METODE FITOKIMA

By : Dewy Resty B, S.Farm.Apt

EKSTRAKSIPengambilan bahan aktif dari tumbuhan dengan pelarut tertentu

FAKTOR-FAKTOR YANG BERPENGARUHBahan Awal (sampel)

Pelarut (menstrum)

Cara/Metode

Bahan AwalBUAH FRUCTUSDAUN/FOLIUMBIJI/SEMENHERBABATANG/CAULISRIMPANG/RHIZOMAKULIT KAYU/KORTEKSKAYU/LIGNUMSEGAR KERING

PELARUTSelektifitasMudah penangannyaEkonomis Ramah lingkungan

JENIS-JENIS PELARUTAir Hidrokarbon alifatis (PE, heksan)Kloro hidrokarbon (Diklormetan, Triklormetan)Alkohol (Etanol, Metanol, Isopropanol)Asam KarboksilatEsterEterMinyak

3 METODE EKSTRAKSIProses yg menghasilkan keseimbangan konsentrasi antara larutan dan residu padatcontoh : Maserasi, digesti, ultrasonic estractionProses ekstraksi seksama/menyeluruhcontoh : Perkolasi, Countercurrent extractionEkstraksi dengan gas superkritis

MACERATIONPenyarian dengan menggunakan pelarut beberapa hari (5 hari) dengan pengadukan (tidak kontinyu)Sesuai untuk bahan aktif yang mudah larut dalam cairan penyariSimplisia yang mengandung mucilago dan bahan lain yang mudah mengambangCara pengerjaan dan peralatan sangat sederhana dan murahPengerjaan lama dan penyarian kurang sempurnaKinetic Maceration : maserasi dg pengadukan konstan dan kontinuDigesti : Maserasi dengan pemanasan (40-50 C)

VORTICAL (TURBO) EXTRACTIONBahan dan pelarut diaduk dengan kecepatan tinggi (high speed mixer/homogenizer)Bahan semakin halus karena pengecilan ukuran partikel selama proses, sehingga meningkatkan luas permukaan bahan dengan cairan penyariPenyarian lebih baik dan waktu lebih singkat dari maserasiCukup beresiko untuk bahan yang termolabilPemisahan antara cairan penyari dengan residu jauh lebih aktifTidak efektif untuk large scale

ULTRASOUND EXTRACTIONPenyarian dengan menggunakan gelombang suara (ultrasonik, frek > 20 Hz)Prinsip :Dapat menyebabkan rusaknya bahan aktif akibat oksidasiEkstrak dapat tercemar oleh trace metalHigh energy Cost untuk penggunaan large scale

Extraction by Electrical EnergyPenyarian dengan menggunakan tenaga listrikPrinsip : membuat cavitymenyebarkan tekanan gelombang yang dihasilkan oleh listrik dg kecepatan ultrasonik

Proses Ekstraksi Seksama/menyeluruhExhaustive extraction : the complete removal of the desired extractive substance from materialPerkolatin : Plant material is exhaustively extracted by fresh solvent.Takes a long timeInfluenced by : selectivity of solvent, quantity flow (dropping rate) of the solvent, temperaturRepercolation :First extracted with fresh solvent and then some of percolate is used for exhaustive exctraction by stagewise concentration in another percolatorContinous Countercurrent Extraction

PENGUAPAN/PEMEKATAN EKSTRAKRotary Evaporator (pelarut organik, air sulit)Ekstrak kental

PRINSIP KERJA ROTAVAPORATORPenurunan titik didih solven akibat hisapan pompa vakum, suhu dan adanya pemutaran labu yang meningkatkan permukaan penguapan.

e.x : Etanol terdestilasi suhu 30 C dengan cepat

SEPARATIONWhy separate compounds ? to isolate or consentrate component(s) from a mixtureTo separate a component(s) from other species that would interfere in the analysis

Methods of SeparationExtraction CrystallizationDestilation Chromatography

Solvent ExtractionExtraction : transfer of a solute from one phase to another.Can use most any combination of phases (solid, liquid, gas, supercritical fluid)Solvent extraction use two immiscible liquids (typically aqueus/organic solvent)Organic solvents less dense than water (diethyl ether, toluene, hexane)Organic solvents more dense than water (chloroform, CCl4, dichloromethane)Like dissolves like so ideally, the extracting solvent should be similar to the solute (analyte)

Solvent Extraction

Destilation Ekstraksi senyawa kandungan menguap (minyak atsiri) dari bahan (segar atau simplisia) dengan uap air berdasarkan peristiwa tekanan parsial senyawa kandungan menguap dengan fase uap air dari ketel secara kontinu sampai sempurna dan diakhiri dengan kondensasi fase uap campuran (senyawa kandungan menguap ikut terdestilasi) menjadi destilat air bersama senyawa kandungan yang memisah sempurna atau memisah sebagian.

Alat destilasi

Prinsip Destilasi Perbedaan titik didih

Perbedaan titik uap

KROMATOGRAFITehnik pemisahan fisik campuran komponen berdasarkan perbedaan migrasi komponen-komponen tersebut dari fase diam oleh pengaruh fase gerak

Kromatografi Yang Sering DigunakanKromatografi KertasKromatografi Lapis Tipis (KLT)KCKT/HPLCKGC

Pemilihan kromatografi didasarkan pada Sifat kelarutanSifat keatsirianKromatografi KertasMudah larut dlm air (KH, asam amino, senyawa fenolat, asam organik, basa asam nukleat)Kromatografi Lapis tipisMudah larut dlm lipid (lipid, steroid, karotenoid, klorofil)GCMudah teratsirikan (minyak atsiri, monoterpen, sesquiterpen, asam lemak)KCKTSulit teratsirikan

Prinsip : partisi dua fase Semakin banyak air migrasi semakin lambatSemakin banyak pelarut organik migrasi semakin cepat (Rf tinggi)

1st solvent : pelarut organik

2nd solvent : pelarut air

Kromatografi KertasEluasi : descending satu arah atau terkadang 2 arahKertas : whatman 46 x 57 cmFase diam : selulosa, alumina, silikatDeteksi : bercak berwarna atau berfluoresensi UV setelah direaksikanFase gerak : Butanol : Asam Asetat : Air

Prosedur Kromatograpy KertasPemilihan eluen (pelarut pengembang)Eluasi sampel dengan berbagai eluenPilih yg bisa memisahkan senyawa tersebutFraksinasi dengan kromatografi kertasEkstrak yg akan ditotolkan berupa garisJangan lupa dikeringkan dg hair dryerEluasi dg eluen terpilihAmati nodaAmbil noda yg diinginkan dg memotong kertasEkstraksi dg pelarut yg sesuai

Perhitungan harga RfRf=jarak yg ditempuh noda sampeljarak eluasiJarak eluasiJarak noda

Contoh : isolasi flavonoidEluen : BAW (Butanol : Asam Asetat : Water) (4 : 1 : 5 )Penampak noda : uap amoniak (kuning intesif)Ambil bagian yg kuning dipotong kecil-kecilEkstraksi

KROMATOGRAFI LAPIS TIPISEluasi : Ascending (satu atau dua arah)Fase diam : selulosa, silika gel, celite, poliamida, sephadexKLT analitik : tebal 0,1 0,25 mmKLT preparatif : tebal ad 1 mm

KROMATOGRAFI KOLOMKolom konvesional : eluasi berdasarkan gaya gravitasiKromatografi cepat : Vacum Liquid ChromatographyEluasi dg bantuan pompaEluasi bs secara gradienKromatografi Cair Kinerja TinggiVolume injeksi >>> besarKolom juga jauh lebih besar dan panjangEluat dapat ditampung

Prosedur kromatografi kolomPemilihan Eluen Untuk FraksinasiStandar kuukumin dan ekstrak kurkuminoid yg telah dicuci dilarutkan dlm EtOH 96% dan ditotolkan 2-5l pd lempeng KLT. Lempeng KLT selanjutnya dieluasi dg menggunakan eluen yg sesuai di dlm bak kromatografi sampai batas yg ditentukan. Amati lempeng pada lampu UV 254 nm 365 nm. Eluen dipilih apabila ekstrak Kurkuminoid yg ditotolkan terpisah menjadi 3 noda yaitu kurkumin, bisdemetoksi kurkumin, dan desmetoksi kurkumin.

Perhatikan gambar di bawah iniFase IFase IIFase III

Langkah-langkah untuk fraksinasi dg kromatografi kolom sbb :Silika gel sebanyak 75x bobot ekstrak kurkuminoid dimasukkan dlm erlenmeyer dan ditambahkan dg eluen 2cm diatas permukaan silika gel, dikocok pelan hingga merata dan dimasukkan hati-hati ke dlm kolom kromatografi yg pd bagian bawahnya telah diberi glass wool. Kolom tsb kemudian didiamkan selama 1 hari u/ memampatkan dan melihat ada tidaknya keretakan

Apabila kolom tidak retak, tambahkan eluen 0,5 cm diatas permukaan silika gel dan bila retak ulangi langkah a. Kemudian kolom ditambahkan ekstrak kurkuminoid (1 % bobot silika) yg telah dicampur silika gel .

Alirkan eluen dan tampung sebanyak 50 ml dlm erlenmeyer (eluen ini blm membawa zat kimia tnman shg dpt dibuang). Selanjutnya kran dibuka dan diatur penetesannya (1 tetes/detik) dan ditampung dlm vial atau tabung yg telah dberi label (@ vial 5ml). Lihat gmbr dibawah ini.

Pada setiap vial dg kelipatan 10 dilakukan uji KLT u/ melihat noda yg dihasilkan. Apbila menghasilkan noda yg sama vial-vial tsb digabung. Penetesan dihentikan bila vial sudah tidak memberikan noda saat diuji KLT.

Setelah dimurnikan didapatkan Isolat (diidentifikasi)

IDENTIFIKASI ISOLATSpektroskopi UV/VisSpektroskopi IRSpektroskopi MassaSpektroskopi Resonansi Magnetik Nuklir

Sekian

Any Questions.??

*