FLUORIMETRI

SPEKTOMETRIBERDASARKAN FLORESENSI OLEH

MOLEKUL

Setiap Metode Analisa Akan Dibahas

• Dasar dari metode• Zat yang dapat dianalisa• Instrumentasi • Cara analisa dan• Gangguan (interference) yang mungkin terjadi

FLUORESENSI

• Setelah menyerap cahaya molekul akan tereksitasi kemudian akan mengalami relaksasi (molekul akan kembali ke ground state) dengan memancarkan cahaya, atau tanpa memancarkan cahaya.

• Pemancaran kembali cahaya setelah suatu zat menyerap cahaya disebut fluoresnsi.

• Fluoresensi yang tertunda disebut Phosporesensi.

Diagram Energi Level Molekul

• A eksitasi• B relaksasi tanpa radiasi• C relaksasi dengan radiasi

Fluoresensi vs Phosporesensi

Fluoresensi dan Konsentrasi

• Intensitas cahaya yang dipancarkan kembali (F) akan sebanding dengan banyaknya cahaya yang diserap.

F = K ( I0 - I ) atau F = K I0(1- (I / I0))

• Dari hukum Lambert – Beer A = εbc dimana A = -log( I / I0 )

maka, log( I / I0 ) = - εbc atau (I / I0) = 10 - εbc

• Kedua rumus digabung menjadi,F = K I0 ( 1- 10 - εbc ) atau dapat ditulisF = K I0 ( 1- e – 2,303 εbc ) dan dijadikan deret Mcclaurin didapat, F = K I0 (2,303 εbc – (2,303 εbc)2/2!+

(2,303 εbc)3/3! – (2,303 εbc)4/4! + …)

• Bila konsentrasi kecil ( c< 0,001 molar) maka suku yang dipangkatkan akan dapat diabaikan menjadi, F = K I0 (2,303 εbc )

• Bila I0 tetap dan K, ε, serta b yang juga tetap maka rumus menjadi F = k c

Zat yang bisa dianalisa dengan Fluorimetri

• Zat yang bisa dianalisa adalah zat yang dapat mengalami fluoresensi

• Zat OrganikSenyawa organik yang dapat mengalami flouresensi adalah zat organik yang mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi.Karbonil terkonjugasi, diena, dll.Zat yang mempunyai gugus hidrokarbon aromatik kecuali heterosiklik sederhana

Contoh Yang bisa mengalami fluoresensi

ContohHeterosiklik sederhana yang tidak dapat mengalami fluoresensi

• Senyawa AnorganikBeberapa senyawa anorganik dapat dianalisa dengan fluorimetri dengan syarat dibuat kompleks dengan senyawa organik yang dapat mengalami fluoresensi.

Ion Reagen panjang gelombang (nm)

Al3+ Alizarin garnet 500

F- Komplek Al alizarin garnet 500

Cd2+ 2-(o-Hidroksiphenil) benzoxazol

biru

Li+ 8-hidroksiquinolin 580

Sn2+ flavanol 470

Zn2+ Benzoin hijau

Instrumentasi

• Berikut ini diagram Fluorimeterr

• Spektrofluorimeter

Sumber cahaya (Sama dengan spektometri UV-Vis)

• Syarat sumber cahayaHarus dapat menghasilkan cahaya yang intensitasnya cukup besar di semua panjang gelombang pada daerah uv-vis (200-780 nm)

• Lampu tungten untuk cahaya visible dan lampu H2/D2 untuk cahaya uv.

• Lampu Xenon bisa menghasilkan cahaya dari 185-900 nm

Chopper (Sama dengan UV-Vis)

• Digunakan untuk menghalangi cahaya secara periodik sehingga cahaya yang masuk sampel seperti terpotong-potong. Akibatnya signal listrik yang dihasilkan detektor akan menjadi gelombang kotak dengan frekwensi tertentu.

Monokromator• Digunakan untu memilih cahaya monokromatik dengan

panjang gelombang tertentu dari cahaya polikromatik.• Ada dua monokromator yang terpasang pada

Spektrofluorimeter.• Ada dua macam pemecah cahaya grating dan prisma.• Monokromator Czerney-Turner : grating

• Monokromator bunsen : Prisma

Tempat Sampel

• Biasanya berbentuk silinder terbuat dari quartz atau fused silica.

• Semua window harus terbuat dari quartz atau fused silica.

Detector

• Harus dipasang tegak lurus dari lintasan cahaya eksitasi.

• Syarat : harus dapat mendeteksi cahaya di daerah 200-900 nm walaupun intensitasnya kecil.

• Phototube : bekerja berdasarkan efek photolistrik.

• Photomultiplier : terdiri dari elemen phothotube disusun berurutan.

Signal Prosessor

• Terdiri dari berbagai rangkaian elektronika yang berfungsi antara lain:

a) Penguatan signal listrik (amplifier)b) Filter listrik , hanya signal yang frekwensinya sama dengan frekwensi chopper yang dapat lolos.c) Analoog to digital converter (ADC)d) Averaging untuk meningkatkan signal to

noise ratio.

Cara Analisa Dengan Fluorimeter ( = Spektrometri UV-Visible)

• Analisa Kualitatif: dengan melihat bentuk spektrumnya. Jarang dilakukan karena kalau bukan zat murni hampir pasti terjadi overlap karena bentuk spektrum molekul broad bands.

• Harus ada larutan blangko untuk mengukur I0

• Analisa kuantitatif sebaiknya dilakukan pada panjang gelombang dengan absorbansi tertinggi (λ max)

• Spectrum dibuat dengan menggunakan standar tertinggi.

• Ada tiga cara analisa kuantitatif, metode satu standar, metode kurva kalibrasi dan metode penambahan standar.

• Metode satu standarCukup mempunyai satu larutan standar yang harus diukur absorbansinya.

F = kc, maka Fx = kcx dan Fs = kcs Jadi Ax / As = cx / cs atau cx = (Fx / Fs )cs Metode ini akan baik hanya bila harga cx mendekati cs .

• Metode kurva kalibrasiHarus mempunyai minimal 5 larutan standar dengan konsentrasi yang berbeda yang kemudian diukur fluoresensinyanya. Kemudian dibuat grafik danditentukan persamaan regresinya. Fluoresensinyasampel di intrapolasi ke kurva kalibrasi untuk mendapatkan konsentrasinya.

• Metode Penambahan StandarPada metode ini larutan sampel dipipet minimum lima kali dengan volume yang sama Vx dan dimasukkan ke dalam labu ukur yang berbeda tetapi volumenya sama. Kemudian ke dalam labu ukur tersebut dimasukkan larutan standar dengan volume yang divariasi vs. Selanjutnya ditambahkan pereaksi (bila diperlukan) dan diencerkan sampai tanda batas. Masing- masing larutan yang telah dibuat diukur fluoresensinyanya.

Maka didapatF = Fx + Fs F = kc’x + kc’s dimana, c’x = konsentrasi sampel yang telah diencerkan dan c’s = konsentrasi standar yang telah diencerkan jadi berlaku rumus pengenceran, c’x = cx vx / vlabu c’s = cs vs / vlabu

sehingga, A = (k cx vx / vlabu ) + (k cs / vlabu )vs

Dalam rumus tersebut yang berubah hanya F karena perubahan vs , jadi bila dibuat kurva volume standar vs melawan fluoresensi F didapat garis lurus dengan,Intersep = (k cx vx / vlabu ) danSlope = (k cs / vlabu )

(Intersep / slope) = cx vx / cs Jadi cx = (Intersep / slope) cs / vx

Intersep dan slope bisa didapat dari persamaan regresinya.

Contoh

Dari sampel air akan ditentukan kadar besinya.Ke dalam lima labu ukur yang volumenya 50 ml dimasukan masing-masing 10 ml sampel air. Kemudian berturut- turut dimasukkan 0,00; 5,00; 10,00; 15,00 dan 20,00 ml larutan standar 11,1 ppm Fe3+, sebelum diencerkan sampai tanda batas ditambahkan 10 ml KCNS ke dalam masing-masing labu ukur untuk menjadikan semua Fe menjadi (FeCNS)2+ yang berwarna merah. Setelah diencerkan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 574 nm dan didapat hasilnya berturut-turut 0,240; 0,437; 0,621; 0,809 dan 1,009. Hitunglah berapa ppm kadar Fe dalam sampel air.

Jawab

• Dengan regresi linier Volume standar melawan absorbansi didapat

F = 0,2412 + 0,03820 vs Jadi cx = (0,2412/0,03820) 11,1/10 ppm

cx = 7,01 ppm