3. Hasil dan Diskusi

3.1. Pembuatan anti SEA mAb

tujuh hari setelah fusi sel, anti-SEA monoklonal antibodi pada cairan supernatan dari kultur dideteksi menggunakan ELISA indirect, sel enterotoksin staphylococcus aureus dengan afinitas tinggi dipilih dan disubklon sebanyak 3x dengan dilusi. Setelah dipilih, 10 sel hybridoma ditandai mAb 1 sampai mAb10. Sel kemudian diinjeksikan pada mencit secara intraperitonial dan cairan ascitic yang terbentuk diambil untuk dibuat monoklonal antibodi (mAb).

3.2 Analisis Interaksi pasangan mAb dengan SEA

Table 1. Analisis Interaksi pasangan dengan Sandwich ELISA (P/N value).

Rasio OD450 kontrol positif dengan kontrol negatif dapat dilihat pada tabel 1. Hasil menunjukkan adanya pasangan yang diperoleh, monoklonal (mAb)yang dikenali oleh epitop dipilih. Kombinasi optimal tidak jelas karena nilai OD450 dari kontrol positif adalah >2,2. Sehingga 100ng/ml SEA terlalu tinggi untuk diuji Elisa Sandwich dan pasangan dengan rasio tertinggi mungkin tidak menjamin sensititas terbaik.

Penelitian lanjutan menunjukkan nilai LOD terendah diperoleh ketika mAb4 dipilih sebagai antibodi penangkap (capture antibodi) dan mAb10-HRP digunakan sebagai antibodi deteksi (Gambar 1.)

Gambar 1. Kurva komparasi PBS 0,01 M dengan pasangan berbeda

3.3 . Pengembangan mAb Berbasis Sandwich ELISA untuk Deteksi SEASandwich ELISA untuk deteksi SEA ini dibuat menggunakan anti-SEA mAb4 ( antibodi capture) dan anti-SEA mAb10-HRP(antibodi deteksi). Setelah optimasi, konsentrasi optimal antibodi capture dan faktor pengenceran antibodi deteksi yang diperoleh berturut-turut 6μg/mL dan 1400 μg/mL. SEA rekombinan digunakan sebagai standar , yang dibuat dalam dalam larutan PBS 0,01 M yang mengandung 0,2 % albumin bovine serum ( BSA ) dan 0,5 % Tween 20 Konsentrasi BSA dan Tween 20 telah dioptimasi agar dihasilkan larutan standar buffer yang sama dengan susu. Kurva standar SEA pada susu murni dapat dilihat pada gambar 2.

Gambar 2. Kurva Standard SEA pada susu murni

Gambar 3 menunjukkan kurva kalibrasi determinasi SEA dengan metode ELISA sandwich LOD dihitung tiga kali sebagai standar deviasi dari blank value dibagi dengan kemiringan kurva

standar. Metode LOD diperoleh 0,0282 ng / mL , dengan rentang linier dinamis ditemukan menjadi 0,06-2 ng / mL .

. Gambar 3. Kurva kalibrasi determinasi SEA

Nilai ini mengindikasikan metode ini cukup sensitif untuk mendeteksi konsentrasi SEA rendah dari 0,5 ng / mL, yang masih menunjukkan level beracun pada susu. ini juga menarik bahwa LOD dari kurva standar SEA di PBS 0,01 M yang mengandung 0,2% BSA dan 0,5% Tween 20 lebih rendah daripada counterpart BSA dan Twwen yg lain di PBS 0,01 M. Sinyal SEA di 0,01 M PBS menurun dengan cepat dan sangat tidak stabil. Rentang noise (ganggguan ) adalah 2,4 untuk 0,5 ng / mL SEA di 0,01 M PBS, sedangkan itu sekitar 4,6 untuk jumlah yang sama di 0,01 M PBS yang mengandung 0,2% BSA dan 0,5% Tween 20. Selain itu, sinyal dari standar adalah ditingkatkan ketika konsentrasi BSA meningkat dari 0% sampai 2%, namun sinyal latar belakang juga meningkat. Meskipu n sinyal latar belakang menurun ke tingkat yang dapat diterima saat ditambahkan Tween 20. Signal oleh BSA tidak jelas, sinyal latar belakang mungkin menurun karena Tween 20 bisa mengurangi adsorpsi nonspesifik yang dihasilkan dari peningkatan konsentrasi BSA

3.4. Uji Spesifiksitas (Uji Khas)

Spesifiksitas/ ke khas-an ELISA untuk SEA harus dievalusia karena adanya variasi SEs (Staphylococcal enterotoksin) yang memiliki tingkat tertentu pada homologi. Pada penelitian sebelumnya, cairan SEB, SEC, SED dan SEE dibuat dengan pengenceran Ses pada 10 ug / mL, 100 ng / mL, dan 1 ng / mL cairan penyangga, dan kemudian dianalisis dengan ELISA.reaktivitas silang 0,01 % diamati dengan SEE ketika 10 ug / ml masing-masing reaktan telah diuji ( Gambar 4 ) . Namun, tidak ada reaktivitas silang diamati dengan SEB , SEC , SED ketika konsentrasi standar di bawah 100 ng / mL . Temuan ini masuk akal karena SEA dan SEE

memberikan 70-90 % urutan homologi [ 14 ] . Oleh karena itu hasil tersebut menunjukkan bahwa metode ini sangat spesifik untuk SEA. Namun, ketika menggunkanan kit komersial yang memanfaatkab mAbs untuk mengidentifikasii SES ( seperti kit RIDASCREEN diproduksi oleh R Biopharm GmbH , Darmstadt , Jerman ), reaktivitas silang antara SEA dan SEE ditemukan sekitar 10-20 % . Perbedaan dalam mendeteksi reaktivitas silang mungkin terkait dengan spesifisitas antibodi yang digunakan dalam tes

Gambar 4. Reaktiftas silang dari ELISA terhadap berbagi tipe SEs

3.5. Uji Recovery dan Validasi Pengujian recovery intra ditentukan dengan menganalisis setiap konsentrasi enam kali per dijalankan pada satu waktu , sedangkan Pengujian recovery inter ditentukan dengan menganalisis setiap konsentrasi pada enam waktu yang berbeda . Umumnya , perolehan kembali(recovery) ELISA harus diantara 80 % sampai 120 % sehingga dinyatakan akurat , sedangkan koefisien variasi ( CV ) dari analit harus tidak lebih dari 10% uji intra dan 15% untuk uji inter untuk bisa dikatakan presisi

Tabel 2. Recovery SEA dari anti SEA mAb4 dan mAb10

Hasil pada Tabel 2 menunjukkan bahwa recovery intra antara 82,67 % sampai 108,93 % dan recovery inter dari 83,39 % menjadi 111,95 %. . CV intra berkisar antara 3,16 % sampai 6,05 % sedangkan CV inter dari 5,17 % menjadi 10,85 %. Hasil ini menunjukkan bahwa metode ini memberikan hasil yang akurat dan berulang .

4. Kesimpulan

Penelitian ini menunjukkan dan memvalidasi mAb basis ELISA sandwich dapat digunakan untuk mendeteksi SEA pada makanan

10 sel hidridoma dengan afinitas tinggi diperoleh setelah pengebalan (imunisasi), penggabungan (fusi) dan pemilihan.

Pasangan yang tebaik dioptimasi dengan analisis pairwise dan mAb diturunkan dari pasangan optimal untuk mengembangkan ELISA pada SEA

Nilai LOD pada metode ELISA yaitu 0.0282 ng/mL, uji ELISA sandwich merupakan uji yang sangat sensitif untuk mendeteksi SEA

Reaktivitas silang dari uji ELISA pada SEA dengan menggunakan SEB, SEC, SED, and SEE tidak berbeda bermakna

Dibanding menggunakan kit komersial, metode ini lebih spesifik

Perolehan kembali (Recovery) menggunakan susu murni menunjukkan akurasi dan reabilitas yang tinggi