Deteksi Bakteri Patogen Streptococcus pyogenes dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)

Deteksi patogen bakteri Streptococcus pyogenes dilakukan dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan spesies kromosom dari UAB200, CS24, dan M24 sebagai template. Ketiga kromosom diisolasi dengan menggunakan metode lysis Bollet kedua. Sebelum lisis dengan microwave,dilakukan pengkondisian seperti mencuci dengan air suling steril dan freeze-thaw dilakukan. Produk amplifikasi spesies UAB200,, CS24 dan M24 sebagai template dengan PCR menggunakan 30 siklus terdeteksi oleh elektroforesis gel agarosa menggunakan penanda tangga 100pb dan penanda HindIII sebagai standar. Hasil yang diperoleh adalah sebagai berikut Gen emm6 dan emm12 memiliki 1495pb dan 1700pb panjang, masing-masing. Panjang kedua gen itu kurang lebih sama seperti yang di data yang diterbitkan (1452pb untuk gen emm6 dan 1693pb untuk gen emm12). datadari literatur menunjukkan bahwa panjang gen emm24 adalah 1617pb. Sayangnya, upaya untuk memperkuat gen emm24 gagal.

Teknik sintesis dan amplifikasi fragmen DNA secara in vitro yang dikenal dengan Polymerase chainreaction (PCR) merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi penyakit infeksi yang baru-baru ini banyak dikembangkan. Metode ini digunakan untuk mengatasi kelemahan metode diagnosis konvensional seperti imunologi dan mikrobiologi. Patogen memiliki waktu generasi lama dan tidak dapat dibiakkan secara in vitro atau patogen yang mirip dengan flora normal sulit untuk dideteksi dengan cara mikrobiologi biasa. Sedangkan titer antibodi tinggi tidak selamanya berbanding lurus dengan adanya infeksi aktif (Retnoningrum 1997; Madigan et al, 1997).

Teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik dimana terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara eksponensial dalam waktu yang relatif singkat. Teknikini sangat ideal untuk mengidentifikasi patogen dengan cepat dan akurat. Secara umum proses ini dapat dikelompokkan dalam tiga tahap yang berurutan yaitu denaturasi templat, annealing (penempelan) pasangan primer pada untai tunggal DNA target dan extension (pemanjangan atau polimerisasi), sehingga diperoleh amplifikasi DNA antara 106-109 kali (Watson et al, 1992; Retnoningrum 1997).

Metode yang dilakukan untuk memperoleh hasil deteksi antara lain :1. Isolasi kromosom Streptococcus pyogenes2. Penyiapan gel agarosa3. Amplifikasi gen emm6, emm12, dan emm24 Streptococcus pyogenes

Isolasi Kromosom Bakteri Patogen Streptococcus pyogenes galur UAB200, CS24 danM24. Streptococcus pyogenes adalah bakteri gram positif yang mempunyai dinding sel tebal sehingga sukar untuk dilisis. Untuk itu lisis dilakukan dengan dua cara yaitu dengan metode Bollet (Kaufhold et al, 1994) dan dengan tambahan perlakuan 3 kali proses cair-beku kemudian baru dilisis dengan microwave. Ternyata dengan penambahan tahap pencucian dengan aquades steril dan tahap freeze-thaw, didapatkan jumlah kromosom yang lebih banyak.

PCR dapat dilakukan walaupun hanya menggunakan sampel tanpa isolasi DNA, tetapi DNAtemplat yang dipersiapkan pada percobaan mengandung SDS dan deterjen yang menghambatenzim Taq DNA polimerase sehingga dapat menurunkan efisiensi PCR. Untuk itu perlu dilakukan presipitasi dengan etanol sekaligus untuk pemekatan kromosom.

Produk PCR gen emm12 mempunyai ukuran panjang antara 1600 pb dan 1800 pb. Ukuran panjang gen emm12 yang telah dipublikasi yaitu 1693 pb. Hasil elektroforesis produk PCR gen emm12 adalah 1700 pb. Menurut hasil yang dipublikasi (Mouw et al, 1988) bahwa ukuran panjang gen emm24 adalah 1617 pb.

Dapat disimpulkan bahwa isolasi kromosom galur UAB200, CS24 dan M24 sebagai templat telah berhasil dengan baik menggunakan lisis cara kedua dengan penambahan pencucian dengan aquades dan tahap freeze-thaw sebelum dialisis. Setelah amplifikasi diperoleh produk PCR gen emm6 dengan ukuran panjang 1495 pb, sedangkan gen emm12 adalah 1700 pb, berdasarkan teknik elektroforesis gel agarosa. Ukuran panjangnya mendekati dengan data dari publikasi. Namun untuk gen emm24 tidak berhasil.

Hollingshead, S.K., Fischetti, V.A. & Scott, J.R. 1986. Complete nucleotide sequence of type M protein of the group a Streptococcus. J. Biol. Chem. 261: 1677-1688.

Kaufhold, A., Podbielski, A., Baumgarten, G., Blokpoel, M., Top, J. & Schouls, L. 1994. Rapid typing of group a streptococci by the use of DNA amplification and nonradioactiveallele-specific oligonucleotide probes. FEMS Microbiology Letters 119: 9-26.

Madigan, M.T., Martinho, J.M. & Parker, J. 1997. Biology of Microorganism. USA: Prentice Hall International Inc

Mouw, A.R., Beachey, E.H. & Vickers, B. 1988. Molecular evolution of Streptococcus M protein cloning and nucleotide sequence of type 24 M protein gene and relation to other gene of Streptococcus pyogenes. J. Bacteriol. 170: 676- 684.

Retnoningrum, D.S. 1997. Penerapan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk diagnosis penyakit infeksi. Jurusan Farmasi FMIPA. Bandung: ITB.

Robbins, J.C., Spanier, J.G., Jones, S.J., Simpson, W.J. &Cleary, P.P. 1987. Streptococcus pyogenes type 12M protein gene regulation by upstream sequences. J.Bacteriol. 169: 5633-5640.

Watson, J.D., Gilman, M., Witkowski, J. & Zaller, M. 1992. Recombinant DNA. New York: WH Freeman.