iii bahan dan metode penelitian 3.1 ... -...

III

BAHAN DAN METODE PENELITIAN

3.1. Bahan dan Peralatan Penelitian

3.1.1. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Daun kemangi (Ocimum sactum L)

Daun kemangi yang digunakan dalam penelitian ini berupa daun segar dengan

ciri-ciri warna daun hijau tua dan lebar daun kurang lebih 3 cm.

2. Fillet broiler 500 g sebagai sampel bahan yang akan diteliti.

Sampel bahan yang akan digunakan yaitu daging fillet broiler yang diambil

dari bagian dada. Fillet broiler didapatkan di pasar tradisional Jatinangor,

Kabupaten Sumedang, Jawa Barat.

3. Aquades digunakan dalam prosedur pewarnaan gram sebagai pembilas larutan

warna.

4. Etanol 96% sebagai pelarut/pengekstrak polar daun kemangi.

5. Lactose Broth sebagai media pembiakan bakteri dari sampel fillet dada ayam.

6. Media Nutrient Agar sebagai media tumbuh bakteri yang akan diamati.

- Alkohol 96%

7. NaCl 0,9% sebagai kontrol negatif untuk memastikan alat dan bahan yang

digunakan dalam membuat konsentrasi dalam kertas cakram tidak

mengandung zat anti bakteri.

8. Spirtus sebagai bahan bakar bunsen.

3.1.2. Peralatan Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Autoclave, digunakan untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan

penelitian yang digunakan dalam penelitian dengan menggunakan uap air

panas bertekanan tinggi pada 121°C atau lebih.

2. Batang pengaduk, terbuat dari gelas tahan panas yang digunakan untuk

mengaduk larutan di dalam alat gelas hingga larutan homogen.

3. Bulb dan pipet ukur 10 ml, digunakan untuk menyedot larutan atau reagen

dalam jumlah tertentu secara akurat.

4. Bunsen, digunakan untuk menciptakan kondisi yang steril saat pewarnaan

bakteri.

5. Cawan petri, digunakan sebagai wadah untuk pembiakan bakteri.

6. Gelas ukur 250 ml, digunakan untuk mengukur volume cairan.

7. Inkubator, digunakan untuk inkubasi bakteri. (Suhu 37˚C)

8. Penggaris, digunakan untuk mengukur diameter zona hambat.

9. Blender digunakan untuk menghaluskan daun kemangi.

10. Evaporator vacuum digunakan untuk mengevaporasi etanol dalam pembuatan

ekstrak daun kemangi.

11. Magnetic stirrer digunakan untuk mengaduk larutan dengan kecepatan yang

konstan dalam pembuatan ekstraksi daun kemangi.

12. Kertas label, digunakan untuk memudahkan penandaan suatu alat dan bahan.

13. Pisau, digunakan untuk memotong sampel.

14. Talenan, digunakan sebgai alas untuk memotong bahan dan sampel.

15. Mortal – mortar, digunakan untuk menghaluskan sampel.

16. Tabung durham, digunakan untuk melubangi media nutrient agar dalam

pembuatan sumur atau cakram.

17. Tabung Erlenmeyer 1000 ml, digunakan sebagai wadah pembuatan media

nutrient agar dan Lactose Broth.

18. Timbangan digital, digunakan untuk menimbang suatu bahan atau sampel.

3.2. Prosedur Penelitian

3.2.1. Persiapan Alat

Peralatan yang digunakan untuk penelitian, seperti batang pengaduk, pipet,

cawan petri, gelas ukur, kertas saring, tabung durham, tabung reaksi, dan Erlenmeyer

flask dicuci, kemudian dikeringkan dan disterilisasi kering dalam oven bersuhu

150˚C selama 60 menit.

3.2.2. Persiapan Media Nutrien Agar

1. Nutrient agar ditimbang sebanyak 39 gram, kemudian disimpan dalam gelas

Erlenmeyer.

2. Aquades ditambahkan ke dalam gelas Erlenmeyer yang telah berisi nutrient

agar hingga 1000 ml.

3. Bahan dipanaskan pada api kecil dan diaduk hingga homogen.

4. Bahan yang sudah homogen dituangkan ke dalam cawan petri steril.

5. Cawan petri yang berisi nutrient agar tersebut disterilisasi dengan metode

sterilisasi basah menggunakan autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit.

3.2.3. Persiapan Larutan Ekstrak Daun Kemangi

1. Mencuci daun kemangi segar hingga bersih dari kotoran yang menempel,

kemudian ditiriskan.

2. Menjemur daun kemangi yang telah dibersihkan di bawah sinar matahari.

3. Menimbang daun kemangi yang telah dikeringkan sebanyak 1000 gram

kemudian dibagi menjadi dua bagian (masing-masing 500 gram).

4. Menghaluskan daun kemangi yang telah ditimbang menggunakan blender.

5. Melakukan maserasi, yaitu merendam serbuk daun kemangi menggunakan

pelarut. Sebagian daun dilarutkan dengan menggunakan aquabides dan

sebagian lagi dilarutkan menggunakan etanol 96% sebanyak 1000 ml,

kemudian masing-masing diaduk menggunakan magnetic stirrer selama 3 jam

dengan kecepatan 400 rpm. Selanjutnya larutan didiamkan selama 3 × 24 jam.

6. Menyaring hasil maserasi daun kemangi menggunakan kertas saring,

kemudian diperas.

7. Memisahkan debris (ampas) daun kemangi dari filtrat.

8. Melakukan maserasi ulang pada debris yang dihasilkan. Cara yang dilakukan

sama seperti perendaman sebelumnya.

9. Memisahkan debris dan filtrat dari hasil maserasi kedua.

10. Mencampurkan filtrat yang dihasilkan dari maserasi pertama dan kedua.

11. Mengevaporasi filtrat daun kemangi yang dimaserasi menggunakan etanol

menggunakan evaporator vacuum pada suhu 40˚C dan tekanan 76 mmHg

selama 3 jam untuk membebaskan etanol dari filtrat, sehingga diperoleh

ekstrak kemangi warna hijau pekat.

3.2.4. Proses Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Daun Kemangi

Proses pembuatan konsentrasi esktrak daun kemangi menggunakan rumus

dasar berdasarkan volume per volume (v/v). perhitungan volume larutan ekstrak daun

kemangi menggunakan rumus sebagai berikut :

𝑉1. 𝐶1 = 𝑉₂. 𝐶₂

Keterangan :

V1 = Volume larutan ekstrak daun kemangi murni (100%)

C1 = Konsentrasi larutan ekstrak daun murni (100%)

V2 = Volume larutan ekstrak daun kemangi yang diinginkan

C2 = Konsetrasi larutan ekstrak daun kemangi yang diinginkan

a. Pembuatan konsetrasi 8% diperoleh dengan cara mengambil 8 ml larutan ekstrak

daun kemangi murni kemudian ditambahkan aquades sebanyak 100 ml. Hasil ini

berdasarkan perhitungan sebagai berikut :

V1.C1 =V2.C2 →V1. 100% = 100ml. 8%

V1 = 800/100 = 8 ml ekstrak daun kemangi

b. Pembuatan konsentrasi 10% diperoleh dengan cara mengambil 10 ml larutan ekstrak

daun kemangi murni kemudian ditambahkan aquades sebanyak 100 ml. hasil ini


V1.C1 =V2.C2 →V1. 100% = 100ml. 10%


c. Pembuatan konsentrasi 12% diperoleh dengan cara mengambil 12 ml larutan ekstrak

daun kemangi murni kemudian ditambahkan aquades sebanyak 100 ml. hasil ini


V1.C1 =V2.C2 →V1. 100% = 100ml. 12%


3.2.5. Persiapan Fillet Broiler

Fillet broiler dipotong dengan berat yang sama, masing–masing seberat 100

gram dan dibuat menjadi 4 potongan, dengan bentuk dadu (potong dadu).

Pemotongan dengan bentuk dadu dilakukan dengan tujuan agar seluruh permukaan

sampel fillet broiler yang akan digunakan memiliki permukaan yang sama rata,

sehingga proses perendaman menjadi efektif.

3.2.6. Perendaman Filler Broiler

a. Fillet broiler diambil sebanyak 100 gram direndam larutan

ekstrak daun kemangi dengan konsentrasi 8%, 10%, dan 12% selama 30

menit menggunakan metode Afrianti, 2013.

b. Filler broiler ditiriskan, kemudian dilakukan pengujian bakteri total dan

pengujian daya hambat bakteri.

3.2.7. Perhitungan Jumlah Bakteri Total pada Fillet Broiler

Pengujian jumlah bakteri total pada daging menggunakan metode Total Plate

Count dengan menghitung jumlah bakteri total (TPC) adalah jumlah mikroba aerob

per millimeter sampel yang ditentukan melalui metode standar. Perlunya dilakukan

pengujian jumlah bakteri total untuk mengetahui jumlah bakteri total pada sampel

fillet broiler sebelum dan sesudah perendaman esktrak daun kemangi. Proses

perhitungan bakteri total menggunakan metode Pour Plate Methode sebagai berikut :

1. Mengerjakan semua proses, peralatan dan bahan secara aseptik.

2. Menimbang sampel fillet broiler sebanyak 10 gram menggunakan timbangan

digital.

3. Mencincang sampel hingga halus.

4. Menambahkan larutan NaCl fisiologi sebanyak 90 ml ke Erlenmeyer flask di

aduk hingga homogen, sehingga didapat pengenceran-1.

5. Memindahkan 1 ml larutan yang berada di tabung Erlenmeyer pengenceran 10-

1 menggunakan pipet ke dalam tabung reaksi pengenceran 10 yang telah diberi

larutan NaCl sebanyak 9 ml, aduk hingga homogen, sehingga didapat

pengenceran pengenceran 10-2. Pengenceran dilakukan hingga pengenceran 10-

6.

6. Mengambil masing – masing 1 ml larutan dari pengenceran-6 menggunakan

pipet ke dalam masing – masing cawan petri steril.

7. Memasukan Nutrient Agar (NA) pada suhu 45˚C sebanyak 15ml.

8. Membungkus cawan petri dengan kertas sampul dan beri label.

9. Memasukan cawan petri dalam keadaan tebalik ke dalam inkubator pada suhu

37˚C selama 1x24 jam.

10. Menghitung jumlah mikroorganisme yang tumbuh pada cawan petridish

berkisar 25-250 koloni, dengan rumus: Jumlah Mikroorganisme

(cfu

gram) = Jumlah Koloni Cawan x (

1

Faktor Pengenceran )

Ilustrasi 2. Diagram Alir Pengujian Bakteri Total

3.2.8. Pengukuran Zona Hambat yang Dihasilkan oleh Bakteri pada Fillet

Broiler

Pengukuran daya hambat bakteri terhadap suatu zat dilakukan dengan

mengukur zona hambat yang dihasilkan oleh bakteri. Pembuatan kultur bakteri dan

perhitungan zona hambat, adalah sebagai berikut:

a. Persiapan Lactose Broth

1. Lactose Broth ditimbang sebanyak 13 gram dan disimpan dalam tabung

Erlenmeyer.

2. Aquades sebanyak 1000 ml dimasukan dalam Erlenmeyer dengan perlahan dan

dihomogenkan di atas nyala api kecil.

3. Setelah homogen, Erlenmeyer ditutup rapat dengan penutup dan disterilisasi

dengan menggunakan autoclave dengan suhu 121˚C 1 atm selama 15 menit.

b. Penanaman Kultur Bakteri

1. Kultur bakteri dari media pertumbuhan bakteri yang berasal dari fillet broiler

diinkubasi, dimasukan ke Lactose Broth dan dibiakkan selama 24 jam pada

suhu 37˚C.

2. Kultur bakteri sebanyak 1 ml dituangkan dalam cawan petri dan sebanyak ±15

ml nutrient agar dengan suhu ± 40˚C ditambahkan ke dalamnya.

3. Setelah nutrient agar membeku, buat sumur atau cakram dengan menggunakan

tabung durham berdiameter 5 mm.

4. Sumur ditetesi larutan daun kemangi sesuai dengan perlakuan P1, P2, P3 dalam

cawan petri yang berbeda sebanyak 1 tetes dan ditutupi dengan kertas saring

steril berbentuk bulat.

5. Semua cawan petri diinkubasi dengan suhu 37˚C selama 24jam.

6. Diameter zona bening yang terlihat di sekitar kertas saring diukur dengan

menggunakan jangka sorong.

3.3. Metode Penelitian

3.3.1. Peubah yang diamati

Adapun peubah yang diamati dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Zona Hambat

Mengidentifikasi daya hambat bakteri terhadap ekstrak daun kemangi melalui

pengukuran zona hambat, yaitu zona bening yang terbentuk di sekeliling koloni

bakteri (mm).

2. Penurunan Jumlah Bakteri Total

Penurunan jumlah bakteri total dihitung melalui perhitungan jumlah bakteri

total pada fillet broiler sebelum direndam ekstraksi daun kemangi dikurangi dengan

jumlah bakteri total pada fillet broiler setelah dilakukan perendaman ekstrak daun

kemangi, kemudian dipersentasekan (%). Berdasarkan SNI 3924: 2009 (BSNI, 2009)

bahwa cemaran mikroba karkas ayam maksimal adalah 1x106 cfu/gram.

3.3.2. Rancangan Percobaan dan Analisis Statistik

Penelitian ini dilakukan dengan metoda eksperimental menggunakan

Rancangan Acak Lengkap/RAL (Completely Randomized Design) yang terdiri atas

tiga perlakuan yaitu P1 = perendaman ekstrak daun kemangi dengan konsentrasi 8%,

P2 = perendaman ekstrak daun kemangi dengan konsentrasi 10%, dan P3 =

perendaman ekstrak daun kemangi dengan konsentrasi 12%,– masing perlakuan

diulang sebanyak enam kali.

Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan Analisis Ragam

(Gasperz,1991) dengan model matematika yang digunakan sebagai berikut :

Yij = 𝜇 + 𝛼i + 𝜀ij

Keterangan :

Yij : Respon atau nilai pengamatan dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j

𝜇 : Nilai tengah umum (rata-rata)

𝛼i : Pengaruh perendaman ke-i (8%, 10% dan 12%)

𝜀ij : Galat percobaan dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j

i : Percobaan ke-i (1,2,3)

j : Ulangan ke-j (1,2,3,4,5,6)

Hipotesis yang akan diuji adalah :

H0: P2 ≤ P1 ; P2 ≤ P3, artinya persentase penurunan jumlah bakteri daya daya

hambat pada P2 (10%) lebih kecil atau sama dengan P1 (8%) dan P3 (12%)

H1: P2 > P1 ; P2 > P3, artinya persentase penurunan jumlah bakteri dan daya

hambat lebih besar diberikan oleh P2 (10%), daripada P1 (8%) dan P3 (12%)

Data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan menggunakan tabel sidik

ragam seperti yang tertera pada Tabel 1.

Tabel 1. Daftar Sidik Ragam

Keterangan :

DB : Derajat bebas

JK : Jumlah kuadrat

KT : Kuadrat tengah

G : Galat

P : Perlakuan (P1, P2, P3)

U : Ulangan (U1, U2, U3, U4, U5,U6)

Sumber Keragaman Db JK KT Fhit F tabel

0,05

Perlakuan (P) (P-1) = 2 JKP KTP 𝐾𝑇𝑃

𝐾𝑇𝐺

Galat (G) P(U-1) = 15 JKG KTG

Total (U.P-1) = 17 JKT -

33

Kaidah keputusan

Jika Fhitung ≤ Ftabel 0,05 artinya tidak berbeda nyata (non significant), terima H0 dan

tolak H1.

Jika Fhitung > Ftabel 0,05 artinya berbeda nyata (significant), tolak H0 dan terima

H1.

Selanjutnya untuk menentukan apakah selisih rata – rata perlakuan berbeda atau

tidak maka digunakan Uji Tukey (Honestly Significant Difference) dengan rumus

sebagai berikut :

HSD = qα (p,fe) Sȳ

Sȳ = √𝐾𝑇𝐺

𝑈

Keterangan :

HSD : Honestly Significant Difference

qα : Nilai Tabel untuk Uji Tukey

p : Jumlah perlakuan

fe : Derajat bebas galat

Sȳ : Galat baku nilai tengah

KTG : Kuadrat Tengah Galat

U : Banyaknya ulangan

d : selisih rata – rata antar perlakuan

Kaidah keputusan :

Jika d ≤ HSD0,05 , maka tidak berbeda nyata

Jika d > HSD0,05 , maka berbeda nyata

Uji Polinomial Ortogonal dilakukan untuk mengetahui gambaran secara

umum kecenderungan terjadinya peningkatan ataupun penurunan respon akibat

34

perlakuan yang diberikan, hubungan fungsional antara peragam (Variabel) bebas y

dan peragam tak bebas x secara polinomial (Hanafiah, 2010), Dinyatakan dengan

rumus :

Y = α + β1x + β2x2 + … + βnx

n

Keterangan :

α : intersepsi

β1 : (i = 1,2,…,n) = koefisien regresi parsial yang berasosiasi dengan derajat

polInomial ke – I sampai ke – n

y : respon

x : perlakuan

Koefisien pembanding (Guilford dan Frunchter, 1978) disusun untuk

mengetahui apakah setiap perlakuan saling orthogonal atau tidak. Perhitungan dengan

daftar sidik ragam dilakukan untuk melihat pola kecenderungan, apakah meningkat

atau menurun serta untuk menentukan persamaan garis berbeda nyata.

35

Tabel 2. Daftar Sidik Ragam Polinomial Ortogonal

Sumber : Gaspersz (1991)

Apabila hasil analisis menunjukan signifikan selanjutnya akan dicari model

persamaan regresi yang terbaik, untuk kemudian dapat dibuat dalam bentuk kurva.

Sumber

Keragaman

DB JK KT Fhit F tabel

0,05

Perlakuan (P) (P-1) = 2 JKP KTP KTP/KTG

- Linier

- Kuadratik

- Kubik

1

1

1

JKLinier

JKKuadratik

JKKubik

KTLinier

KTKuadratik

KTKubik

KTlinier/KTG

KTkuadratik/KTG

KTkubik/KTG

Galat (U.P1)=15 JKG KTG

Total PU-1=17 JKT

36

Tata letak percobaan dilakukan seperti ilustrasi sebagai berikut :

1

P2

2

P1

3

P3

4

P3

5

P2

6

P2

7

P1

8

P3

9

P2

10

P1

11

P3

12

P1

13

P2

14

P1

15

P2

16

P3

17

P1

18

P3

Ilustrasi 3. Tata Letak Percobaan

Keterangan :

P1 : Perendaman dalam ekstrak daun kemangi konsentrasi 8%



iii bahan dan metode penelitian 3.1 ... -...

Documents