1. PENDAHULUAN

Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling

utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang

merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan

satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon,

hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein

berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan

virus ( Anonim, 2013).

Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain

polisakarida, lipid, dan polinukleotida, yang merupakan penyusun utama

makhluk hidup. Selain itu, protein merupakan salah satu molekul yang paling

banyak diteliti dalam biokimia. Protein ditemukan oleh Jöns Jakob Berzelius

pada tahun 1838 (Anonim, 2013).

Protein merupakan polimer asam amino. Ada puluh asam amino yang

berbeda merupakan penyusun protein alami. Protein dibedakan satu sama

lain berdasarkan tipe, jumlah dan susunan asam aminonya. Perbedaan ini

menyebabkan perbedaan struktur molekuler, kandungan nutrisi dan sifat

fisikokimia. Protein merupakan konstituen penting dalam makanan, dimana

protein merupakn sumber energi sekaligus mengandung asam-asam amino

esensial seperti lysine, tryptophan, methionine, leucine, isoleucine dan valine

(esensial berarti penting bagi tubuh, namun tidak bisa disintesis dalam

tubuh). Protein juga merupakan komponen utama dalam berbagai makanan

alami, yang menentukan tekstur keseluruhan, misalnya keempukan produk

daging atau ikan, dan sebagainya. Protein terisolasi sering digunakan dalam

makanan sebagai unsur kandungan (ingredient) karena sifat atau fungsi

uniknya, antara lain kemampuannya menghasilkan penampilanm tekstur atau

stabilitas yang diinginkan. Misalnya, protein digunakan sebagai agen

pembentuk gel (gelling agent), pengemulsi (emulsifier), pembentuk busa

(foaming agent) dan pengental (thickener). Beberapa protein makanan

merupakan enzim yang mampi meningkatkan laju reaksi biokimia tertentu,

baik yang menguntungkan maupun yang merugikan merusak. Di dalam

analisis makanan, mengetahui kadar total, jenis, struktur molekul dan sifat

fungsional dari protein sangat penting (Girindra 1993).

Protein juga merupakan suatu zat makanan yang penting bagi tubuh.

Protein berfungsi sebagai pembangun struktur, biokatalis, hormon, sumber

energi, penyangga racun, pengatur pH, dan sebagai pembawa sifat turunan

dari generasi ke generasi. Protein tersusun atas atom C, H, O, dan N serta

unsur lainnya yaitu P dan S yang membentuk unit-unit asam amino (Girindra

1993). Protein-protein tersebut merupakan hasil ekspresi dari informasi

genetik masing-masing suatu organisme tak terkecuali pada bakteri

(Campbell et al., 2009; Lehninger et al., 2004). Protein dan gen memiliki

hubungan yang sangat dekat dimana kode genetik berupa DNA dienkripsi

dalam bentuk kromosom yang selanjutnya kode genetik tersebut

ditranslasikan menjadi protein melalui serangkain mekanisme yang

melibatkan RNA dan ribosom (Vo-Dinh, 2005).

Protein tersusun dari peptida-peptida sehingga membentuk suatu

polimer yang disebut polipeptida. Setiap monomernya tersusun atas suatu

asam amino. Asam amino adalah molekul organik yang memiliki gugus

karboksil dan gugus amino yang mana pada bagian pusat asam amino

terdapat suatu atom karbon asimetrik (Gambar 1). Pada keempat

pasangannya yang berbeda itu adalah gugus amino, gugus karboksil, atom

hidrogen, dan berbagai gugus yang disimbolkan dengan huruf R. Gugus R

disebut juga sebagai Rantai samping yang berbeda dengan gugus amino.

(Campbell et al., 2009).

Gambar 1. Struktur umum asam amino (Lehninger et al., 2004).

Protein yang tersusun dari rantai asam amino akan memiliki berbagai

macam struktur yang khas pada masing-masing protein. Karena protein

disusun oleh asam amino yang berbeda secara kimiawinya, maka suatu

protein akan terangkai melalui ikatan peptida dan bahkan terkadang

dihubungkan oleh ikatan sulfida. Selanjutnya protein bisa mengalami

pelipatan-pelipatan membentuk struktur yang bermacam-macam. Adapun

struktur protein meliputi struktur primer, struktur sekunder, struktur tersier,

dan struktur kuartener (Gambar 2) (Berg et al., 2006).

Gambar 2. Level dari struktur protein (Berg et al., 2006).

Struktur primer merupakan struktur yang sederhana dengan urutan-

urutan asam amino yang tersusun secara linear yang mirip seperti tatanan

huruf dalam sebuah kata dan tidak terjadi percabangan rantai (Gambar 4).

Struktur primer terbentuk melalui ikatan antara gugus α–amino dengan gugus

α–karboksil (Gambar 3). Ikatan tersebut dinamakan ikatan peptida atau

ikatan amida. Struktur ini dapat menentukan urutan suatu asam amino dari

suatu polipeptida (Berg et al., 2006).

Gambar 4. Struktur primer dari protein (Campbell et al., 2009).

Struktur sekunder merupakan kombinasi antara struktur primer yang

linear distabilkan oleh ikatan hidrogen antara gugus =CO dan =NH di

sepanjang tulang belakang polipeptida. Salah satu contoh struktur sekunder

adalah α-heliks dan β-pleated (Gambar 5 dan 6). Struktur ini memiliki

segmen-segmen dalam polipeptida yang terlilit atau terlipat secara berulang.

(Campbell et al., 2009).

Struktur tersier dari suatu protein adalah lapisan yang tumpang tindih

di atas pola struktur sekunder yang terdiri atas pemutarbalikan tak beraturan

dari ikatan antara rantai samping (gugus R) berbagai asam amino (Gambar

10). Struktur ini merupakan konformasi tiga dimensi yang mengacu pada

hubungan spasial antar struktur sekunder. Struktur ini distabilkan oleh empat

macam ikatan, yakni ikatan hidrogen, ikatan ionik, ikatan kovalen, dan ikatan

hidrofobik. Dalam struktur ini, ikatan hidrofobik sangat penting bagi protein.

Asam amino yang memiliki sifat hidrofobik akan berikatan di bagian dalam

protein globuler yang tidak berikatan dengan air, sementara asam amino

yang bersifat hodrofilik secara umum akan berada di sisi permukaan luar

yang berikatan dengan air di sekelilingnya (Lehninger et al, 2004).

Gambar 10. Bentuk struktur tersier dari protein denitrificans cytochrome C550 pada bakteri Paracoccus

denitrificans (Berg et al, 2006).

Struktur kuarterner adalah gambaran dari pengaturan sub-unit atau

promoter protein dalam ruang. Struktur ini memiliki dua atau lebih dari sub-

unit protein dengan struktur tersier yang akan membentuk protein kompleks

yang fungsional. ikatan yang berperan dalam struktur ini adalah ikatan

nonkovalen, yakni interaksi elektrostatis, hidrogen, dan hidrofobik. Protein

dengan struktur kuarterner sering disebut juga dengan protein multimerik.

Jika protein yang tersusun dari dua sub-unit disebut dengan protein dimerik

dan jika tersusun dari empat sub-unit disebut dengan protein tetramerik

(Gambar 11) (Lehninger et al, 2004

Gambar 11. Beberapa contoh bentuk struktur kuartener.

B i o s i n t e s i s p r o t e i n m e r u p a k a n p o l i m e r y a n g

b e r f u n g s i s e b a g a i  penyusun protoplasma dan struktur tubuh lainnya.

Protein dapat berupa enzim atau hormon, antara lain sebagai penyusun

pigmen pada tumbuhan. Penyusun hemoglobin dalam darah manusia dan

hewan. Serta penyusunan serum dalam plasma. Jenis dan rangkain yang

menyusun protein berbeda antara protein yang satu dengan protein yang

lainnya. Mekanisme sisntesis protein terjadi melalui dua tahap utama

yaitu transkripsi dan translasi. Sintesis protein merupakan proses

yang sangat kompleks. Informasi genetik yang dikode pada susunan basa

DNA diterjemah kedalam 20 macam asam amino (Campbell et al., 2009).

Transkrip adalah percetakan mRNA oleh DNA. Sedangkan

translasi adalah penerjemahan kode oleh tRNA berupa urutan yang dikehendaki.

Proses transkripsi terjadi selama proses inisiasi, elogasi, dan terminasi.

Enzim yang berperan dalam ternskrip adalah RNA pol imerase.

Ada lima tahapan sintesis protein dan masing –masing memerlukan jumlah komponen

(Campbell et al., 2009).

Biosintesis protein yang terjadi dalam sel merupakan reaksi kimia yang

kompleks dan mel ibatkan beberapa senyawa penting, terutama

DNA dan R N A . m o l e k u l D N A m e r u p a k a n r a n t a i

p o l i n u k l e u t i d a y a n g m e m p u n y a i  beberapa jenis basa purin dan

piramidin, dan berbentuk heliks ganda. D e n g a n d e m i k i a n a k a n

t e r j a d i h e l i k s g a n d a y a n g b a r u d a n p r o s e s terbentunya

molekul DNA baru ini disebut replikasi, urutan basa purin

dan piramidin pada molekul DNA menentukan urutan asam amino

dalam pembentukan protein. Peran dari DNA itu sendri sebagai pembawa

informasi genetik atau sifat-sifat keturunan pada seseorang. Dua

tahap pembentukan protein (Campbell et al., 2009).:

1 . T a h a p p e r t a m a d i s e b u t t r a n s k r i p s i ,

y a i t u p e m b e n t u k a n m o l e k u l R N A sesuai

pesan yang diberikan oleh DNA.

2. T a h a p k e d u a d i s e b u t t r a n s l a s i , y a i t u

m o l e k u l R N A m e n e r j e m a h k a n informasi genetika

kedalam proses pembentukan protein.

Biosintesis protein terjadi dalam ribosom, yaitu suatu

partikel yang t e r d a p a t d a l a m s i t o p l a s m a r R N A b e r s a m a

d e n g a n p r o t e i n m e r u p a k a n komponen yang membentuk ribosom

dalam sel, peranannya dalam dalam sintesis protein yang berlangsung dalam

ribosom belum diketahui. mRNA diproduksi dalam inti sel dan

merupakan RNA yang paling s e d i k i t j u m l a h n y a . K o d e

g e n e t i k a y a n g b e r u p a u r u t a n b a s a p a d a r a n t a i nukleutida

dalam molekul DNA. Tiap tiga buah basa yang berurutan disebut

kodon, sebagai contoh AUG adalah kodon yang terbentuk dalam dari kombinasi adenin-

urasil-guanin, GUG adalah kodon yang terbentuk dari kombinasi

guanin-urasil-guanin. Kodon yang menunjuk asam amino yang sama disebut

sinonim, misalnya CAU dan CAC adalah sinonim untuk histidin. Perbedaan

antara sinonim tersebut pada umumnya adalah basa pada

kedudukan ketiga misalnya GUU,GUA,GUC,GUG (Campbell et al., 2009).

Bagian molekut tRNA yang penting dalam biosintesis

protein ialah lengan asam amino yang mempunyai fungsi

mengikat molekul asam amino t e r t e n t u d a l a m l i p a t a n a n t i

k o d o n . L i p a t a n a n t i k o d o n m e m p u n y a i f u n g s i menemukan

kodon yang menjadi pasangannya dalam mRNA yang tedapat

d a l a m r i b o s o m . P a d a p r o s e s b i o s i n t e s i s p r o t e i n , t i a p

m o l e k u l . t R N A membawa satu molekul asam amino masuk kedalam

ribosom. Pembentukkan ikatan asam amino dengan tRna ini berlangsung

dengan bantuan enzim amino asli tRNA sintetase dan ATP melalui dua tahap reaksi

(Campbell et al., 2009) :

1 . A s a m a m i n o d e n g a n e n z i m d a n

A M P m e m b e n t u k k o m p l e k s aminosil-AMP-

enzim.

2 . Reaksi antara kompleks aminoasil-AMP-enzim dengan tRNA.

Proses biosintesis akan berhenti apabila pada m RNA terdapat

kodon UAA,UAG,UGA. Karena dalam sel normal tidak terdapat

tRNA yangmempunyai antikodon komplementer.

2. METODOLOGI

Alat-alat yang digunakan untuk analisis protein antara lain yaitu

tabung reaksi, penjepit tabung reaksi, gelas ukur 50 ml/100 ml, pipet ukur 10

ml pakai pengisap, gelas piala 50 ml, spatel, timbangan analitik, sikat tabung

reaksi, batang pengaduk kaca, corong 0,5 cm, rak tabung reaksi, gelas ukur

25 ml, pipet ukur 5 ml pakai pengisap, penangas air, lumping, spatula, botol

semprot, dan pipet tetes.

Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis protein antara lain yaitu

Hg-Nitrat (Hg2(NO3)2), Asam Nitrat (HNO3), Fenol (C6H5-OH), Urea

(CO(NH2)2), Amonium Sulfat (NH4)2SO4), Hg-Khlorida (Hg2Cl2), Asam

klorida (HCl), Asam Pikrat, Hg-Nitrit (Hg2(NO2)2), Natrium Hidroksida

(NaOH), Kupri Sulfat (CuSO4), Kertas Lakmus, Pb. Asetat (CH3COO)2Pb),

Perak Nitrat (AgNO3), Buffer Asetat, dan Asam trikhor asetat

Prosuder dari tes Biuret yaitu masukkan 3 ml larutan protein

(konsentrasi 2 ) ke dalam tabung reaksi. Lalu tambahkan 1 ml NaOH 40%.

Kemudian tambahkan setetes demi setetes larutan 0,5 % CuSO4 sehingga

terjadi warna merah muda atau ungu. Selanjutnya pada tabung reaksi yang

lain, panaskan sedikit urea di dalam tabung reaksi di atas api kecil hingga

cair dan mendidih (hati-hati jangan sampai menjadi arang). Tambahkan 1 ml

NaOH 40%. Lalu tambahkan setetes demi setetes larutan 0,5 % CuSO4

amati apa yang terjadi.

Prosuder kerja dari uji Millon yaitu masukkan 2 ml larutan protein

(konsentrasi 2 %) kedalam tabung reaksi. Tambahkan 1 ml pereaksi

merkurisulfat (1 % HgSo4) dilarutkan dalam 10% asam sulfat). Lalu

panaskan campuran ini, mungkin terbentuk endapan kuning. Dinginkan

tabung dengan air mengalir. Kemudian tambahkan 1 tetes larutan NaNO2

1%. Panaskan lagi, endapan atau larutannya akan menjadi merah.

Prosuder kerja dari uji Xantoprotein yaitu masukkan 3 ml larutan

protein (konsentrasi 2 %) ke dalam tabung reaksi. Lalu tambahkan 1 ml

HNO3 pekat. Kemudian panaskan campuran sampai larutan menjadi kuning

tua hati-hati jangan sampai terhirup uap /asap saat proses

pemanasan. Dinginkan tabung dengan kran air mengalir. Kemudian

tambahkan amonia hingga warnanya berubah menjadi jingga, atau

tambahkan setetes demi setetes larutan NaOH pekat sampai larutan dalam

tabung menjadi basa (uji dengan lakmus merah) dan amati perubahan warna

yang terjadi. Catatan : beberapa senyawa benzena juga memeberi reaksi

yang positiif. Lakukan uji xanthoprotein ini dengan larutan fenol 2 %.

Prosedur kerja dari uji Ninhidrin yaitu atau pH larutan protein sampai

0,5 % sampai pH 7. Ambil 1 ml larutan protein tersebut (dalam tabung

reaksi), tambahkan 10 tetes larutan nihidrin 0,2 %. Kemudian panaskan pada

suhu 100 selama 10 menit. Selanjutnya  amati perubahan yang terjadi.

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling

utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang

merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan

satu sama lain dengan ikatan peptida. Protein merupakan konstituen penting

dalam makanan, dimana protein merupakn sumber energi sekaligus

mengandung asam-asam amino esensial seperti lysine, tryptophan,

methionine, leucine, isoleucine dan valine (esensial berarti penting bagi

tubuh, namun tidak bisa disintesis dalam tubuh). Protein juga merupakan

komponen utama dalam berbagai makanan alami, yang menentukan tekstur

keseluruhan, misalnya keempukan produk daging atau ikan, dan sebagainya.

Protein terisolasi sering digunakan dalam makanan sebagai unsur

kandungan (ingredient) karena sifat atau fungsi uniknya, antara lain

kemampuannya menghasilkan penampilanm tekstur atau stabilitas yang

diinginkan. Misalnya, protein digunakan sebagai agen pembentuk gel (gelling

agent), pengemulsi (emulsifier), pembentuk busa (foaming agent) dan

pengental (thickener). Di dalam analisis makanan, mengetahui kadar total,

jenis, struktur molekul dan sifat fungsional dari protein sangat penting. Oleh

karena itu berkembang berbagai metode analisis protein. Analisa protein

dilakukan dengan beberapa cara yaitu: 1) Analisa kualitatif: Test Biuret, Test

Molish, Test Xanthoprotein, Test Millon, Test Ninhidrin; dan 2) Analisa

kuantitatif: Metode Dumas, Spektrofotometri UV, Titrasi formol, Turbidimetri

atau kekeruhan, Metode Kjeldahl.

Berikut adalah reaksi dari uji Biuret :

Larutan Protein + NaOH + CuSO4 lembayung

Berlaku untuk senyawaan yang mempunyai jumlah ikatan

peptida > 1. Reaksi ini dapat dipakai untuk penentuan protein

secara kualitatif dan kuantitatif.

Beberapa reaksi uji terhadap protein, tes biuret merupakan salah satu

cara untuk mengidentifikasi adanya protein, dalam larutan basa biuret

memberikan warna violet dengan CuSO4 karena akan terbentuk kompleks

Cu2+ dengan gugus CO dan gugus NH dari rantai peptida dalam suasana

basa. Pengendapan dengan logam diketahui bahwa protein mempunyai daya

untuk menawarkan racun. Salting out, apabila terdapat garam-garam

anorganik alam presentase tinggi dalam larutan protein, maka kelarutan

protein akan berkurang, sehingga mengakibatkan pengendapan.

Pengendapan dengan alkohol, penambahan pelarut organik seperti aseton

atau alkohol akan menurunkan kelarutan protein pada kedudukan dan

distribusi dari gugus hidrofil polar dan hidrofob polar di dalam molekul hingga

menghasilkan protein yang dipol.

Uji Millon yang menggunakan pereaksi Milon adalah larutan merkuro

dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada

larutan protein maka akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah

menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya rekasi ini positif untuk fenol

karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksil yang

berwarna. Tetapi khusus untuk proteoso dan pepton secara langsung akan

menghasilkan larutan yang berwarna merah. Endapan yang terbentuk

berupa garam kompleks dari tirosin yang ternitrasi. Jika larutan protein yang

akan dianalisis ada dalam suasana basa, maka terlebih dahulu harus

dinetralisasi dengan asam (bukan HCl). Jika tidak ion merkuri dari pereaksi

akan mengendap sebagai Hg(OH)2. Ion Cl- dapat bereaksi dengan asam

nitrat menghasilkan radikal klor (Cl2). Radikal klor dapat merusak kompleks

berwarna.

Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam

larutan protein. Setelah dicampur terjadi pengendapan putih yang dapat

berubah menjadikuning apabila dipanaskan.. reaksi yang terjadi ialah nitrasi

pada inti Benzen yang terdapata pada molekul protein. Jadi, reaksi ini positif

untuk protein, fenilalanin dan triptofan. Kulit kita bila kena asam nitrat

berwarna kuning, itu juga karena terjadi reaksi xantoprotein ini.

Uji xantoprotein dapat digunakan untuk menguji atau mengidentifikasi

adanya senyawa protein  karena uji xantoprotein dapat menunjukan adanya

senyawa asam amino yang memiliki cincin benzene seperti fenilalanin,

tirosin, dan tripofan. Langkah pengujianya adalah larutan yang diduga

mengandung senyawa protein ditambahkan larutan asam nitrat pekat

sehingga terbentuk endapan berwarna putih. Apabila larutan tersebut

mengandung protein maka endapan putih tersebut apabila dipanaskan akan

berubah menjadi warna kuning.

Uji Ninhidrin terjadi apabila ninhidrin dipanaskan bersama asam

amino maka akan terbentuk kompleks berwarna. Asam amino dapat

ditentukan secara kuntitatif dengan jalan menggunakan intensitas warna

yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi asam amino tersebut. Pada

reaksi ini dilepaskan CO2 dan NH4 sehingga asam amino dapat ditentukan

secara kuantitatif dengan mengukur jumlah CO2 dan NH3 yang dilepaskan.

Prolin dan hidroksi prolin menghasilkan warna kompleks yang berbeda

warnanya dengan asam amino lainnya. Kompleks berwarna yang terbentuk

mengandung dua molekul ninhidrin yang bereaksi dengan ammonia yang

dilepaskan pada oksidasi asam amino. Hasil uji positif pada uji ninhidrin

diberikan pada asam amino yang mengandung asam α-amino dan peptida

yang memiliki gugus α-amino yang bebas.

Akhir-akhir ini, teknik instrumen otomastis telah berkembang dengan

kemampuan penentuan kadar protein dalam sampel dengan cepat. Teknik ini

berdasarkan metode yang dikembangkan oleh Dumas lebih dari 1,5 abad

yang lalu, dan mulai berkompetisi dengan metode Kjeldahl sebagai metode

standart penentuan kadar protein karena lebih cepat.

Sampel dengan massa tertentu dipanaskan dalam tangas pada suhu

tinggi (sekitar 900 oC) dengan adanya oksigen. Cara ini akan melepaskan

CO2, H2O dan N2. Gas CO2 dan H2O dipisahkan dengan melewatkan gas

pada kolom khusus untuk menyerapnya. Kandungan nitrogen kemudian

dihitung dengan melewatkan sisa gas melalui kolom dengan detector

konduktivitas termal pada ujungnya. Kolom ini akan membantu memisahkan

nitrogen dari sisa CO2 dan H2O. Alat dikalibrasi dengan senyawa analis

yang murni dan telah diketahui jumlah nitrogennya, seperti EDTA (= 9,59

%N). Dengan demikian sinyal dari detektor dapat dikonversi menjadi kadar

nitrogen. Dengan metode Kjeldahl diperlukan konversi nitrogen dalam

sampel menjadi kadar protein, tergantung susunan asam amino protein.

Sejumlah metode telah ditemukan untuk pengukuran kadar protein

berdasarkan spektroskopi UV-visible. Metode ini berdasarkan kemampuan

protein menyerap (atau membaurkan) cahaya di daerah UV-visible. Atau

secara kimiawi atau fisik memodifikasi protein untuk membuatnya menyerap

(atau membaurkan) cahaya di daerah UV-visible. Prinsip dasar di balik

masing-masing uji ini serupa.

Pertama-tama, semua serapan kurva kalibrasi (atau turbiditas) vs

kadar protein disiapkan menggunakan satu seri larutan protein yang sudah

diketahui kadarnya. Serapan (atau turbiditas) larutan yang dianalisis

kemudan diukur pada panjang gelombang yang sama, dan kadar protein

ditentukan dari kurva kalibrasi. Perbedaan utama pengujian ini adalah gugus

fungsi yang berperan untuk absorbsi atau pembiasan radiasi

elektromagnetik, misalnya ikatan peptida, rantai samping aromatis, gugus inti

dan agregat protein.

Molekul protein yang umumnya larut dapat dibuat mengendap

dengan penambahan senyawa kimia tertentu, seperti asam trikloroasetat.

Pengendapan protein menyebabkan larutan menjadi keruh, sehingga

konsentrasi protein dapat ditentukan dengan mengukur derajat kekeruhan

(turbiditas).

Metode Kjeldahl dikembangkan pada tahun 1883 oleh pembuat bir

bernama Johann Kjeldahl. Makanan didigesti dengan asam kuat sehingga

melepaskan nitrogen yang dapat ditentukan kadarnya dengan teknik titrasi

yang sesuai. Jumlah protein yang ada kemudian dihitung dari kadar nitrogen

dalam sampel.

Prinsip dasar yang sama masih digunakan hingga sekarang,

walaupun dengan modifikasi untuk mempercepat proses dan mencapai

pengukuran yang lebih akurat. Metode ini masih merupakan metode standart

untuk penentuan kadar protein. Karena metode Kjeldahl tidak menghitung

kadar protein secara langsung, diperlukan faktor konversi (F) untuk

menghitung kadar protein total dan kadar nitrogen.

Faktor konversi 6,25 (setara dengan 0,16 g nitrogen per gram protein)

digunakan untuk banyak jenis makanan, namun angka ini hanya nilai rata-

rata, tiap protein mempunyai factor konversi yang berbeda tergantung

komposisi asam aminonya. Metode Kjeldahl terdiri dari tiga langkah : digesti,

netralisasi dan titrasi.

a. Digestion

Sampel makanan yang akan dianalisis ditimbang dalam labu

digesti dan didigesti dengan pemanasan dengan penambahan

asam sulfat (sebagai oksidator yang dapat mendigesti

makanan), natrium sulfat anhidrat (untuk mempercepat

tercapainya titik didih) dan katalis sepert tembaga (Cu),

selenium, titanium, atau merkurium (untuk mempercepat

reaksi).

Digesti mengubah nitrogen dalam makanan (selain yang

dalam bentuk nitrat atau nitrit) menjadi amonia, sedangkan

unsur oganik lain menjadi CO2 dan H2O. Gas amonia tidak

dilepaskan ke dalam larutan asam karena berada dalam

bentuk ion amonium (NH4 +) yang terikat dengan ion sulfat

(SO4 2-) sehingga yang berada dalam larutan adalah :

N(makanan) (NH4)2SO4 (1)

b. Netralisasi

Setelah proses digesti sempurna, labu digesti dihubungkan

dengan labu penerima (receiving flask) melalui sebuah

tabung. Larutan dalam labu digesti dibasakan dengan

penambahan NaOH, yang mengubah amonium sulfat menjadi

gas amonia :

(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH3 + 2 H2O + Na2SO4 (2)

Gas amonia yang terbentuk dilepaskan dari larutan dan

berpindah keluar dari labu digesti masuk ke labu penerima,

yang berisi asam borat berlebih. Rendahnya pH larutan di labu

penerima mengubah gas amonia menjadi ion amonium serta

mengubah asam borat menjadi ion borat:

NH3 + H3BO3 NH4+ + H2BO3- (3)

c. Titrasi

Kandungan nitrogen diestimasi dengan titrasi ion amonium

borat yang terbentuk dengan asam sulfat atau asam

hidroklorida standar, menggunakan indikator yang sesuai

untuk menentukan titik akhir titrasi.

H2BO3- + H+ H3BO3 (4)

Kadar ion hidrogen (dalam mol) yang dibutuhkan untuk

mencapai titik akhir titrasi setara dengan kadar nitrogen dalam

sampel makanan (persamaan 3).

Keuntungan dari metode Kjeldahl yaitu metode Kjeldahl digunakan

secara luas di seluruh dunia dan masih merupakan metode standar

dibanding metode lain. Serta sifatnya yang universal, presisi tinggi dan

reprodusibilitas baik membuat metode ini banyak digunakan untuk penetapan

kadar protein. Sedangkan kerugiannya yaitu metode ini tidak memberikan

pengukuran protein sesungguhnya, karena tidak semua nitrogen dalam

makanan bersumber dari protein. Kedua, protein yang berbeda memerlukan

faktor koreksi yang berbeda karena susunan residu asam amino yang

berbeda. Ketiga, penggunaan asam sulfat pada suhu tinggi berbahaya,

demikian juga beberapa katalis. Serta teknik ini membutuhkan waktu lama.

Keuntungan dari metode Dumas termodifikasi yaitu jauh lebih cepat

dari pada metode Kjeldahl (di bawah 4 menit per pengukuran, dibandingkan

dengan 1-2 jam pada Kjeldahl). Metode ini juga tidak menggunakan senyawa

kimia atau katalis toksik. Banyak sampel dapat diukur secara otomatis serta

mudah digunakan. Sedangkan kerugiannya yaitu mahal, tidak memberikan

ukuran protein sesungguhnya, karena tidak semua nitrogen dalam makanan

berasal dari protein, protein yang berbeda membutuhkan faktor koreksi yang

berbeda karena susunan asam amino yang berbeda. Serta ukuran sampel

yang kecil menyulitkan mendapatkan sampel yang representatif.

Keuntungan teknik UV-visible merupakan teknik yang cepat dan

sederhana, serta sensitif terhadap protein dengan konsentrasi rendah.

Sedangkan kerugiannya yaitu Sebagian besar teknik UV-visible memerlukan

larutan yang encer dan jernih, serta tidak mengandung senyawa kontaminan

yang dapat mengabsorpsi atau memantulkan cahaya pada panjang

gelombang di mana protein akan dianalisis. Karena diperlukan larutan jernih,

maka makanan harus mengalami sejumlah tahap preparasi sampel sebelum

dianalisis, seperti homogenisasi, ekstraksi pelarut, sentrifugasi, filtrasi, dsb.

yang dapat menyita waktu dan tenaga. Selain itu, kadang-kadang sulit untuk

secara kuantitatif mengekstraksi protein dari jenis makanan tertentu,

terutama bila makanan tersebut telah mengalami proses dimana protein

menjadi agregat atau terikat secara kovalen dengan senyawa lain.

Kelemahan lain adalah, serapan tergantung pada jenis protein (karena

protein yang berbeda mempunyai sekuens/urutan asam amino yang berbeda

pula).

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2013. “Protein”. http://id.wikipedia.org/wiki/Protein. Diakses pada

tanggal 07 Juni 2013.

Berg, A. 2006. Protein. Jakarta: CV Rajawali.

Campbell., dkk. 2009. Biology. San Fransisco : Pearson.

Girindra, A. 1993. Biokimia I. Jakarta : Gramedia.

Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 2004. Principles of Biochemistry.

New York : Worth Pr.

Vo-Dinh. 2005. Methods in Molecular Biology, Protein Nanotechnology,

Protocols, Instrumentation and Applications. Totowa : Humana Press Inc.