Evaluasi untuk nanopartikel :

1. Ukuran partikel dan zeta potensial

Partikel suspensi dicampur dalam 5 mM Hepes pH 7,4 hingga dispersi yang sedikit opalescent

diperoleh. Diameter hidrodinamik (rata-rata dan PDI) dan zeta potensial ditentukan dengan

Nanosizer ( Malvern Instrument,UK) dengan scattering lampu dinamis dan laser Doppler

elektroforesis .(1)

2. Loading efficiency

Untuk menentukan efisiensi loading, TT sebagai isi dari nanopartikel sama seperti

supernatant, ditentukan dengan menggunakan pengujian uji protein asam mikro bichinconinic

(mBCA) (Pierce, Etten Leur, The Netherland) sesuai dengan petunjuk pabrik. Untuk

menentukan efisiensi enkapsulasi dari MDP, MDP yang telah dilabel dengan pewarna tertentu

dimasukkan dan jumlahnya ditentukan dalam supernatant sama seperti dalam formulasi

partikel menggunakan spektroskopi fluoresensi (FS920 flurometer,UK;eksitasi 495 nm, emisi

520 nm, band widths 5 nm).(1)

3. Stabilitas partikel dan Pelepasan antigen secara in vitro

TMC/MDP/TT-Senyawa label diencerkan hingga konsentrasi partikel akhir dalam dapar

tertentu (dalam penelitian yang menggunakan OVA digunakan fosfat 10 mM (PBS) pH 7,4

yang mengandung 0,01% tween 20 dan disimpan dalam beberapa aliquot pada suhu 37oC).

Pada waktu yang berbeda ukuran nanopartikel ditentukan dengan DLS setelah disperse

disentrifugasi (10 menit 14000 g) dan supernatant dikumpulkan untuk kuantifikasi pelepasan

TT-Senyawa label dengan spektroskopi fluorosen (eksitasi 495 nm, emisi 520 nm, band

widths 5 nm).(1)

4. Imunogenisitas

- Nasal vaksinasi

Mencit betina BALB/c umur 8 minggu diberikan 3 dosis TT atau yang ekuivalen dengan

dosis TT yang dienkapsulasi dengan interval 3 minggu. Mencit diberikan MDP melalui

nasal sebanyak, baik dalam larutan dengan TT atau dalam suspensi nanopartikel

TMC/MDP/TT. 3 injeksi TT diberikan secara im sebagai kontrol. Untuk pemberian nasal,

formulasi diberikan dalam volume tertentu. Untuk pemberian im, diinjeksikan pada tigh

muscle. Sampel darah diambil 2 minggu setelah dosis booster yang terakhir. Setelah

hewan coba dikurbankan, bagian limpa diambil dan nasal washes dikumpulkan.

- Penentuan serum IgG, IgG1, IgG2a dan secret IgA

Antibody spesifik TT (IgG, IgG1, IgG2a) dalam sera dan sIgA dalam nasal washes

ditentukan dengan ELISA. Plat dilapisi semalaman dengan jumlah tertentu TT. Setelah

diblok, 2 seri fold sera yang diencerkan dari mencit kemudian diletakkan pada plat. HRP-

konjugat antibody terhadap IgG, IgG1, IgG2a atau IgA ditambahkan dan dideteksi dengan

TMB. Absorbansi kemudian diukur pada panjang gelombang 450 nm dengan mikro plate

reader EL808 (Bio-Tek Instruments, Germany). Titer antibody yang dinyatakan sebagai

kebalikan dari pengenceran sampel yang sama dengan setengah dari serapan maksimum

dari kurva S absorbansi lengkap. (2)

- Aktivasi T-cell

Suspensi sel tunggal disiapkan dengan menggiling limpa dengan saringan pada ukuran

tertentu dan dibilas dengan medium limpa (RPMI 1640 yang ditambahkan dengan 10%

v/v FBS, 15 v/v glutamit, 1% v/v P/s dan 0,05 mM 2-mercaptoethanol). Splenocyt

kemudian distimulasi kembali dengan dengan TT dan dibiakan selama 5 hari pada suhu

37oC dan 5% CO2. Level IFN-γ dalam kultur supernatan ditentukan dengan menggunakan

BDOpteia IFN-γ ELISA sesuai dengan petunjuk pabrik. (1)

5. Sifat bioadhesif

Evaluasi sifat bioadhesif adalah utama dalam pengembangan bentuk system

penghantaran bioadhesif. Pengujian ini juga penting untuk menyaring banyaknya bahan dan

mekanismenya. Beberapa metode telah dikembangkan untuk studi mukoadhesi. Karena tidak

ada standar alat yang tersedia untuk pengujian kekuatan bioadhesi, hasil pengujian yang tidak

seragam antar metode sering tidak terhindarakan. Walaupun demikian, tiga metode pengujian

utama yang dikenal adalah tensile test, shear strength, dan peel strength.

Teknik yang paling popular yang digunakan untuk menentukan kekuatan penyebaran

pada pengujian bioadhesif adalah menggunakan kekuatan yang tegak lurus dengan jaringan

atau permukaan adhesive selama tensile stress diatur. Tetapi selama shear stress, arah

kekuatan yang diberikan diubah menjadi sepanjang permukaan. Pada kedua model pengujian

tensile dan shear, tekanan yang sama didistribusikan sepanjang daerah kontak.(3)

Pengujian peel didasarkan pada perhitungan energi yang dibutuhkan untuk melepaskan patch

dari substrat, oleh karena itu pengujian ini terbatas hanya jika system bioadhesifnya

diformulasi sebagai patch.(4)

Pada percobaan yang menggunakan metode pengujian tensile dan shear, tekanan yang

diberikan secara seragam didistribusikan sepanjang bagian adhesif , dimana pada metode peel

tekanan difokuskan pada bagian tepi. Selanjutnya tensile dan shear mengukur sifat mekanik

dari system, sedangkan peel mengukur resistensi peeling force.

6. Residence time

Waktu tinggal atau residence time dari sediaan nasal diukur berdasarkan prosedur yang

telah digambarkan oleh Hagenaars yaitu menggunakan mencit BALAB/c yang berumur 8

sampai 10 minggu yang dianastesi ringan menggunakan isofluorane. Hidung mencit

dibersihkan dengan handuk, dan dengan cepat intensitas fluorosensinya (eksitasi 710 nm,

emisi 760, 780, 800, 820, dan 840 nm) diukur dengan menggunakan spectrum IVIS . Setiap

15 menit anastesi diberikan kembali dan intensitas fluoresensi ditentukan seperti prosedur

sebelumnya. Diantara waktu pengukuran, mencit disadarkan. Untuk menghitung fluoresensi

rata-rata dalam rongga hidung, sinyal pewarna IR spesifik 800 CW dipisahkan dari

background fluoresensi oleh spectrum yang tidak bercampur menggunakan Living Image 3.1

software (Caliper Life Sciences). Regions of interest (ROI) diatur sepanjang

rongga hidung mencit, dan intensitas pixel rata-rata dalam ROI dihitung

menggunakan software yang sama. Intensitas fluoresensi pada t = 0

ditetapkan pada 100%.(5)

Pustaka evaluasi :

1. Slutter Bram, Jiskoot Wim.,2010., Dual Role of CPG as Immune Modulator and Physical Crosslinker in Ovalbumin Loaded N-trimethyl chitosan (TMC) nanoparticles for Nasal Vaccination., LACDR ,The Netherlands.

2. Bal Suzanne M., 2011., Adjuvanted, Antigen Loaded N-trimethyl chitosan nanoparticles for Nasal and Intradermal Vaccination: Adjuvant and Site-Dependent Immunogenicity in Mice., Utrecht, The Netherlands.

3. Park K, Park H. 1990., Test methods of bioadhesion, Bioadhesive drug delivery systems.. Boca Raton: CRC Press Florida.

4. McCarron PA, Donnelly RF, Zawislak A, Woolfson AD, Price JH, McClelland R. 2005., Evaluation of a Water-soluble Bioadhesive patch for photodynamic therapy of vulval lesions. Int J Pharm.;293:11–23. [PubMed]

5. Slutter Bram, Jiskoot Wim.,2010., Antigen-Adjuvant Nanoconjugates for Nasal Vaccination: An Improvement over the Use of Nanoparticles?., LACDR, The Netherlands.