan sebelumnya sebanyak 32.5 µL resuspension buffer

ditambahkan ke dalam tabung yang berisi pelet dan dicampurkan menggunakan.

Sebanyak 30 µL supernatan dipindahkan ke dalam tabung yang baru dan disimpan

dalam mesin pendingin. Tahapan selanjutnya yang bisa dilakukan adalah validasi

terhadap kualitas dan kuantitas pustaka genom yang telah berhasil dikonstruksi.

Validasi kualitas pustaka genom. Uji ini digunakan untuk mengetahui

ukuran fragmen DNA hasil pemotongan yang dilakukan dengan mengikuti

protokol Agilent High Sensitivity DNA Assay. Cip HS DNA diletakkan di atas

priming station chip dan kemudian ke dalam lubang berlabel G ditambahkan 9 ul

dye mix kemudian ditekan menggunakan priming station selama 1 menit. Setelah

7

dibuka kemudian ke dalam lubang lain yang berlabel G ditambahkan 9 ul dye mix

dan marker pada masing-masing lubang kecuali lubang ladder, kemudian ke

dalam lubang ladder ditambahkan 1 ul HS DNA ladder. Sebanyak 1 ul sampel

juga kemudian dimasukkan ke dalam lubang sampel. Cip kemudian di vortex

selama 1 menit dan kemudian di running pada alat agilent 2100 bioanalyser yang

terhubung dengan computer. Kualitas ukuran pustaka juga di ukur dengan

menggunakan software bioinformatika photocap MW.

Validasi kuantitas pustaka genom. Sampel dibuat sebanyak 3 kali ulangan

dan setiap ulangan dibuat pengenceran 1:1000, 1:2000 dan 1:4000 menggunakan

buffer qPCR. Setiap sampel yang telah diencerkan ini kemudian diambil sebanyak

4 ul dan ditambahkan 16 ul reagen qPCR dan dimasukkan ke dalam tabung PCR.

Standar larutan juga dibuat sebanyak 3 ulangan dengan jumlah standar sebanyak 6.

Tabung PCR kemudian di masukkan ke dalam alat qPCR dan di running selama 2

jam. Hasil yang diperoleh akan digunakan untuk perhitungan klasterisasi pustaka

genom. Sebelum klasterisasi pustaka terlebih dahulu dihitung konsentrasi pustaka

genom yang dibutuhkan yaitu sebanyak 2 nM yang diencerkan ke dalam buffer

library (Tris-Cl 10 mM pH 8.5 dan 0.1 % tween 20).

Klasterisasi Pustaka Genom Kentang (cBot cluster generation protocol

(Illumina 2010b)

Klasterisasi DNA diawali dari preparasi sampel yang terdiri dari dua

tahapan, yaitu denaturasi dan pelarutan DNA. Denaturasi diawali dengan

penambahan 0.1 N NaOH ke dalam sampel DNA sehingga diperoleh konsentrasi

DNA pustaka akhir 13 pM. Campuran dinaik turunkan menggunakan pipet hingga

homogen. Sampel diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang untuk

mendenaturasi utas ganda DNA menjadi utas tunggal. DNA yang telah

didenaturasi disimpan dalam mesin pendingin sampai proses pelarutan DNA akan

dilakukan.

Tahapan preparasi sampel selanjutnya yaitu pelarutan DNA dalam buffer

hibridisasi. Sebanyak 987 uL buffer hibridisasi ditambahkan ke dalam template

DNA yang telah didenaturasi sebelumnya sehingga diperoleh konsentrasi akhir 13

pM. Sebanyak 120 µL DNA yang telah dilarutkan ditambahkan ke dalam 1%

PhiX control (1.2 ul) di dalam tabung PCR. Posisi sampel pada tabung dicatat dan

kemudian tabung dimasukkan ke dalam alat cBOT Cluster Generation untuk

dilakukan klasterisasi di dalam suatu flow cell.

Sekuensing Pustaka Genom Kentang (HiSeq 2000 protocol 2011)

Sekuensing pustaka genom menggunakan Illumina HiSeq 2000 terdiri dari

beberapa tahap yaitu persiapan reagen, pemilihan parameter untuk sekuensing,

pemasangan flow cell, sekuensing, dan post-run sequencing (maintenance wash).

Reagen yang digunakan selama sekuensing diantaranya SBS reagen (TruSeq SBS

kit), multiplexing reagen dan paired end reagen. Reagen-reagen tersebut

dimasukkan kedalam rak dan disimpan dalam ruang reagen compartment yang

terdapat dalam Illumina Hiseq 2000. Pemilihan parameter untuk sekuensing

dilakukan melalui Hiseq control software interface. Parameter yang tersedia

diantaranya flow cell ID, experiment, user name, flow cell type, control lane,

8

output folder,confirm first base, keep intensity files, existing recipe, save image

dan align lanes. Tahapan selanjutnya yaitu pemasangan flow cell yang telah

diklasterisasi melalui cBot cluster generation pada flow cell stage. Sekuensing

dilakukan selama sekitar 11 hari dengan panjang pembacaan DNA 2 x 101 siklus.

Tahapan terakhir setelah proses sekuensing selesai dilakukan yaitu dengan

dipindahkannya flow cell dari flow cell stage dan dilakukannya post-run

sequencing yaitu maintenance wash. Tahapan maintenance wash terdiri dari

pembilasan dengan menggunakan air dan NaOH.

HASIL

Hasil DNA Genom Kentang

Isolasi DNA genom kentang dari empat genotipe yaitu CIP 392781, PT 29,

Amudera dan Margahayu dilakukan dengan metode Doyle & Doyle (1987) yang

dimodifikasi. Analisis kualitas pustaka genom kentang dilakukan menggunakan

gel agarosa 1%. DNA genom kentang berhasil diisolasi dengan baik yang

ditunjukkan dengan ukuran pita-pita DNA yang semakin tinggi dari marker dan

semakin mendekati ke sumur gel. Marker DNA yang digunakan adalah 100 bp

(Gambar 1).

Analisis kuantitatif DNA genom kentang diukur menggunakan nanodrop

spektrofotometer. Pengukuran dilakukan untuk melihat kemurnian DNA genom

kentang dari kontaminasi polisakarida (A260/230) dan protein (A260/280). Tabel 1

menunjukkan masing-masing genotipe kentang menghasilkan DNA dengan

konsentrasi yang tinggi (1039 ng/uL – 3222.5 ng/uL) dan hanya genotipe

Amudera yang memiliki konsentrasi DNA yang rendah yaitu 197.8 ng/uL.

Kemurnian dari masing-masing genotipe kentang sangat murni yang dapat

diketahui dari nilai rasio yang masih berada pada rentang ukuran 1.8-2.0.

Gambar 1 Elektroforegram DNA genom hasil isolasi kentang genotipe 1.

CIP 392781, 2. PT 29, 3. Amudera dan 4. Margahayu

Tabel 1 Kuantitas dan kemurnian DNA genom total kentang.

Genotipe [Asam nukleat] (ng/uL) A260/280 A260/230

CIP 392781 2787.5 1.93 2.17

PT.29 3222.5 1.95 2.1

Amudra 197.8 1.86 2.44

Margahayu 1039 1.96 2.20

9

Analisis kuantitatif DNA genom kentang selanjutnya yaitu DNA double

stranded (dsDNA) ditunjukkan oleh Tabel 2. Pengukuran dsDNA dilakukan

menggunakan fluorometer. Hasil pengukuran dsDNA menunjukkan konsentrasi

dsDNA yang terdapat pada masing-masing genotipe memenuhi untuk tahapan

fragmentasi. Perhitungan bobot dsDNA untuk konstruksi pustaka genom ini

diperoleh dengan perhitungan :

Tabel 2 Konsentrasi double stranded DNA hasil isolasi

Genotipe [Qubit] (ug/mL)

Faktor

pengenceran [ds DNA] (ng/uL)

CIP 392781 2.31 100 231

PT.29 1.43 100 143

Amudra 0.482 200 96.4

Margahayu 0.353 200 70.6

Konstruksi Pustaka Genom DNA Kentang

Fragmentasi DNA Genom Kentang

Pita-pita DNA hasil dari fragmentasi DNA menggunakan prinsip sonikasi

dapat dilihat pada gambar 2. Pita-pita DNA yang smear menunjukkan bahwa

DNA tersebut telah berhasil difragmentasi pada ukuran yang diharapkan (300-400

bp) dengan intensitas yang lebih terang yang berarti bahwa konsentrasi DNA

tinggi terpotong pada ukuran 300-400 bp. Ukuran 300-400 bp dipilih karena

ukuran optimal yang disarankan Illumina untuk proses sekuensing yaitu <800 bp.

Modifikasi Ujung Fragmen DNA

Pengukuran terhadap konsentrasi DNA genom kentang hasil modifikasi

ujung fragmen DNA diukur menggunakan nanodrop spektrofotometer dapat

dilihat pada Tabel 3. Konsentrasi DNA yang diukur mengalami pengurangan pada

setiap tahapannya. Kemurnian DNA genom kentang 4 genotipe cukup murni dari

kontaminasi protein dan polisakarida yang ditunjukkan oleh nilai rasio A260/280 dan

A260/230 yang masih dalam rentang kualitas yang baik (1.8-2.0).

Gambar 2 Elektroforegram DNA genom kentang hasil fragmentasi

Genotipe 1. CIP 392781; 2. PT 29

10

Adenilasi Ujung 3’OH dan Ligasi Adaptor

Pengukuran terhadap kuantitas dan kemurnian DNA setelah adenilasi ujung

3’OH dan ligasi adaptor diukur menggunakan nanodrop spektrofotometer. Hasil

pengukuran pada Tabel 4 menunjukkan konsentrasi DNA yang semakin

berkurang dari tahapan sebelumnya. Kemurnian DNA yang diperoleh sudah

murni sementara untuk genotipe CIP 392781 tidak diukur karena DNA yang

tersisa telah terkontaminasi oleh manik-manik paramagnetik.

Pemurnian DNA Setelah Ligasi Adaptor

Elektroforegram dari 2 genotipe kentang hasil pemurnian produk ligasi yaitu

genotipe Amudera dan Margahayu dapat dilihat pada Gambar 3. Pemurnian DNA

dilakukan dengan menggunakan gel agarosa 2% dan berhasil memisahkan DNA

hasil ligasi adaptor yang berukuran 400-500 bp. Pemisahan dapat diketahui dari

pita-pita DNA yang smear dan pada ukuran yang diharapkan DNA ditampung di

dalam suatu lubang yang sejajar dengan marker DNA 400 bp. Marker DNA yang

digunakan adalah marker DNA 400 bp.

Tabel 3 Kuantitas dan kemurnian DNA setelah tahapan purifikasi modifikasi

ujung fragmen DNA

Genotipe [Asam nukleat] (ng/uL) A260/280 A260/230

CIP 392781 54.7 2.33 1.35

PT.29 107.1 1.99 2.29

Amudra 91.4 2.04 2.45

Margahayu 83.2 2.09 2.34

Tabel 4 Kuantitas dan kemurnian DNA setelah tahapan adenilasi ujung 3’ dan

ligasi adaptor

Genotipe [Asam nukleat] (ng/uL) A260/280 A260/230

CIP 392781 Td Td Td

PT.29 44.6 2.02 2.19

Amudra 47.5 1.97 2.01

Margahayu 40.9 2.0 2.03

Ket : Td = tidak diukur

Gambar 3 Elektroforegram DNA hasil purifikasi produk ligasi Genotipe 1.

Amudera dan 2. Margahayu

11

Perbanyakan DNA Setelah Pemurnian DNA Fragmen

Kuantitas dan kemurnian DNA setelah tahapan pemurnian produk ligasi dan

perbanyakan fragmen DNA menggunakan perbanyakan PCR menunjukkan

jumlah kuantitas asam nukleat yang diukur semakin berkurang dari tahapan

sebelumnya dan terdapat kontaminasi pada beberapa genotipe. Berkurangnya

konsentrasi pada setiap tahapannya dikarenakan seleksi-seleksi yang telah

dilakukan oleh pereaksi untuk menghasilkan pustaka yang ideal. Kontaminasi

yang terjadi juga diakibatkan oleh manik-manik paramagnetik yang masih

tertinggal di dalam larutan DNA hasil pemurnian. Kentang genotipe CIP 392781

dan Amudera mengalami kontaminasi oleh protein dengan nilai A260/280 sebesar

1.78 dan 1.53 (Tabel 5) dimana nilai tersebut berada di bawah rentang yang ideal

(1.8-2.0). Kentang genotipe CIP 392781 dan Margahayu juga mengalami

kontaminasi oleh polisakarida dengan nilai A260/230 masing-masing sebesar 1.62

dan 1.33 (Tabel 5).

Perbanyakan dilakukan pada pustaka DNA hasil pemurnian produk ligasi

yang telah berhasil menyeleksi pustaka berukuran 400-500 bp dan selanjutnya

dilakukan uji kualitas untuk mengetahui ukuran pustaka yang diseleksi. Uji

kualitas menggunakan gel agarosa 2% menunjukkan bahwa pustaka DNA pada

ukuran yang diharapkan (400-500 bp) telah berhasil diperbanyak (Gambar 4).

Pita-pita DNA pada ukuran tersebut disejajarkan dengan marker 100 bp dan hasil

yang terlihat yaitu pita-pita DNA yang berukuran 400-500 bp.

Validasi Kualitas dan Kuantitas Pustaka Genom Kentang

Kualitas dan kuantitas pustaka genom kentang divalidasi dengan

menggunakan bioanalyzer untuk uji kualitas dan qPCR untuk uji kuantitas.

Pengujian kualitas juga dilakukan dengan menggunakan software photocap_MW.

Ukuran fragmen pustaka yang diukur menggunakan bionalyzer yaitu kentang

genotipe CIP 392781 dan PT 29 dengan ukuran masing-masing 324 bp dan 360

Tabel 5 Kuantitas dan kemurnian DNA setelah tahapan pemurnian setelah

tahapan purifikasi produk ligasi dan perbanyakan fragmen DNA

Genotipe [Asam nukleat] (ng/uL) A260/280 A260/230

CIP 392781 17.7 1.78 1.62

PT.29 10.8 1.95 4.47

Amudra 3 1.53 2

Margahayu 3.8 2.67 1.33

Gambar 4 Elektroforegram DNA genom kentang hasil amplifikasi dari kiri

ke kanan : CIP 392781 dan PT 29

12

bp. Kentang genotipe Amudera dan Margahayu dianalisis ukuran fragmennya

menggunakan software dan hasil yang diperoleh kentang genotipe Amudera dan

Margahayu masing-masing berukuran 568 bp dan 471 bp terlihat pada Tabel 6.

Pita-pita pustaka genom yang telah dikonstruksi juga dapat terlihat dengan jelas

pada alat bioanalyzer (Gambar 4).

Sebelum dianalisis menggunakan software photocap_MW terlebih dahulu

pustaka genom kentang yang telah dikonstruksi dielektroforesis pada gel agarosa

2% dan gambar ditangkap menggunakan UV transilluminator dan selanjutnya

dianalisis dimana hasil analisis dapat dilihat pada Gambar 6.

Hasil analisis kuantitas dari pustaka genom kentang yang telah berhasil

dikonstruksi dilakukan dengan menggunakan quantitatif PCR dapat dilihat pada

Tabel 7. Hasil pengukuran selanjutnya akan digunakan untuk menghitung

Tabel 6 Kualitas dan kuantitas pustaka genom kentang menggunakan

bioanalyzer dan software photocap_MW

Genotipe Ukuran Fragmen [ Pustaka ] pg/ul

CIP 392781 324 5578

PT.29 360 4452

Amudra 568 -

Margahayu 471 -

Gambar 5 Elektroforegram pustaka genom kentang dengan analisis

bioanalyzer

Gambar 6 Kualitas pustaka genom kentang menggunakan photocap_MW

13

kebutuhan pustaka genom yang ideal untuk tahapan selanjutnya yaitu klasterisasi

dan sekuensing DNA. Minimal jumlah pustaka DNA genom kentang yang

diperlukan untuk sekuensing yaitu 2 nM. Hasil kuantitas pengukuran qPCR yang

diperoleh masing-masing genotipe kentang yaitu CIP 392781, PT 29, Amudera

dan Margahayu yaitu masing-masing sebesar 60.14 nM, 34.64 nM, 17.76 nM dan

13.08 Nm (Tabel 7). Hasil pengukuran rata-rata masing-masing kentang diperoleh

dari perhitungan:

Rerata kuantitas dapat dilihat pada lampiran 2.

Klasterisasi dan Sekuensing Pustaka Genom Kentang

Jumlah Basa dan Kualitas Klaster Pustaka Genom secara Umum

Hasil sekuensing pengukuran jumlah basa dan kualitas klaster pustaka

genom secara umum yang disekuensing menggunakan alat sekuensing Illumina

Hiseq 2000 yang menggunakan prinsip sekuensing oleh sintesis dilihat pada Tabel

8. Sebelum sekuensing terlebih dahulu pustaka genom dimasukkan ke dalam

suatu flow cell dan diklasterisasi dengan alat yang bernama cBOT cluster

generation. Tipe pembacaan sekuensing yang dipilih pada pustaka sekuensing

pustaka genom ini adalah tipe pembacaan paired end dengan 2 x 100 siklus.

Secara umum jumlah basa dan kualitas pustaka genom kentang menghasilkan

nilai yield total dan projected total yield yang sama yaitu 287.2 Gbp (Tabel 8).

Artinya, total jumlah basa yang dihasilkan sama dengan jumlah basa yang

diprediksi sebelumnya.

Densitas dan Kualitas Pustaka Genom Kentang pada Lajur dalam Flow Cell

Pengukuran kualitas klaster dari empat genotipe kentang dilakukan untuk

menghitung kerapatan klaster di dalam suatu lajur pada flow cell. Hasil

sekuensing menunjukkan bahwa densitas klaster pustaka genom yang dihasilkan

Tabel 7 Kuantitas pustaka genom kentang diukur menggunakan qPCR

Genotipe [Ukuran rata-rata] (nM)

CIP 392781 60.14

PT.29 34.64

Amudra 17.76

Margahayu 13.08

Tabel 8 Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing

secara umum

Yield Total

(Gbp)

Projected Total

Yield (G)

Yield

Perfect

(G)

Yield <=

3 errors

(G)

%

Perfect

[Num

Cycles]

% <= 3

errors [Num

Cycles]

287.2 287.2 5.1 6.1 82[99] 97.55 [99]

14

tinggi (Tabel 9). Densitas klaster pustaka genom termasuk kategori ideal jika

klaster pustaka genom memilki densitas berkisar dari 400-600 K/mm2.

Salah satu contoh histogram jumlah klaster pada lajur dapat dilihat pada

Gambar 7. Contoh yang digunakan adalah kentang genotipe Amudera pada lajur 1.

Berdasarkan kualitas sekuen yang dihasilkan yaitu diperoleh nilai Q scores 92.5%

dengan jumlah basa yang dibaca sebanyak 31.7 Gbp (Gambar 7).

Tingkat Kesalahan (Error Rate), Nilai Penyejajaran (Aligned) dan Intensitas

Basa Hasil Sekuensing

Pengukuran yang dilakukan selanjutnya adalah analisis terhadap tingkat

kesalahan (error rate), nilai penyejajaran (aligned) dan intensitas basa hasil

sekuensing. Masing-masing pustaka genom mengalami dua kali pembacaan (Read

1 dan read 2). Setiap pembacaan mengukur hal yang sama dan menghasilkan hasil

yang berbeda untuk intensitas siklus I dan % intensitas siklus 20 (Tabel 10).

Rerata error pada siklus 100 yaitu sebesar 0.00 % yang menunjukkan sekuensing

berjalan dengan sangat baik dan tidak ada kesalahan. Intensitas siklus yang

dihasilkan juga tergolong ideal (nilai intensitas ideal 1000) dimana masing-

Tabel 9 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing

Lajur Densitas

(K/mm2)

Klaster

PF (%)

Phasing

(%)

Pre

phasing

(%)

Reads

(M)

Reads

PF

(M)

% >=

Q30

CIP 392781 779 93.1 0.173 0.287 215.4 199.8 94

PT 29 766 93.1 0.178 0.285 211.9 196.6 94.1

Amudra 633 95 0.182 0.302 174.87 165.8 92.75

Margahayu 881 89.3 0.174 0.277 243.68 216.9 88.4

Gambar 7 Histogram jumlah klaster berdasarkan kualitas sekuen yang

dihasilkan

15

masing nilai baik pada pembacaan 1 maupun 2 berada pada nilai 4736 hingga

5531.

PEMBAHASAN

Hasil Isolasi DNA Genom Kentang

DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh suatu

organisme termasuk didalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein dan RNA

(Weaver & Hedrick 1997). Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari

molekul lain seperti dinding sel, membran sel, dan membran inti sehingga

strukturnya dapat terlihat dengan jelas. Tujuannya adalah mengidentifikasi dan

mengkarakterisasi DNA yang dibutuhkan untuk proses analisis molekuler lainnya.

Berbagai teknis analisis dalam pemuliaan tanaman dan biologi molekuler

berdasarkan pada hibridisasi molekuler dan polymerase chain reaction (PCR)

membutuhkan DNA dalam jumlah dan kualitas yang baik. Kandungan senyawa

sekunder dalam sel tanaman berbeda beda maka setiap tanaman membutuhkan

prosedur isolasi yang optimum agar diperoleh DNA genom yang dapat digunakan

untuk proses analisis biomolekuler lainnya (Prahaditya 2013).

Metode isolasi DNA genom pada penelitian ini menggunakan metode Doyle

& Doyle (1987) yang dimodifikasi. Ekstraksi DNA menggunakan prosedur ini

pada prinsipnya menggunakan cetil trimetil ammonium bromide (CTAB) yang

berfungsi untuk mendegradasi senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada

tanaman. Modifikasi yang dilakukan terdapat pada penambahan natrium disulfida

dan polivinilpirolidon 2% ke dalam buffer CTAB 2% yang berguna sebagai

antioksidan pencegah warna coklat polifenol saat penggerusan. Pengendapan

Tabel 10 Tingkat kesalahan (error rate), nilai penyejajaran (aligned) dan

intensitas basa hasil sekuensing

Read Lajur Aligned

(%)

Error

Rate

(%)

Error Rate

100 cycle

(%)

Intensity

cycle I

%

Intensity

Cycle 20

1 CIP 392781 1.3 0.3 0.00 5466 81.8

PT 21 1.2 0.28 0.00 5331 81.6

Amudera 3.0 0.36 0.00 5531 81.0

Margahayu 1.6 0.41 0.00 4954 80.9

2 CIP 392781 1.3 0.74 0.00 4845 81.9

PT 21 1.2 0.72 0.00 4736 81.5

Amudera 2.9 0.67 0.00 4764 84.4

Margahayu 1.5 1.01 0.00 4408 80.9

16

menggunakan isopropanol pada metode Doyle & Doyle dilakukan pada suhu

ruang selama satu malam, namun pada penelitian ini pengendapan isopropanol

dilakukan selama 1 jam pada suhu -20oC dan juga untuk pengeringan hanya

membutuhkan waktu 15 menit menggunakan vakum evaporator.

Uji terhadap kualitas DNA hasil isolasi dapat diketahui dengan teknik

elektroforesis. Elektroforesis merupakan suatu cara untuk memisahkan fraksi-

fraksi campuran berdasarkan pergerakan partikel-partikel koloid bermuatan yang

dipengaruhi medan listrik. Elektroforesis umumnya digunakan untuk menentukan

berat molekul, mendeteksi kemurnian, dan kerusakan protein atau asam nukleat,

menetapkan titik isolistrik serta memisahkan spesies-spesies yang berbeda secara

kualitatif dan kuantitatif. Oleh karena itu, metode elektroforesis banyak digunakan

untuk analisis asam nukleat, virus, enzim dan protein (Bintang 2010).

DNA genom kentang dari 4 genotipe telah berhasil diisolasi dengan baik

yang ditandai dengan terbentuknya pita-pita DNA pada elektroforegram.

Elektroforegram merupakan hasil uji kualitatif terhadap DNA yang telah diisolasi.

DNA hasil isolasi dielektroforesis pada gel agarosa 1% dan menggunakan marker

DNA 100 bp. Keberhasilan atau kualitas DNA yang telah diisolasi merupakan

DNA genom terlihat dari letak pita DNA yang mendekati sumur dan juga

intensitas pita DNA yang tinggi dengan tidak adanya smear yang membuktikan

DNA tidak terdegradasi dan DNA yang diperoleh tersebut merupakan DNA

genom kentang yang utuh (Gambar 2). Elektroforesis gel akan memisahkan

molekul DNA sesuai dengan ukurannya dan semakin besar molekul DNA maka

pita DNA yang dihasilkan akan semakin dekat dengan sumur gel (Brown 2007).

Kuantitas hasil isolasi DNA genom kentang dapat diukur dengan

menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific pada panjang

gelombang 230 nm, 260 nm dan 280 nm. Uji kuantitas bertujuan untuk

mengetahui konsentrasi dan kemurnian dari DNA genom hasil isolasi. Panjang

gelombang 230 nm merupakan serapan maksimum untuk polisakarida, panjang

gelombang 260 merupakan panjang serapan maksimum untuk asam nukleat dan

panjang gelombang 280 nm merupakan serapan maksimum untuk protein.

Kemurnian DNA ditentukan melalui rasio perbandingan nilai absorbansi asam

nukleat (260 nm) dengan nilai absorbansi polisakarida (230 nm) untuk

menunjukkan kemurnian terhadap polisakarida dan perbandingan dengan nilai

absorbansi protein (280 nm) untuk menunjukkan kemurnian terhadap protein.

Hasil uji kuantitas DNA genom kentang memiliki konsentrasi asam nukleat

sebesar 2224.8 ng/uL – 11672.7 ng/uL dengan rasio A260/280 sebesar 1.86 – 1.96

dan rasio A260/230 sebesar 2.1 – 2.44 (Tabel 1). Terdapat satu genotipe yang

memiliki konsentrasi yang rendah yaitu sebesar 197.8 ng/uL dikarenakan sampel

DNA adalah sampel yang telah diisolasi dan disimpan dalam waktu yang cukup

lama. Sampel DNA genom kentang yang diisolasi dapat dikatakan sangat murni

dari kontaminasi baik dari protein maupun polisakarida karena masih berada pada

rentang ukuran 1.8-2.0. Yuwono (2005), menyatakan bahwa nilai kemurnian yang

kurang dari 1.8 menunjukkan bahwa sampel mengandung kontaminasi protein dan

polisakarida.

Fluorometer Qubit digunakan jika bekerja dengan sampel yang berharga

atau sangat sulit untuk diaplikasikan. Uji kuantitas selanjutnya dan sangat

dibutuhkan adalah uji konsentrasi dsDNA hasil isolasi. Alat ini berbeda dengan

nanodrop ataupun spektrofotometer lainnya karena alat ini hanya akan

17

menghitung molekul target seperti double standed DNA saja. Keuntungan

penggunaan fluorometer ini adalah akurasinya baik dan sangat teliti sehingga

mampu mendeteksi konsentrasi yang terendah sekalipun. Double stranded DNA

atau dsDNA biasanya digunakan untuk sampel yang akan disekuensing, sampel

DNA genom dan percobaan penelitian lainnya (Invitrogen 2010). Alat ini juga

dapat diaplikasikan untuk mengukur konsentrasi single standed DNA dan protein

target.

Pengukuran konsentrasi dsDNA dilakukan dengan pengenceran 100 dan

200 kali. Hasil yang diperoleh yaitu dalam setiap 1 ul DNA hasil isolasi terdapat

dsDNA dengan konsentrasi 70.6 ng/uL hingga 231 ng/uL (Tabel 2). Konsentrasi

dsDNA yang telah diukur ini akan sangat memudahkan untuk tahapan konstruksi

pustaka selanjutnya. Berat dsDNA yang dibutuhkan untuk tahapan awal

konstruksi pustaka awal yaitu saat fragmentasi adalah 1 ug jika volume DNA

yang tersedia sedikit dan 2.6 ug jika volume DNA yang tersedia banyak atau

dapat dikatakan konsentrasi dsDNA yang dibutuhkan hanya 20 ng/uL yang

diencerkan ke dalam 130 uL atau 55 uL buffer resuspensi. Volume DNA yang

harus diencerkan diperoleh dengan perhitungan yaitu 20 ng/uL x 130 ul dan

kemudian dibagi dengan konsentrasi dsDNA yang telah diukur.

Konstruksi Pustaka Genom DNA Kentang

Pustaka genom adalah sekumpulan klon yang mengandung DNA genom

total dari suatu organisme. Pustaka genom seharusnya mengandung seluruh

sekuen DNA dari suatu organisme (Lodish et al. 2000). Selain sebagai bahan

genetik, pustaka genom juga sangat bermanfaat untuk mengisolasi gen utuh yang

mengandung promoter, terminator dan intron untuk mengetahui regulasi ekspresi

gen. Peta fisik suatu genom juga membutuhkan pustaka genom, sehingga pustaka

genom merupakan bagian yang sangat penting dalam perbaikan genetika tanaman,

baik melalui teknologi DNA rekombinan maupun melalui pemuliaan

konvensional (Suharsono 2002).

Konstruksi pustaka genom kentang pada penelitian ini mengikuti protokol

TruSeq DNA low troughput protocol dari Illumina yang dimodifikasi pada

beberapa tahapannya. Tujuan dari protokol ini yaitu menambahkan sekuen

adaptor ke dalam ujung fragmen DNA untuk menghasilkan pembacaan ganda atau

sekuen ujung pasangan pustaka. Tahapan awal konstruksi pustaka genom kentang

ini setalah isolasi DNA genom utuh dari kentang yaitu dilakukannya pemotongan

DNA kentang pada panjang tertentu yang diharapkan potongan tersebut telah

dapat mewakilkan gen-gen penyandi genom kentang, modifikasi ujung DNA,

adenilasi ujung 3’OH dan ligasi adaptor, pemurnian produk ligasi dan

perbanyakan fragmen DNA secara invitro atau menggunakan PCR. Hasil

konstruksi dari pustaka genom nantinya dapat divalidasi agar dapat dilanjutkan ke

tahap berikutnya.

Hasil Fragmentasi DNA Genom Kentang

Fragmentasi atau pemotongan DNA genom kentang dilakukan secara fisik

dengan alat Covaris yang menggunakan prinsip sonikasi untuk memotong DNA

genom secara acak pada kisaran pemotongan 300-400 bp. Pemilihan potongan

18

DNA pada 300-400 bp karena ukuran ideal pustaka genom yang disarankan oleh

illumina adalah < 800 bp karena pustaka yang berukuran sangat panjang ataupun

sangat pendek dapat mempengaruhi keakuratan data yang dihasilkan pada saat

proses sekuensing berlangsung. Alat Covaris ini dilengkapi dengan tabung

Covaris yang didesain secara khusus untuk pemotongan DNA. Alat ini tidak

membutuhkan DNA dalam jumlah besar untuk melakukan pemotongan. Covaris

akan memotong dan menghasilkan fragmen dsDNA dengan ujung 3’ atau 5’

overhang. Konsentrasi dsDNA yang dibutuhkan yaitu 20 ng/uL yang dilarutkan

ke dalam buffer resuspensi dengan berat akhir DNA 1 ug dan 2.6 ug. Buffer

resuspensi ini akan tetap menjaga DNA dalam kondisi yang baik dan stabil dan

juga dapat melarutkan kembali DNA setelah DNA berinteraksi dengan banyak

pereaksi yang digunakan. Kelebihan pemotongan dengan menggunakan covaris

ini adalah konsentrasi DNA yang dibutuhkan untuk pemotongan tidak banyak

namun harus benar-benar dsDNA dan juga dapat meminimalisir terbuangnya

DNA secara percuma. Sampel DNA dengan bobot DNA dari 50 ng- 2 ug

pertabungnya dapat dipotong dengan menggunakan M220 (Covaris 2012).

Fragmentasi DNA merupakan suatu proses yang mendeskripsikan cara

memperoleh fragmen DNA genom optimal yang mengandung pustaka akhir pada

rerata panjang ukuran 300-400 bp dan merupakan tahapan yang paling kritis.

Illumina menyarankan untuk hasil optimal potongan DNA pada 300-400 bp,

sedangkan untuk perbanyakan eksom bisa pada ukuran 200-300 bp (Illumina

2010a). Hasil fragmentasi DNA kemudian dapat diperiksa dengan dielektroforesis

pada gel agarosa 2% selama 40 menit. Gambar 3 merupakan elektroforegram

fragmen DNA genom yang sudah difragmentasi menggunakan Covaris.

Elektroforegram ini memperlihatkan pita hasil DNA genom yang smear pada

ukuran 200 hingga 1200 bp, ukuran yang nantinya akan dipilih adalah DNA yang

berukuran 300-400 bp. DNA yang berukuran lebih besar ataupun lebih kecil dari

ukuran yang diharapkan nantinya akan diseleksi pada tahapan-tahapan konstruksi

pustaka selanjutnya dengan menggunakan pereaksi-pereaksi yang spesifik.

Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA

Modifikasi ujung fragmen DNA atau perform end repair merupakan suatu

tahapan setelah pemotongan DNA genom menggunakan covaris. Proses ini akan

mengubah ujung lengket hasil dari fragmentasi ke dalam ujung tumpul (blunt end)

menggunakan end repair mix. End repair mix mengandung enzim eksonuklease

dan polymerase. Aktivitas 3’-5’ eksonuklease akan menghilangkan atau

memotong pada ujung 3’ dan aktivitas polymerase akan memenuhi atau membuat

ujung 5’ (Illumina 2010a). Tahapan modifikasi ujung terdiri dari memasukkan end

repair mix untuk modifikasi, inkubasi untuk mengoptimalkan reaksi dan proses

pembuatan ujung dan selanjutnya adalah proses clean up atau pembersihan sisa-

sisa pereaksi yang tidak bereaksi dengan DNA dan juga dengan menambahkan

AMPure XP beads ke dalam tabung dimana AMPure XP beads ini akan mengikat

DNA dan menghilangkan kelebihan-kelebihan pereaksi yang digunakan. AMPure

XP beads mengandung silika dan manik-manik paramagnetik yang dengan

bantuan medan magnet akan mengikatkan fragmen DNA pada dinding tabung.

Sehingga, pada saat pencucian dengan etanol 80% fragmen DNA tidak ikut

terbuang bersama supernatan.

19

Pengukuran konsentrasi hasil modifikasi ujung DNA dapat diukur dengan

menggunakan nanodrop untuk mengetahui konsentrasi dan kemurniannya dan hal

ini bisa dilakukan jika supernatan yang digunakan masih tersisa di dalam tabung

dan tidak mengurangi jumlah larutan DNA untuk tahapan selanjutnya. Tabel 3

merupakan jumlah konsentrasi dan kemurnian DNA setelah tahapan pembersihan

ujung fragmen DNA. Konsentrasi asam nukleat yang dihasilkan sebesar 54.7

ng/uL hingga 107.1 ng/uL dengan tingkat kemurnian A260/280 sebesar 1.99-2.33

dan rasio A260/230 sebesar 1.35 – 2.45 (Tabel 3). Hal ini dapat menunjukkan DNA

yang telah dimodifikasi murni dari kontaminasi protein karena nilai yang

ditunjukkan tidak terlalu berbeda dengan rentang nilai yang seharusnya, dan

kemurnian dari polisakarida untuk sampel dengan genotipe CIP 392781 kurang

(<1.8) tapi tidak terlalu mempengaruhi terhadap kualitas pustaka modifikasi ujung

fragmen DNA karena DNA yang digunakan pada pengukuran ini adalah DNA

yang tersisa dan mungkin diakibatkan tidak teliti dalam penggunaan mikropipet.

Hasil dari modifikasi ujung fragmen DNA kemudian dapat dilanjutkan ke tahapan

adenilasi ujung 3’OH dan ligasi adaptor.

Hasil Adenilasi Ujung 3’OH dan Ligasi Adaptor

Adenilasi bertujuan mencegah ligasi antar fragmen DNA dan menyiapkan

DNA sebelum ligasi adaptor. Sebuah nukleotida adenin ditambahkan ke ujung 3’

dari fragmen tumpul untuk mencegah DNA saling berligasi satu sama lain selama

reaksi ligasi adaptor. Kecocokan nukleotida tunggal T pada ujung 3’ akan

menyediakan adaptor untuk melengkapi overhang untuk ligasi adaptor pada

fragmen. Strategi ini memastikan rendahnya kecepatan terbentuknya chimera

(jalinan-jalinan template) (Illumina 2010a). A tailing mix dalam adenilasi akan

membuat fragmen DNA menjadi kompatibel dengan adaptor dan mencegah ligasi

sendiri (self ligation) dengan penambahan adenin tersebut pada 3’overhang.

Ligasi adaptor merupakan proses yang akan melekatkan indeks atau adaptor

penunjuk pada ujung fragmen DNA dan menyiapkan pengikatan pustaka untuk

hibridisasi di atas suatu flow cell. Proses ligasi adaptor menggunakan adaptor

indeks nomor 2 (AD002) yang berisi sekuen nukleotida CGATGT (A) dan DNA

ligation mix yang menghubungkan adaptor untuk disisipkan (Illumina 2010a).

Stop ligation buffer ditambahkan secepatnya ke dalam tabung setelah proses

inkubasi untuk menghentikan proses ligasi. Karena proses ligasi yang terjadi terus

menerus tanpa dihentikan dengan cepat dapat mengakibatkan saling terjalinnya

nukleotida sehingga tidak menghasilkan pustaka yang sesuai ataupun dapat

mengakibatkan adaptor saling menempel satu sama lain.

Supernatan yang tersisa setelah proses tahapan pembersihan adenilasi ujung

3’OH dan ligasi adaptor kemudian diukur konsentrasi atau kuantitas dan

kemurnian DNA nya. Konsentrasi asam nukleat pada tahapan ini mengalami

penurunan jika dibandingkan dengan tahapan sebelumnya. Hal ini disebabkan

karena semakin banyak seleksi yang dilakukan sehingga nantinya didapatkan

pustaka DNA yang akurat. Konsentrasi asam nukleat yang diperoleh yaitu sebesar

40.9 ng/uL hingga 47.5 ng/uL dengan tingkat kemurnian A260/280 pada rentang

1.97 hingga 2.0 (Tabel 4). Terdapat satu genotipe (CIP 392781) yang tidak diukur

konsentrasi dan kemurniannya dikarenakan sisa supernatan setelah pembersihan

tidak mencukupi dan banyak terkontaminasi oleh manik-manik paramagnetik.

20

Kesalahan pengukuran atau penggunaan pipet dalam hal ini sangat diperhatikan

agar hasil yang diperoleh optimal. Supernatan yang tidak tersisa mungkin

disebabkan oleh kesalahan dalam proses penggunaan pipet.

Hasil Pemurnian DNA setelah Ligasi Adaptor

Pemurnian produk hasil ligasi adaptor dilakukan dengan menggunakan gel

agarosa 2%. Proses pemurnian reaksi produk ligasi dilakukan pada sebuah gel dan

akan mengangkat adaptor-adaptor yang tidak menempel, adaptor yang terligasi

baik satu sama lainnya, dan melakukan seleksi ukuran dari sekuensing pustaka

untuk menghasilkan kelompok (cluster) yang cocok (Illumina 2010a). Tahapan

pemurnian ini mengalami sedikit modifikasi dari protokolnya yaitu saat

dielektroforesis pada gel elektroforesis selama 60 menit dengan 100 volt

sementara aturan prosedur yaitu 120 volt dan 120 menit. Optimasi telah dilakukan

sebelumnya oleh Satyawan (2014), dimana ke dalam tabung yang berisi DNA

hasil ligasi langsung ditambahkan blue juice sebagai pemberat dan pemberi warna

DNA sedangkan pewarna SyBr Gold langsung dicampurkan ke dalam gel agarosa

2% untuk deteksi yang lebih akurat.

Gambar 4 merupakan perwakilan dari beberapa genotipe kentang hasil

pemurnian setelah ligasi adaptor. Genotipe yang mewakili yaitu Amudera dan

Margahayu. Pita-pita DNA yang smear ditunjukkan berada pada ukuran yang

diharapkan yaitu 300-400 bp dengan marker 100 bp. Pita DNA yang smear ini

menunjukkan ukuran-ukuran terpotongnya DNA dimana pada ukuran 300-400 bp

intensitas DNA sedikit tinggi sehingga DNA dapat dipotong pada ukuran tersebut.

Pemotongan tersebut dilakukan dengan cara mengiris gel pada ukuran DNA 300-

400 bp dan kemudian gel yang telah diiris dimasukkan ke dalam tabung untuk

kemudian disimpan dan digunakan pada tahapan selanjutnya. Ukuran-ukuran ini

diseleksi sesuai dengan ukuran pustaka yang dibutuhkan (<800 bp) untuk

sekuensing menggunakan NGS. Tahapan terakhir dari konstruksi pustaka genom

yang dilakukan adalah perbanyakan DNA hasil pemurnian ligasi adaptor yaitu

perbanyakan DNA yang berukuran 300-400 bp.

Hasil Perbanyakan DNA setelah Pemurnian DNA Fragmen

Perbanyakan DNA atau enrichment DNA fragment setelah tahapan

pemurnian produk ligasi dilakukan dengan menggunakan PCR untuk menyeleksi

perbanyakan fragmen DNA yang mempunyai adaptor pada kedua ujungnya dan

untuk diperbanyak menjadi banyak DNA pustaka. PCR primer cocktail akan

menempel ke ujung daripada adaptor. Jumlah siklus PCR juga harus

diminimalkan untuk mencegah penggambaran pustaka yang tidak simetris

(Illumina 2010a). Tahapan predenaturasi dilakukan selama 30 detik pada suhu

980C dan kemudian dilanjutkan dengan siklus PCR sebanyak 10 siklus dengan

rincian denaturasi pada 980C selama 10 detik, penempelan atau annealing pada

suhu 60oC selama 30 detik dan dilanjutkan dengan tahapan pemanjangan atau

extention pada suhu 720C selama 30 detik. Tahapan setelah pemanjangan

dilakukan selama 5 menit pada suhu 720C dan kemudian siklus ditahan pada suhu

40C. Pada perbanyakan DNA setelah pemurnian ini hanya DNA yang berukuran

300-400 bp yang telah ditempeli adaptor pada kedua ujungnya yang diperbanyak.

21

Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah tahapan perbanyakan fragmen

DNA dapat diukur dengan menggunakan nanodrop sedangkan uji kualitas hasil

perbanyakan dapat diketahui dengan elektroforesis DNA pada gel agarosa 2%.

Supernatan yang tersisa pada tabung dapat digunakan untuk pengukuran setelah

proses pembersihan perbanyakan fragmen DNA. Kuantitas atau konsentrasi asam

nukleat yang diperoleh yaitu sebesar 3 ng/uL hingga 17.7 ng/uL dengan tingkat

kemurnian A260/280 yang diperoleh sebesar 1.53 hingga 2.67 dan kemurnian

terhadap polisakarida A260/230 yang diperoleh sebesar 1.62 hingga 4.47 (Tabel 5).

Kemurnian yang kecil yaitu <1.8 dan yang melebihi nilai 2 mungkin disebabkan

pada saat pengukuran masih terkontaminasi oleh manik-manik paramagnetik.

Kualitas pustaka hasil perbanyakan fragmen DNA ditunjukkan oleh

elektroforegram pada gambar 5 yang menunjukkan bahwa pita-pita DNA berada

pada ukuran yang diharapkan yaitu 400-500 bp dan ukuran ini masih berada pada

rentang ukuran ideal dari pustaka genom.

Hasil Validasi Kualitas Dan Kuantitas Pustaka Genom Kentang

Pustaka genom kentang yang telah berhasil dikonstruksi dapat diukur

kualitas dan kuantitasnya untuk memudahkan pada tahap klasterisasi dan

sekuensing DNA. Kualitas pustaka genom kentang yang telah berhasil

dikonstruksi dapat diukur ukuran fragmennya dengan menggunakan instrumen

bioanalyzer dan analisis menggunakan software photocap_MW. Analisis terhadap

kuantitas pustaka genom hasil konstruksi dapat dilakukan dengan menggunakan

quantitative PCR (qPCR). Analisis ini masing-masing hanya menggunakan DNA

hasil pustaka yang sedikit (±2 ul) sehingga jumlah pustaka DNA yang nantinya

akan digunakan untuk klasterisasi dan sekuensing masih terpenuhi. Terdapat

perbedaan antara bionalyzer dan qPCR selain masing-masingnya untuk analisis

kualitatif dan kuantitatif. Instrumen bioanalyzer selain digunakan untuk analisis

kualitas juga dapat mengukur kuantitas pustaka DNA namun instrumen ini akan

membaca semua pustaka berdasarkan potongannya. Sementara itu, qPCR hanya

akan mengukur pustaka yang memiliki fragmen yang ditempeli adaptor pada

kedua ujungnya dan juga menggunakan 2 primer sehingga data kuantitas lebih

akurat.

Kualitas pustaka genom hasil konstruksi dapat diketahui dengan

menggunakan alat bionalyzer dari agilent. Alat bionalyzer dapat mengetahui

secara spesifik atau secara tepat potongan ukuran dari fragmen DNA pustaka.

Pengukuran fragmen DNA pustaka menghasilkan ukuran pustaka yang baik yaitu

<800 bp, ukuran fragmen pustaka genotipe CIP 392781 dan PT.29 yaitu pada 324

bp dan 360 bp dengan konsentrasi pustaka sebesar 5578 Pg/ul dan 4452 Pg/ul.

Beberapa genotipe kentang diukur dengan menggunakan analisis software

photocap_MW. Sebelumnya, pustaka yang telah dianalisis kuantitasnya

menggunakan qPCR dielektroforesis pada gel agarosa 2% dan gambar yang

berhasil ditangkap didokumentasikan dan dianalisis menggunakan software

sehingga hanya menghasilkan ukuran saja tanpa bisa menghitung konsentrasi

pustaka akhir. Hasil yang didapatkan yaitu ukuran fragmen sebesar 568 bp untuk

genotipe Amudera dan 471 bp untuk genotipe Margahayu (Tabel 6). Ukuran ini

masih memenuhi ukuran ideal yang dibutuhkan untuk klasterisasi dan sekuensing

pustaka genom kentang.

22

Bionalyzer terdiri dari sebuah alat yang terhubung dengan sebuah komputer

dan software didalamnya dan chip atau lempeng yang kompatibel yang

menghasilkan pita-pita DNA saat pembacaannya. Chip agilent ini dapat

digunakan untuk mengukur DNA, RNA dan protein dengan prinsip pengujian

yang sama. Prinsip pengujian elektroforesis yang didasarkan pada prinsip gel

elektroforesis yang dipindahkan ke dalam bentuk lempengan. Bentuk lempengan

akan mengurangi penggunaan waktu dan penggunaan sampel. Pengujian kuantitas

DNA dan protein dapat diselesaikan dengan bantuan “upper marker”. Peak

sampel berada dibawah daerah upper marker dan karena konsentrasi upper marker

telah diketahui maka konsentrasi tiap sampel juga dapat dihitung (Agilent

Technologies 2003). Hasil pengukuran dengan bioanalyzer juga dapat

menghasilkan data berupa gambar elektroforegram dengan pita-pita yang tajam

dan ukuran yang sangat spesifik (Gambar 5).

Metode deteksi dengan qPCR merupakan sebuah proses dimana reaksi PCR

ini mengandung enzim dNTPs, buffer dan SyBr Green I, primer dan template.

SyBr Green I tidak memiliki fluororescen yang signifikan terhadap kehadiran

single stranded DNA (ssDNA). Proses selanjutnya yaitu produk dsDNA akan

berinteraksi dengan SyBr Green I dan menjadi sebuah produk yang bersinar.

Ketika produk sudah cukup terakumulasi maka fluororescen akan meningkat lebih

tinggi dibanding sebelumnya dan ini dinamakan dengan siklus ambang batas (Ct).

Nilai Ct kemudian digunakan untuk mengukur kuantitas jumlah template saat

dimulainya reaksi (Sigma 2008). Berdasarkan proses inilah maka konsentrasi

pustaka akhir yang dihasilkan dapat diketahui.

Nilai kuantitas pustaka genom kentang diukur menggunakan qPCR dengan

tiga kali pengenceran (1000, 2000 dan 4000) (Lampiran 2) pada genotipenya

menghasilkan kuantitas pustaka genom kentang dengan ukuran rata-rata sebesar

13.08 nM hingga 60.14 nM (Tabel 7) yang selanjutnya dapat digunakan untuk

perhitungan pustaka yang dibutuhkan untuk klasterisasi. Konsentrasi pustaka

genom kentang yang dibutuhkan untuk klasterisasi yaitu minimal 2 nM yang

diencerkan ke dalam Tris-Cl 10 mM pH 8.5 dan 0.1% Tween 20 untuk mencegah

absorbsi template ke tabung saat siklus karena dapat menurunkan jumlah

klasterisasi. Proses klasterisasi sendiri menggunakan pustaka DNA genom dengan

konsentrasi 13 pM, hasil ini diperoleh dari pengenceran stok pustaka DNA 2 nM.

Klasterisasi dan Sekuensing Pustaka Genom Kentang

Jumlah Basa dan Kualitas Klaster Pustaka Genom secara Umum

Sebelum dilaksanakan proses sekuensing, terlebih dahulu pustaka genom

diklasterisasi. Mardis (2008), mengatakan klasterisasi terlebih dahulu bertujuan

untuk menghasilkan klaster atau kelompok salinan dari pustaka genom yang akan

disekuen. Setelah proses klasterisasi, klaster pustaka genom tersebut kemudian

dimasukkan ke dalam alat NGS Hiseq 2000 untuk disekuensing. Basa penyusun

genom kentang berukuran 850 Mb satu salinannya menurut Potato Genome

Sequencing Consortium (2012) yang tersebar lebih dari 12 kromosom sementara

itu pengurutan basa penyusun genom kentang yang dilakukan pada penelitian ini

adalah pengurutan dari genotipe kentang yang autotetraploid.

23

Proses atau alur penghasilan klaster di dalam cBOT terdiri dari imobilisasi

dan ekstensi 3’, bridge amplification, linearisasi, dan hibridisasi (Lampiran 4).

Penambahan NaOH untuk denaturasi DNA ditambahkan diawal dan netralisasi

reaksi dilakukan dengan menambahkan HT1 buffer hibridisasi (Subtelny 2014).

Klaster yang telah dihasilkan diatas flow cell ini selanjutnya dapat digunakan

untuk proses sekuensing DNA genom kentang pada alat NGS Hiseq 2000.

Sekuensing ini juga dapat digunakan untuk menganalisis kualitas dari pustaka

genom yang telah dikonstruksi dan diklasterisasi sebelumnya. Proses analisis ini

dilakukan dengan melihat hasil pencitraan terhadap klaster pustaka genom saat

proses sekuensing berlangsung (Illumina 2011).

Secara total jumlah basa hasil sekuensing (yield total) diperoleh sebanyak

287.2 x 109 bp atau 287.2 Gbp dan hasil ini memiliki kesamaan dengan jumlah

basa yang diprediksi akan diperoleh selama proses sekuensing berlangsung

(projected total yield). Jumlah basa total dari hasil sekuensing ini sebenarnya

merupakan jumlah basa total dari beberapa sampel yaitu kentang, jagung dan

kakao yang saat proses sekuensing dilakukan pada saat bersamaan di dalam suatu

flow cell. Nilai projected total yield bergantung pada tipe pembacaan yang dipilih

selama proses sekuensing dimana NGS Hiseq 2000 memiliki empat tipe

pembacaan yaitu single read, paired end, multiplexed single read dan multiplexed

paired end. Penelitian ini menggunakan tipe pembacaan sekuensing adalah paired

end dengan jumlah siklus sebanyak 200 siklus.

Sekuenser sistem Hiseq ini mengadopsi teknologi sekuensing dengan

sintesis. Pustaka dengan adaptor yang sesuai didenaturasi menjadi untas tunggal

dan dicangkokan ke atas flow cell, diikuti dengan perbanyakan jembatan ke setiap

klaster yang mengandung klon fragmen DNA. Sebelum disekuensing, pustaka

disambung ke dalam utas tunggal dengan bantuan enzim linearisasi dan kemudian

empat jenis nukleotida (ddATP, ddGTP, ddCTP, dan ddTTP) yang mengandung

pewarna fluororescen berbeda dan menghilangkan kelompok penghambat yang

berkomplemen dengan template basa satu kali dan sinyal akan ditangkap oleh

CCD (alat pengisi sambungan) (Liu et al. 2012).

Yield perfect yang diperoleh selama proses sekuensing yaitu sebesar 5.1

Gbp (tabel 8). Menurut Kosasih (2012), nilai yang diperoleh tersebut merupakan

nilai yield pada lajur kontrol (lajur PhiX) sehingga nilainya hanya seperdelapan

dari nilai yield total. Nilai yield perfect menunjukkan jumlah basa yang akurat

melewati passing filter. Passing filter adalah sejenis algoritma yang dipakai oleh

komputer untuk menentukan keakuratan pembacaan basa saat sekuensing. Passing

filter yang digunakan berdasarkan data sekuen PhiX yang berperan sebagai

kontrol pada tahapan sekuensing menggunakan NGS Hiseq 2000.

Genom PhiX digunakan sebagai kontrol dalam proses sekuensing ini yang

memiliki beberapa keunggulan diantaranya mempunyai ukuran genom yang kecil,

mengandung komposisi basa penyusun genom yang beragam (45% GC dan 55%

AT) dan memiliki urutan genom yang telah diketahui secara lengkap (Illumina

2012; Kircher et al. 2011). Referensi ukuran genom dari PhiX sendiri yaitu 5384

bp yang tidak mengandung sekuen adaptor dan dengan kecocokan genom yang

unik (Minoche et al. 2011). Kontrol PhiX yang digunakan pada penelitian ini

sebanyak 1% yang artinya adalah di dalam sampel terdapat PhiX yang digunakan

sebagai kontrol sebanyak 1% saja.

24

Nilai yield <=3 errors, %perfect dan %<=3 errors menunjukkan tingkat

kesalahan selama proses sekuensing. Yield <=3 errors menunjukkan jumah basa

pada lajur kontrol yang memiliki tingkat kesalahan di bawah 3 basa. Nilai yield

<=3 errors dan yield perfect yang dihasilkan juga dapat menunjukkan bahwa

jumlah basa pada lajur kontrol memiliki tingkat kesalahan antara 1-3 basa.

Nilai %perfect yang dihasilkan selama proses sekuensing menunjukkan persentase

tingkat kesamaan antara basa yang dihasilkan dengan sekuen PhiX dalam 99

siklus. Nilai %<=3 errors menunjukkan persentase jumlah basa yang memiliki

tingkat kesalahan kurang dari 3 basa. Nilai yield <=3 errors, %perfect dan %<=3

errors dapat dilihat pada tabel 8 dengan nilai masing-masing 6.1 Gbp, 82 % dari

99 siklus dan 97.55 % untuk 99 siklus.

Densitas dan Kualitas Pustaka Genom Kentang pada Lajur dalam Flow Cell

Hasil konstruksi dari pustaka genom dialirkan pada setiap lajur dari flow cell

untuk menghasilkan klaster pustaka genom. Klaster di dalam flow cell yang telah

klasterisasi ini selanjutkan akan diukur kualitas dan kuantitasnya di dalam

sekuensing. Pengukuran kuantitas klaster dilakukan untuk menghitung densitas

(kerapatan klaster) di dalam suatu lajur pada flow cell. Hasil sekuensing

menunjukkan bahwa densitas klaster pustaka genom yang dihasilkan berkisar 633

K/mm2 -881 K/mm

2 (Tabel 9). Kualitas klaster pustaka genom dapat dilihat dari

gambar yang ditangkap kamera dengan sebaran yang tidak terlalu rapat ataupun

tidak terlalu jarang. Densitas klaster pustaka genom termasuk kategor ideal jika

klaster pustaka genom memiliki densitas berkisar dari 400-600 K/mm2.

Lajur flow cell dari masing-masing pustaka genom kentang yang dihasilkan

memiliki densitas yang tinggi dengan nilai densitas klaster >600 K/mm2. Densitas

klaster yang tinggi dapat disebabkan karena konsentrasi pustaka genom yang

digunakan dalam proses klasterisasi lebih tinggi dari seharusnya (>13 pM). Hal ini

juga mungkin terjadi karena kesalahan dalam pengukuran konsentrasi pustaka

genom sebelum klasterisasi (Quail et al. 2008). Kesalahan pengukuran konsentrasi

mungkin juga disebabkan oleh kesalahan perhitungan atau pengukuran saat

validasi pustaka genom kentang dan juga kesalahan dalam penggunaan mikropipet.

Persentase klaster pustaka genom kentang yang melewati passing filter juga

dihitung. Persentase klaster passing filter (PF) yang dihasilkan selama proses

sekuensing memiliki nilai lebih dari 80% (Tabel 9). Hasil tersebut menunjukkan

bahwa nilai klaster PF termasuk ke dalam kategori ideal. Illumina (2009)

menyatakan bahwa nilai persen klaster PF yang ideal memiliki nilai lebih dari

70%. Rendahnya nilai persen klaster PF dapat disebabkan oleh beberapa hal

diantaranya densitas klaster yang terlalu tinggi, ukuran pustaka genom yang

terlalu panjang dan tingginya persen dephasing (pashing dan prephasing) selama

proses sekuensing (Kosasih 2012).

Illumina (2009) menyatakan bahwa kualitas pustaka genom yang baik

memiliki nilai phasing kurang dari 0.4% dan nilai prephasing kurang dari 0.5%.

Nilai persen phasing dan prephasing merupakan salah satu indikator selama

proses sekuensing. Nilai persen dephasing yang dihasilkan sebesar 0.174 hingga

0.302 untuk phasing dan 0.277 hingga 0.302 untuk prephasing. Hasil tersebut

menunjukkan bahwa pustaka genom yang telah dikonstruksi dan diklasterisasi

memiliki kualitas yang baik.

25

Phasing dan prephasing dipengaruhi oleh efisiensi aliran fluida reagen

sekuensing dan reaksi kimia yang terjadi selama proses sekuensing (Illumina

2009). Phasing dan prephasing menggambarkan hilangnya sinkronisasi dalam

pembacaan basa dari urutan salinan klaster. Hal tersebut mengakibatkan dalam

pembacaan basa hasil sintesis selama proses sekuensing ada yang dibaca terlalu

cepat (prephasing) dan ada yang terlalu lambat (phasing). Kircher et al. (2011)

menyatakan bahwa phasing disebabkan tidak sempurnanya pemutusan ikatan

kimia penanda flourorescen pada proses terminasi gugus 3’OH dalam suatu

klaster. Efek phasing menyebabkan pada siklus selanjutnya tidak ada penempelan

basa pada klaster tersebut sehingga pendaran flourorescen yang terbaca bukan

berasal dari siklus sintesis basa yang baru melainkan berasal dari pendaran

flouroresen hasil sintesis basa sebelumnya. Berbeda dengan phasing, prephasing

disebabkan tidak efektifnya proses pemblokiran saat penempelan basa pada gugus

3’OH yang menyebabkan terjadinya penempelan dua basa sekaligus dalam waktu

yang bersamaan.

Nilai reads menunjukkan hasil pembacaan urutan basa dalam setiap klaster

pustaka genom. Sedangkan, nilai reads PF menunjukkan hasil pembacaan urutan

basa dalam klaster yang melewati passing filter (Kosasih 2012). Jumlah

keseluruhan nilai reads PF yang dihasilkan dari semua klaster pustaka genom dan

kontrol PhiX mempresentasikan nilai yield total. Nilai reads dan reads PF dapat

dilihat pada tabel 9 dimana nilainya sebesar 174.87 hingga 243.68 M untuk reads

dan 165.82 hingga 216.87 untuk nilai reads PF.

Nilai Q scores atau angka kualitas didefinisikan sebagai hubungan

logaritmik antara proses base calling selama sekuensing dengan kemungkinan

tingkat kesalahan yang dihasilkan dalam proses tersebut (Minoche et al. 2011).

Base calling diartikan sebagai proses konversi data hasil pencitraan pendaran

flourorescen selama proses sekuensing menjadi basa-basa yang berurutan. Nilai Q

scores pada penelitian ini diambil nilai Q score 30 yang artinya penghitungan 1

kesalahan pembacaan didalam 1000 basa atau dapat juga dikatakan P=0.001 %

kesalahan (Minoche et al. 2011). Secara keseluruhan nilai Q scores yang

dihasilkan selama proses sekuensing yaitu 88.4 hingga 92.75 % (Tabel 9) dan

gambar 7 merupakan salah satu contoh dari histogram jumlah klaster pada lajur 1

(Genotipe Amudera) berdasarkan kualitas sekuen yang dihasilkan yaitu nilai Q

scores 92.5% dengan jumlah basa yang dibaca sebanyak 31.7 Gb.

Tingkat Kesalahan (Error Rate), Nilai Penyejajaran (Aligned) dan Intensitas

Basa Hasil Sekuensing

Nilai % error rate menunjukkan persentase perbandingan kesalahan

pembacaan basa antara pustaka genom dengan kontrol yang dibaca pada beberapa

siklus sekuensing dan pada penelitian ini hanya ditampilkan pada siklus ke 100.

Secara keseluruhan, nilai error rate yang dihasilkan selama proses sekuensing

pada penelitian ini yaitu sebesar 0.28-1.01%. Sementara itu untuk kesalahan pada

siklus ke 100 yaitu 0.00 % yang menunjukkan bahwa sekuensing yang telah

dilakukan berlangsung dengan sangat baik dengan tidak adanya tingkat kesalahan.

Selama proses sekuensing, basa-basa yang dihasilkan yaitu adenin, timin,

guanin dan sitosin akan dihitung intensitas setiap siklusnya. Intensitas keempat

basa tersebut akan dideteksi melalui hasil pendaran flourescen yang dihasilkan

26

setiap lajur flow cell pada siklus pertama memiliki nilai lebih dari 4000 (Tabel 10).

Intensitas basa selanjutnya dihitung kembali pada siklus ke 20 dan menghasilkan

persen intensitas sekitar 80% dari intensitas basa pada siklus pertama. Persentase

basa hasil sekuensing pustaka genom juga dapat dilihat dalam bentuk grafik

sebaran yang seharusnya saling sejajar dan tidak terlalu berbeda atau tidak ada

jarak yang terlalu lebar diantara garis grafik (Lampiran 3). Secara umum

intensitas keempat basa yang dihasilkan selama proses sekuensing termasuk ke

dalam kategori ideal. Illumina (2009) menyatakan bahwa nilai intensitas ideal

yang dihasilkan selama proses sekuensing yaitu sebesar 1000.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Penelitian ini telah berhasil mengkonstruksi pustaka genom dan telah

memenuhi persyaratan untuk sekuensing genom total menggunakan Next

Generation Sequensing Hiseq 2000 dari empat genotipe kentang yaitu genotipe

CIP 392781, genotipe PT 29, genotipe Amudera dan genotipe Margahayu.

Pustaka genom yang telah berhasil dikonstruksi berukuran 300-600 bp dan

memiliki konsentrasi 13.08 – 60.14 nM. Jumlah basa total yang dihasilkan selama

proses sekuensing yaitu 287.2 Gbp dengan nilai Q scores besar dari 80% dan

tingkat kesalahan selama pembacaan 0.28-1.01 %. Nilai densitas klaster yang

dihasilkan menunjukkan bahwa kualitas klaster pustaka genom ke dalam kategori

ideal.

Saran

Pada penelitian selanjutnya, analisis bioinformatika perlu dilakukan untuk

menyusun basa-basa hasil sekuensing pustaka genom menjadi urutan basa genom

kentang yang utuh dan runut.

DAFTAR PUSTAKA

Agilent Technologies. 2003. Agilent 2100 Bioanalyzer 2100 expert user’s guide.

Deutchland (US): Agilent Technologies Inc.

[BPS] Badan Pusat Statistik. 2014. Luas Panen, Produksi dan Produktivitas

kentang 2009-2013. http//www.bps.go.id [Internet]. [4 Juni 2014] :

Jakarta.

Bintang M. 2010. Teknik Penelitian Biokimia. Jakarta (ID): Erlangga.

Brown TA. 2007. Gene Cloning and DNA Analysis : An Introduction. Sixth

Edition. New York (US): John Wiley and Sons.

27

Covaris. 2012. DNA-RNA shearing for Nex-Gen Sequencing.

http://covarisinc.com/applications/dnarna-shearing-for-NGS [Internet].

[10 Juni 2014].

Doyle JJ and Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure from small

quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19: 11–15.

Fisher R dan Eman N. 2000. Molecular farming of pharmateutical proteins

transgenic. Res 9: 279-299.

Franca LTC, Carrilho E, Kist Tarso BL. 2002. A review of DNA sequencing

techniques. Quaterly Reviews of Biophysics 35(2) : 169-200.

Huson D. 2010. Bioinformatics 1. Wiley-VCH Verlag.

Illumina. 2009. Sequencing Analysis Software : User Guide. San Diego (US) :

Illumina Inc.

Illumina. 2010a. TruSeq DNA-Sample Preparation Low Throughput (LT

Protocol). San Diego (US) : Illumina Inc.

Illumina. 2010b. cBot Quick Reference Guide. San Diego (US) : Illumina Inc.

Illumina. 2011. HiSeq 2000 Quick Reference Guide. San Diego (US) : Illumina

Inc.

Illumina. 2012. Using PhiX Control for HiSeq® Sequencing Runs. San Diego

(US) : Illumina Inc.

Illumina. 2013. Hiseq 2000 System User Guide. Sn Diego (US): Illumina Inc.

Invitrogen. 2010. Qubit 2.0 Fluorometer-Catalog no. Q32866. California (US):

Invitrogen Life Technologies.

Kircher M, Heyn P, Kelso J. 2011. Addressing challanges in the production and

analysis of illumina sequencing data. BMC Genomics 12: 382-396.

Kosasih A. 2012. Konstruksi Dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kedelai

(Glycine Max (L.) Merr.) untuk Sekuensing Genom Total [Skripsi].

Bogor (ID), Institut Pertanian Bogor.

Li ZT, Gray DJ. 2005. Genetic Engineering Technologies. di dalam: Trigiano RN,

Gray DJ, editor. Plant Development and Biotechnology: CRC Press.

Listanto E. 2010. Ekspresi gen RB pada Tanaman Kentang kultivr Granola untuk

Meningkatkan Ketahanan Terhadap Penyakit Hawar Daun (Phytaphthora

infestant (Mont.) de Bary).[Skripsi]. Bogor (ID). Institut Pertanian Bogor.

Liu L, Yinhu L, Siliang L, Ni H, Yimin H, Ray P, Danni L, Lihua L and Maggie

Ll. 2012. Comparison of Next Generation Sequencing Systems. Journal

of Biomedicine and Biotechnology . Vol 2012(1): 1-11.

Lodish et al. 2000. Molecular Cell Biology. Ed ke-4. New York (US): Madison

Avenue.

Mardis ER. 2008. Next generation DNA sequencing methods. The Annual Review

of Genomics and Human Genetics 9 :387- 402.

28

Minoche EA, Juliane CD, and Heinz Hl. 2011. Evaluation of genomic high-

througput sequencing data generated on illumina Hiseq and Genome

Analyzer systems. J Genome Biology 12:R112.

PGSC. 2012. Potato Genome Sequencing Consortium: Final Report for GB.

James Hutton Institute : Agriculture and Horticulture Development

Board

Prahaditya D. 2013. Analisis Keragaman Genetika Tanaman Kunyit dan

Temulawak secara Random Amplied Polymorphic DNA-Polymerase

Chain Reaction (RAPD-PCR) menggunakan Primer OPA-OPD 6-10.

[Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Quail MA, Kozarewa I, Smith F, Scally A, Stephens PJ, Durbin R, Swerdlow H,

Turner DJ. 2008. A large genome center’s improvements to the illumina

sequencing system. Nature Methods 5: 1005-1010.

Samadi B. 2007. Kentang dan analisis usaha tani. Yogyakarta (ID): Kanisius.

Sigma. 2008. qPCR Technical Guide. St. Louis (US): Sigma-aldrich, Inc.

Subtelny et al. 2014. PAL-seq protocol. Bartel Lab. J. Nature.

Suharsono. 2002. Konstruksi Pustaka Genom Kedelai Kultivar Slamet. Hayati 9

(2): 67-70.

Wagih ME and J.G Wiersena. 1994. Plants yielding non-seed carbohydrates. In

Siemons and K.Piluek (eds). Vegetables. Prosea Foundation. Bogor (ID).

Wattimena GA, Purwito A, Matjik NA. 2003. Research progress in potato

propaganon & breeding at Bogor Agricultural University.

http://www.eseap-cipotato.org/MF-ESEAP/puclications/PSP-2003/04-

Wattimena-IPB%20research.pdf [Internet]. [18 Mei 2014].

Wattimena. 1996. Penelitian Tanaman Kentang yang Dinamis dan Adaptiv dari

Laboratorium ke Pengguna. Makalah hasil penelitian bioteknologi PAU

biotek. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Weaver R and Hedrick PW. Genetics (Third Edition). Dubuque: W.C Brown.

Yuwono T. 2010. Biologi Molekular. Jakarta (ID): Erlangga.

29

Isolasi DNA Kentang

Konstruksi genom kentang

(fragmentasi DNA, modifikasi ujung fragmen DNA, adenilasi ujung 3’

DNA, penempelan adaptor, purifikasi DNA hasil ligasi, amplifikasi DNA, validasi

pustaka genom)

Sekuensing DNA

Analisis Sekuensing

LAMPIRAN

Lampiran 1 Strategi penelitian

Klasterisasi DNA

30

Lampiran 2 Hasil pengukuran kuantitas pustaka genom kentang menggunakan qPCR

Genotipe Ct StdDev

Ct Qty

Rerata

Qty

StdDev

Qty

Faktor

pengenceran

Ukuran

fragmen

[Ukuran

kecocokan]

(pM)

[Pustaka

tanpa

pengencara]

(nM)

[total]

(nM)

CIP

392781 9.61 0.123 44.19 43.11 3.389 1000 324 60.14 60.14 60.14

9.55 0.123 45.82 43.11 3.389

60.14 60.14

9.79 0.123 39.31 43.11 3.389

60.14 60.14

PT 29 10.44 0.186 25.61 27.59 3.464 1000 360 34.64 34.64 34.64

10.45 0.186 25.57 27.59 3.464

34.64 34.64

10.12 0.186 31.59 27.59 3.464

34.64 34.64

Amudra 11.21 0.069 23.27 22.36 1.084 1000 568 17.79 17.79 17.76

11.25 0.069 22.66 22.36 1.084

11.35 0.069 21.16 22.36 1.084

12.14 0.118 12.12 11.14 9.34E-001 2000 568 8.86 17.73

12.27 0.118 11.05 11.14 9.34E-001

12.37 0.118 10.26 11.14 9.34E-001

Margahayu 11.8 0.128 15.4 13.95 1.28 1000 471 13.39 13.39 13.08

12.04 0.128 12.98 13.95 1.28

11.99 0.128 13.47 13.95 1.28

12.93 0.048 6.91 6.65 2.26E-001 2000 471 6.38 12.76

13.01 0.048 6.54 6.65 2.26E-001

13.02 0.048 6.5 6.65 2.26E-001

31

Lampiran 3 Grafik intensitas persentase hasil sekuensing pustaka genom

Lampiran 4 Proses klasterisasi di dalam cBOT clustering (Klasterisasi oleh

Isothermal Bridge Amplification) (Illumina 2011).

32

Lampiran 5 Proses sekuensing DNA menggunakan NGS Hiseq 2000 (Huson

2010)

33

RIWAYAT HIDUP

Penulis bernama lengkap Yuliana, dilahirkan di Pulau Kijang Kepri tanggal

27 Mei 1992. Penulis merupakan anak ke-4 dari 7 bersaudara dari ayah Limyardi

dan ibu Isna. Pada tahun 2010 penulis lulus dari SMAN 1 Salimpaung, Tanah

Datar dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur undangan

seleksi masuk IPB (USMI) dengan memperoleh beasiswa pendidikan Bidikmisi

selama 8 semester. Penulis diterima pada mayor Biokimia, Departemen Biokimia,

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dengan mengambil Supporting

Course.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam beberapa kegiatan

kemahasiswaan di IPB dan organisasi mahasiswa daerah, di antaranya sebagai

anggota UKM Panahan IPB, staf Divisi Keilmuan Himpunan Profesi Community

of Research and Education in Biochemistry (Crebs) periode 2012/2013, divisi

Pengabdian Masyarakat (MIPA goes to field 2012). Penulis juga pernah aktif

dalam berbagai kegiatan kepanitiaan diantaranya staf pada seminar kajian ilmiah

dan kehalalan SKIK dan sekretaris II kepanitiaan lomba karya ilmiah popular.

Penulis pernah melakukan praktek lapangan (PL) di pusat penelitian dan

pengembangan kehutanan (Puslitbang) Rehabilitasi Kehutanan Jalan Gunung

Batu No.5 Bogor dengan judul “Isolasi dan Dekolorisasi Jamur Pelapuk Putih

pada Media RBBR” periode bulan juli hingga agustus 2013. Penulis juga pernah

mengikuti kompetisi menulis Essay dengan judul abstrak “The potential

production cellulose nanoparticle of lignocelluloses from cocoa’s pods as

ultralight composite materials biodegradable in Indonesia”.