III

BAHAN DAN METODE PENELITIAN

3.1 Bahan Penelitian

3.1.1 Objek Penelitian

Objek dari penelitian ini adalah semen yang berasal dari kambing Peranakan

Etawah (PE) yang berumur 3 tahun. Kambing Peranakan Etawah (PE) tersebut

dikandangkan secara individu di Kandang Kambing Perah Fakultas Peternakan

Universitas Padjadjaran Desa Ciparanje, Kecamatan Jatinangor, Kabupaten

Sumedang yang setiap harinya diberi makan berupa rumput, konsentrat dan

leguminosa. Semen diambil pada hari Senin dan Rabu pukul 09.00 WIB.

3.1.2 Bahan dan Peralatan Penelitian

Beberapa bahan dan peralatan penelitian yang diurutkan sesuai proses

penelitian berlangsung.

a. Penampungan Semen

Bahan dan peralatan yang digunakan pada proses penampungan semen

adalah vagina buatan atau artificial vagina, vaselin, air hangat, tabung

penampungan semen, pompa udara, dan kertas tabel.

b. Evaluasi Semen Segar

Bahan dan peralatan yang digunakan pada proses evalusi semen segar

adalah semen segar kambing Peranakan Etawah (PE), NaCl fisiologis, pewarna

eosin, tabung penampungan semen, pH indikator, object glass, cover glass, batang

pengaduk, pipet haemocytometer, kamar Neubaeur, mikroskop, pembakar busen,

korek api, counter, dan tisu.

c. Separasi dan Pencucian Spermatozoa

Bahan dan peralatan yang digunakan pada proses separasi dan pencucian

spermatozoa adalah semen kambing Peranakan Etawah yang sudah dievaluasi,

Bovine Serum Albumin (BSA) merek Sigma, Brackett-Oliphant (BO), water bath,

aquabidetilata, tabung reaksi, tabung sentrifugasi, alat sentrifugasi, rak tabung,

mikro pipet, kertas tabel, dan tisu.

d. Pengenceran Semen

Bahan dan peralatan yang digunakan pada proses pengenceran semen

adalah semen segar kambing Peranakan Etawah (PE) hasil sexing, tris kuning telur,

Penicillin, Streptomycin, gliserol, aquabidetilata, tabung reaksi, rak tabung, mikro

pipet, kertas tabel, dan tisu.

e. Pengemasan Semen Cair

Bahan dan peralatan yang digunakan pada proses pengemasan semen cair

adalah semen kambing Peranakan Etawah (PE) hasil sexing, mini straw volume

0,25 ml, dan alat pengemasan semen.

f. Pembekuan Semen

Bahan dan peralatan yang digunakan pada proses pembekuan semen adalah

mini straw volume 0,25 ml yang berisi semen cair kambing Peranakan Etawah (PE)

hasil sexing, N2 cair, styrofoam, rak besi, penjepit besi, container, canister, goblet,

dan thermometer.

g. Thawing Straw

Bahan dan perlatan yang digunakan pada saat proses thawing straw adalah

mini straw volume 0,25 ml yang berisi semen beku kambing Peranakan Etawah

(PE) hasil sexing, bejana berisi air hangat bersuhu 38˚C, gunting, dan tisu.

h. Pengamatan Kualitas Semen Post Thawing

• Motilitas Spermatozoa Post Thawing

Pengamatan ini membutuhkan beberapa bahan dan peralatan antara lain

semen kambing Peranakan Etawah (PE) hasil sexing post thawing, object glass,

cover glass, pipet haemocytometer, kamar Neubaeur, mikroskop, counter dan tisu.

• Keutuhan Membran Plasma Spermatozoa Post Thawing

Pengamatan ini membutuhkan beberapa bahan dan peralatan antara lain

semen kambing Peranakan Etawah (PE) hasil sexing post thawing, larutan

Hypoosmotic Swelling Test (HOST Test) yaitu fruktosa, natrium sitrat, dan

aquabidestila, object glass, cover glass, mikroskop, counter dan tisu.

• Abnormalitas Spermatozoa Post Thawing

Pengamatan ini membutuhkan beberapa bahan dan peralatan antara lain

semen kambing Peranakan Etawah (PE) hasil sexing post thawing, pembakar busen,

pewarna eosin, aquabidestila, object glass, cover glass, mikroskop, counter dan

tisu.

3.2 Metode Penelitian

3.2.1 Prosedur Penelitian

Berikut adalah prosedur yang akan dilakukan dalam penelitian ini,

a. Pembuatan Media Brackett-Oliphant (BO)

Pembuatan Media Brackett-Oliphant (BO) berguna untuk media separasi

spermatozoa dan diracik sehari sebelum pelaksanaan separasi spermatozoa karena

larutan ini harus digunakan dalam keadaan segar. Media Brackett-Oliphant (BO)

ini digunakan dengan melarutkan dua larutan, yaitu larutan stok A dan stok B.

Larutan stok A terdiri dari NaCl 0,1 M, KCl, NaH2PO4.H2O, CaCl2.2H2O, dan

MgCl2.6H2O yang dilarutkan di dalam aquabidestilata dan stok B yang terdiri dari

NaHCO3 juga dilarutkan di dalam aquabidestilata.

Volume Brackett-Oliphant yang digunakan untuk separasi dalam satu kali

ulangan adalah 100 ml, yang terdiri dari 76 ml stok A dan 24 ml stok B. Volume

Brackett-Oliphant yang digunakan untuk mengencerkan semen tergantung pada

volume semen, motilitas, konsentrasi, volume yang diinginkan dan konsentrasi

spermatozoa yang diinginkan.

b. Penampungan Semen

Penampungan semen dilakukan di Kandang Kambing Perah Fakultas

Peternakan Universitas Padjadjaran selama dua kali dalam seminggu pada hari

Senin dan Rabu pukul 09.00 WIB. Semen yang akan ditampung berasal dari satu

ekor kambing jantan Peranakan Etawah (PE). Sebelum proses penampungan semen

dilakukan, persiapkan satu set vagina buatan atau artificial vagina. Satu set vagina

buatan atau artificial vagina ini sebelumnya harus dicuci menggunakan air panas

agar steril. Setelah itu satu set vagina buatan siap digunakan masukan air panas

dengan suhu 38-40˚ ke dalam AV, kemudian dikocok lalu tiup lubang vagina buatan

untuk menyesuaikan dengan penis kambing jantan Peranakan Etawah (PE), dan lalu

mengoleskan vaselin ke area ujung depan selongsong karet.

Pemancing atau teaser yang digunakan adalah seekor kambing betina

Peranakan Etawah (PE) yang diikat di kandang jepit. Penampungan dilakukan

dengan melihat seekor jantan yang sudah melakukan false mount selama 2-3 kali.

Tangan kanan memegang vagina buatan sedangkan tangan kiri memegang pangkal

penis untuk diarahkan ke vagina buatan. Semen diejakulasikan ke dalam vagina

buatan dan biarkan kambing jantan memberikan dorongan ke vagina buatan agar

semen yang keluar lebih banyak. Setelah semen tertampung, lepaskan tabung

penambung semen dari set vagina buatan dan semen siap dibawa ke laboratorium

untuk dilakukan evaluasi.

c. Evaluasi Semen Segar

Evaluasi semen segar dibagi menjadi dua bagian yaitu evaluasi

makroskopis dan mikroskopis.

• Evaluasi Makroskopis

o Volume

Volume semen kambing yang diperoleh dari proses penampungan dapat

diketahui dengan cara membaca skala yang terdapat pada tabung penampungan.

Volume semen kambing bervariasi yaitu 0,5-1,5 ml.

o Warna

Warna semen dapat diketahui langsung dengan cara melihat semen yang

terdapat pada tabung penampungan. Warna putih krem adalah warna normal semen

kambing. Jika warna selain warna putih krem seperti merah atau hijau kekuning-

kuningan, kemungkinan semen mengandung bakteri ataupun darah dan semen akan

diafkir.

o Bau

Bau semen dapat diketahui langsung dengan cara mencium bau semen yang

terdapat di tabung penampungan. Bau semen kambing normal memiliki bau khas

semen. Jika tercium bau tidak wajar atau busuk kemungkinan banyak spermatozoa

yang telah mati dan semen akan diafkir.

o Konsistensi

Konsistensi atau kekentalan atau viskositas semen akan berkaitan dengan

kepadaran atau konsentrasi spermatozoa. Konsistensi dapat dilihat dengan cara

menggoyangkan tabung penampung berisi semen secara perlahan. Semen dengan

konsistensi kental akan terlihat pada proses kembalinya larutan semen ke posisi

tegak akan lebih lama dibandungkan dengan semen yang konsistensinya encer.

Konsistensi semen kambing yang baik adalah konsistensi yang kental.

o pH

Pemerikasaan derajat keasaman atau pH dilakukan dengan cara

menempelkan pH indikator ke semen. pH semen kambing yang normal berkisar

antara 6,8-7,0.

• Evaluasi Mikroskopis

o Gerakan Massa

Gerakan masa diamati dengan cara meletakkan satu tetes semen ke object

glass tanpa menggunakan cover glass kemudian diamati dibawah mikroskop

dengan perbesaran 10x10. Gerakan massa spermatozoa digolongkan sebagai

berikut:

• Sangat baik (+++ atau 3+), jika gerakan bergelombang cepat dan padat,

membentuk pusaran-pusaran gelombang.

• Baik (++ atau 2+), jika gerakan aktif kedepan.

• Lumayan atau sedang (+ atau 1+), jika gerakan sangat lemah atau gerakan

berayun.

• Buruk (nekrospemia atau nilai 0), jika sperma tidak bergerak.

Standar gerakan massa untuk dapat diproses lebih lanjut adalah (++ atau 2+ dan

+++ atau 3+).

o Konsentrasi Spermatozoa Total

Metode ini dilakukan dengan menggunakan pipet haemocytometer dan

kamar hitung neubauer. Cara perhitungannya adalah sebagai berikut:

• Semen dihisap dengan pipet hemocytometer sampai tanda 0,5.

• Hisap larutan NaCl 3% 0,1 M sampai tanda 101.

• Kocok larutan dengan gerakan membentuk angka 8 selama 2–3 menit.

• Beberapa tetesan pertama dibuang dan dikocok lagi.

• Kamar hitung neubauer ditutup dengan cover glass.

• Satu tetes semen diteteskan pada sisi cover glass.

• Jumlah sel spermatozoa dihitung dalam 5 kamar menurut arah diagonal.

Setiap kamar mempunyai 16 ruangan kecil, maka di dalam 5 kamar terdapat

80 ruangan kecil. Seluruh gelas hemocytometer memiliki 400 ruangan kecil.

Dengan volume setiap ruangan kecil adalah 0,1 mm3 dan pengenceran 200

kali, maka dapat dihitung konsentrasi sperma dengan perhitungan sebagai

berikut:

Konsentrasi Total = Jumlah spermatozoa × 107 sperma per ml

o Motilitas Spermatozoa

Motilitas spermatozoa adalah kemampuan spermatozoa untuk melakukan

gerak maju atau progresif. Motilitas spermatozoa dapat dihitung dengan

menggunakan pipet haemocytometer dan kamar hitung neubauer. Semen diambil

dengan menggunakan haemocytometer samapai pada angka 0,5 kemudian

diencerkan dengan NaCl fisiologis. Setelah itu dari haemocytometer tersebut

dikeluarkan sebanyak 1 tetes. Sehingga pengenceran yang dilakukan pada semen

adalah 200 kali. Kemudian teteskan semen pada kamar hitung neubauer dan diamati

jumlah sperma motil sebanyak 5 lapang pandang. Persentase motilitas spermatozoa

yaitu:

%M =KT − KM

KT× 100%

Keterangan:

M : Motilitas

KT : Konsentrasi Total

KM : Konsentrasi Sperma Mati/ Non Motil

Ilustrasi 1. Pengamatan Motilitas Spermatozoa di Kamar Neubauer

Sumber: Rizal, dkk (2006)

o Abnormalitas Spermatozoa

Abnormalitas spermatozoa adalah keadaan dimana spermatozoa tidak

dalam bentuk yang normal. Abnormalitas meliputi abnormalitas primer dan

sekunder. Abnormalitas primer terjadi bukan karena kecelakaan proses produksi

tetapi bersifat genetik yaitu kepala kembar, kepala pipih, kepala besar atau kecil,

ekor dua, ekor kecil atau besar dan lain-lain sedangkan abnormalitas sekunder

terjadi karena kecelakaan proses produksi antara lain badan atau leher patah, ekor

melingkar atau keriting, kepala terpisah dari ekor dan lain-lain. Abnormalitas

spermatozoa dihitung dengan membuat preparat ulas eosin. Jumlah spermatozoa

yang abnormal dihitung bersama dengan spermatozoa yang normal kurang lebih

sebanyak 200 sel spermatozoa. Persentase sel spermatozoa yang abnormal adalah:

Ab =A

A + B× 100%

Keterangan:

Ab : Persentase Spermatozoa Abnormal

A : Jumlah spermatozoa yang Abormal

B : Jumlah Spermatozoa yang Normal

Ilustrasi 2. Pengamatan Abnormalitas Spermatozoa

Sumber: Lodhi, dkk, 2008

Keterangan:

1 = spermatozoa double-tail

2 = spermatozoa twin-head

d. Separasi dan Pencucian Spermatozoa

Separasi dilakukan dengan cara memasukan larutan BSA 10% dan 5%

masing-masing 2 ml kedalam tabung, kemudian masukan 1 ml semen yang telah

diencerkan dengan BO dengan perbandingan semen dan BO yaitu 1:7 pada tabung

yang sama. Inkubasi tabung yang telah berisi larutan BSA dan semen dalam water

bath pada suhu 35oC selama 45, 60 dan 75 menit, setelah diinkubasi 1 ml larutan

bagian atas dibuang karena dianggap sebagai spermatozoa mati dan 4 ml larutan

berikutnya dipisahkan berdasarkan batas antara konsentrasi larutan 5% dan 10%,

lapisan bagian atas diberi label X dan lapisan bawah diberi label Y. Tambahkan

larutan BO sebanyak 5 ml pada masing-masing tabung dan sentrifugasi dengan

kecepatan 1800 rpm selama 10 menit, setelah disentrifugasi cairan supernatan

dibuang sedangkan bagian bawah yang berbentuk pellet merupakan spermatozoa

hasil separasi.

e. Pengenceran Semen

Tabung reaksi yang berisi semen hasil sexing atau pellet ditambahkan

dengan larutan pengencer BO dengan cara menuangkankan larutan BO melalui

dinding tabung reaksi secara perlahan. Pellet tersebut kemudian diencerkan dengan

tris kuning telur yang telah mengandung antibiotik penicillin dengan dosis 1000

IU/ml pengencer dan streptomycin sebanyak 1 mg/ml pengencer. Proses

selanjutnya adalah menambahkan gliserol sebanyak 6% dari total pengencer pada

tabung koleksi yang berisi campuran semen dan pengencer. Kocok secara perlahan

agar tidak terjadi gelembung menggunakan mikropipet.

f. Pengemasan Semen Cair

Semen cair hasil sexing kemudian akan dikemas ke mini straw bervolume

0,25 ml. Pemasukan semen cair ke dalam mini straw menggunakan alat

pengemasan berupa pompa penghisap dan selang plastik penghisap. Bagian mini

straw yang memiliki sumbat disambungkan dengan selang plastik penghisap

sedangkan ujung selang plastic lainnya disambungkan ke pompa penghisap.

Tuangkan semen cair hasil sexing ke dalam cawan untuk pengisian mini straw,

kemudian hidupkan pompa penghisap agar semen masuk ke dalam mini straw.

Selanjutnya ujung mini straw ditutup dengan tepung polyvinyl alcohol.

g. Equilibrasi

Straw yang telah berisi semen cair kemudian disimpan ke dalam lemari es

dengan temperatur 5°C selama 2-4 jam, proses ini dinamakan proses equilibrasi.

Proses ini bertujuan agar spermatozoa menyesuaikan diri dengan pengencer dan

persiapan sebelum proses pembekuan.

h. Pembekuan Semen

Beberapa tahapan proses pembekuan dimulai dari proses pre-freezing yaitu

dengan cara menguapi mini straw yang telah berisi semen cair hasil sexing dengan

uap N2 cair di dalam styrofoam berusuhu -80˚ sampai dengan -100˚C selama 7-8

menit dengan jarak mini straw dengan permukaan cairan sekitar 3-5 cm. Tahapan

berikutnya adalah proses freezing dengan cara memindahkan mini straw ke dalam

container yang berisi N2 cair hingga suhu -196˚C. Pengangkatan mini straw

menggunakan pinset, kemudian dimasukan ke goblet yang nantinya ditempatkan

ke dalam canister yang akan dimasukan ke dalam container.

i. Thawing Semen

Thawing semen dilakukan untuk mencairkan kembali semen beku

dilakukan dengan cara memasukan mini staw yang membeku tadi ke dalam bejana

berisi air dengan suhu 38˚C selama 30 detik.

j. Pengamatan Kualitas Semen Post Thawing

Kualitas semen yang diamati saat post thawing adalah membran plasma

utuh, motilitas dan abnormalitas.

• Motilitas Spermatozoa

Prosedur yang digunakan untuk mengamati motilitas sperma hampir sama

dengan yang digunakan saat evaluasi mikroskopis semen segar hanya berbeda pada

sampel. Sampel yang diamati adalah semen diambil dari mini straw setelah

dilakukannya proses post thawing. Pengambilan semen ini dilakukan dengan cara

memotong mini straw di bagian tengah.

• Keutuhan Membran Plasma

Prosedur yang digunakan untuk mengamati keutuhan membran plasma

adalah sebagai berikut.

1. Membuat larutan hypoosmotik swelling test (HOST-Test) yaitu larutan

0,179 gr NaCl 0,1 M dalam 100 ml aquabidestilata.

2. Menggunting bagian tengah mini straw untuk mengambil sampel semen,

lalu masukan ke larutan hypoosmotik swelling test (HOST-Test). Inkubasi

selama 1 jam.

3. Membuat preparat ulas dari larutan tersebut.

4. Mengamati preparat ulas dengan pembesaran 40 kali, dengan menghitung

200 sel spermatozoa. Spermatozoa yang membran plasmanya masih utuh

ditandai dengan ekor yang membengkak, melingkar, dan menggembung

akibat terpapar larutan hypoosmotik swelling test (HOST-Test) sedangkan

yang rusak, ekornya lurus (Saili, 1999).

Ilustrasi 3. Pengamatan Keutuhan Membran Plasma Spermatozoa

Sumber: Ariswan, 2014

Keterangan:

a = spermatozoa bermembran plasma utuh (swelling)

b = spermatozoa bermembran plasma tidak utuh (non-swelling)

• Abnormalitas Spermatozoa

Prosedur yang digunakan untuk mengamati abnormalitas sperma hampir

sama dengan yang digunakan saat evaluasi mikroskopis semen segar hanya berbeda

pada sampel. Sampel yang diamati adalah semen diambil dari mini straw setelah

dilakukannya proses post thawing. Pengambilan semen ini dilakukan dengan cara

memotong mini straw di bagian tengah.

3.2.2 Perlakuan Percobaan

Perlakuan yang dicobakan adalah sebagai berikut:

P1 = 45 menit waktu inkubasi

P2 = 60 menit waktu inkubasi

P3 = 75 menit waktu inkubasi

Setiap perlakuan diulang sebanyak 6 kali.

3.2.3 Peubah yang Diamati

• Motilitas Spermatozoa (%)

Pengamatan motilitas dilakukan setelah proses post thawing, persentase

motilitas spermatozoa dihitung dengan rumus sebagai berikut:

% Motilitas spermatozoa =konsentrasi total – sperma yang mati

konsentrasi total sperma×100%

• Keutuhan Membran Plasma (%)

Evaluasi untuk melihat keutuhan membran plasma dilakukan dengan

menggunakan mikroskop dengan pembesaran 40 kali, dengan menghitung 200 sel

spermatozoa. Keutuhan membran plasma diamati dengan cara memasukan sampel

semen kedalam larutan hypoosmotik swelling test (HOST-Test) yaitu larutan 0,179

gr NaCl dalam 100 ml aquabidestilata. Presentase keutuhan membran plasma

dihitung menggunakan rumus:

MPU =P

P + Q× 100%

Keterangan:

MPU : Membran Plasma Utuh

P : Jumlah spermatozoa ekor melingkar

Q : Jumlah spermatozoa ekor lurus

• Abnormalitas Spermatozoa (%)

Pengamatan abnormalitas dilakukan setelah proses post thawing,

presentasi abnormalitas spermatozoa dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Ab =A

A + B× 100%

Keterangan:

Ab : Persentase Spermatozoa Abnormal

A : Jumlah spermatozoa yang Abormal

B : Jumlah Spermatozoa yang Normal

2.2.4 Rancangan Percobaan dan Analisis Data

Metode yang digunakan adalah metode eksperimental. Rancangan

percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga

perlakuan dan enam kali ulangan. Model matematika Rancangan Acak Lengkap

(RAL) yang digunakan adalah:

Yij = µ + αi + εij

Keterangan:

Yij = respon hasil pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j

µ = rata-rata perlakuan

αi = pengaruh perlakuan ke-i

εij = pengaruh galat yang timbul dari perlakuan ke-i pada ulangan ke-j

Selanjutnya untuk mengetahui pengaruh perlakuan dilakukan analisis sidik

ragam dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Sidik Ragam

Sumber keragaman db JK KT Fhitung Ftabel

Perlakuan t-1 = 2 JKP KTP KTP

KTG

Galat t(r-1) = 15 JKG KTG

Total tr – 1 = 17 JKT

Keterangan: db = Derajat Bebas JK = Jumlah Kuadrat KT = Kuadrat Tengah t = Total Perlakuan r = Banyaknya Ulangan

Hipotesis:

H0 : P1 = P2 = P3

H1 : P1 ≠ P2 ≠ P3 atau minimal ada sepasang perlakuan yang tidak sama.

Kaidah keputusan:

1. Bila Fhitung < Ftabel, maka terima H0 artinya tidak ada perbedaan yang nyata

(non significant).

2. Bila Fhitung ≥ Ftabel, maka tolak H0 dan terima H1 artinya ada perbedaan

yang nyata (significant).

Jika didapatkan kesimpulan dari analisis ragam yaitu menolak H0 atau

terdapat perbedaan pengaruh perlakuan yang nyata terhadap hasil pengamatan yang

dilakukan maka perlu dilakukan uji lanjutan menggunakan metode Ortogonal

Polinomial. Menurut Hanifiah (1991), metode ini digunakan untuk menguji

kecenderungan hubungan fungsional antara perlakuan – perlakuan dan

pengaruhnya terhadap objek penelitian pada percobaan – percobaan faktor tunggal

(disebut juga trend comparison). Hubungan fungsional antara variabel bebas y dan

peragam tak bebas x secara polinomial dinyatakan sebagai berikut:

Ƴ = ∝+ 𝛽1𝑥+ 𝛽2𝑥2+ ... + 𝛽𝑛𝑥n

Keterangan:

α = Intersepsi

βi = (i =1 ,2,…, n) = koefisien regresi parsial yang berasosiasi dengan derajat

polynomial ke- i

Y = Respon

X = Perlakuan

Gomez dan Gomez (1995) telah menguraikan perhitungan untuk

mendapatkan koefisien ortogonal polinomial untuk derajat polinomial pertama

(linier), derajat polinomial kedua (kuadratik), dan derajat polinomial ketiga (kubik),

sebagai berikut:

L = a+ Xi

Qi b cXi + Xi2

Ci = d+ eXi + fXi2 + Xi3

Tabel 3. Analisis Ragam Sesuai Dengan Pembandingan Ortoghonal Polynomial

Sumber

Keragaman

Derajat

Bebas (db)

Jumlah

Kuadrat (JK)

Kuadrat

Tengah (KT)

Statistik Uji F

Perlakuan

Linier

Kuadratik

Kubik

Kuartik

t – 1

1

1

1

1

JKP

JKP1

JKP2

JKP3

JKP4

KTP

KTP1

KTP2

KTP3

KTP4

F

F1

F2

F3

F4

Galat

Percobaan

Sisa JKG KTG

Total n-1 JKT

Pengambilan keputusan dapat dilihat dari hasil pembandingan nilai statistik

uji F yang telah dihitung dengan nilai kritis. Penentuan derajat polinomial

didasarkan pada kontras-kontras ortogonal yang nyata, sehingga akan didapatkan

hubungan fungsi respon antar perlakuan sesuai dengan derajat polinomial yang

signifikan (Widhiarih, 2001).

3.2.5 Tataletak Percobaan

Ilustrasi 4. Pengacakan Perlakuan

Tabel 4. Data Pengamatan

Penampungan Perlakuan

P1 P2 P3

1 P1U1 P2U1 P3U1

2 P1U2 P2U2 P3U2

3 P1U3 P2U3 P3U3

4 P1U4 P2U4 P3U4

5 P1U5 P2U5 P3U5

6 P1U6 P2U6 P3U6

Keterangan:

P : Perlakuan ke (1,2,3)

U : Ulangan ke (1,2,...,6)

P3U1 P2U1 P1U1

P1U3 P1U2 P3U2

P2U2 P2U3 P1U4

P2U5 P1U5 P2U4

P3U3 P1U6 P3U4

P3U5 P2U6 P3U6

1 2 3

4 5 6

7 8 9

10 11 12

13 14 15

16 17 18