aplikasi polymerase chain reaction pcr konvensional dan real time pcr untuk deteksi white spot...

SIDANG KOMPREHENSIF

RINA NOVITA PRANAWATYNPM. 230110080062

APLIKASI POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) KONVENSIONAL

DAN REAL TIME PCR UNTUK DETEKSI WHITE SPOT SYNDROME VIRUS

PADA KEPITING

UNIVERSITAS PADJADJARANFAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

PROGRAM STUDI PERIKANANJATINANGOR

Dibawah bimbingan: Ir. Ibnu Dwi

Buwono, Msi Ir. Evi Liviawaty, MP

LATAR BELAKANG...

Produksi Udang Windu

PCR Konvensional

PCR adalah reaksi berantai suatu primer dari urutan (sequence) DNA dengan bantuan enzym polymerase sehingga terjadi amplifikasi DNA target secara in vitro.

Pada analisa Polymerase Chain Reaction konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesis.

Real Time PCRReal Time Polymerase Chain Reaction adalah suatu metoda

analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real Time PCR adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut (Fatimi 2010).

Data yang dihasilkan dapat dianalisis dengan perangkat lunak komputer yang terhubung dengan thermal cycler untuk menghitung jumlah kopi DNA atau threshold cycle (Ct) dari patogen dalam sampel pangan tertentu (Fatimi 2010).

•Berdasarkan uraian diatas maka dapat diidentifikasi masalah yaitu sejauh mana potensi dan tingkat serangan kepiting sebagai carrier dalam penginfeksian penyakit White Spot Syndrome Virus pada udang windu dengan menggunakan PCR Konvensional dan Real Time PCR

IDENTIFIKASI MASALAH

•Penelitian ini bertujuan untuk mencari metode deteksi White Spot Syndrome Virus yang terbaik pada kepiting sebagai carrier WSSV yang menginfeksi udang windu dengan menggunakan PCR Konvensional dan Real Time PCR.

TUJUAN PENELITIAN

•Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada petambak udang windu tentang potensi kepiting yang merupakan carrier WSSV yang menyerang udang windu sehingga petambak dapat mengantisipasi secara dini penyakit WSSV.

KEGUNAAN PENELITIAN

Pendekatan Masalah...Budidaya Udang

WinduMengalami penurunan produksi

Penurunan mutu lingkung

an

Serangan

penyakit

Hama

Organisme

carrierKepiting

PCR Konvensio

nal

Real Time PCR

Deteksi

Hasil Penelitian

Hasil penelitian Kanchanaphum et al (1998) yang mengifeksi WSSV pada 3 spesies kepiting melalui suntikan menunjukkan bahwa ketika kepiting yang terinfeksi WSSV dimasukkan kedalam akuarium yang berisi udang yang sehat, maka dengan cepat WSSV langsung menginfeksi udang windu tersebut. Lo et al (1996a,b) dalam Kanchanaphum et al (1998) menyatakan bahwa WSSV pada carrier dapat dideteksi dengan amplifkasi PCR.

Berdasarkan hasil penelitian Otta et al. (1999), bahwa sampel kepiting sebagai vektor virus dan udang dengan kodisi sehat (tanpa gejala klinis WSSV) memberikan hasil negatif WSSV dengan uji one step PCR dan sebaliknya memberikan hasil positif WSSV ketika uji Nested PCR.

Hasil penelitian Tang dan Lightner (2001) yang menentukan sensitivitas pengujian real time PCR dengan mengkloning setiap genom virus. Plasmid yang dihasilkan dari kloning digunakan sebagai standar. Konsentrasi ditentukan dan dinyatakan sebagai jumlah molekul per rekasi. Pada pengujian 1 sampai 108 kopi dari setiap kontrol positif, ditentukan bahwa batas deteksi real time PCR adalah 1-10 kopi untuk DNA IHHNV dan DNA WSSV. Maka, real time PCR lebih sensitif daripada PCR konvensional, yaitu 3-6 x 104 kopi/µg DNA.

TEMPATPengambilan sampel

dilakukan di tambak udang windu di Kecamatan

Indramayu dan Pasekan Kabupaten Indramayu.Isolasi DNA dilakukan di

Laboratorium Bioteknologi Perikanan Fakultas Perikanan

dan Ilmu Kelautan Universitas PadjadjaranPemeriksaan dengan PCR

konvensional dan pemeriksaan dengan real

time PCR dilakukan di Laboratorium Biologi

Molekuler Balai Uji Standar Karantina Ikan Jakarta

WAKTU

Penelitian ini dilaksanakan pada

Bulan Mei sampai Juli 2012.

Alat-Alat Penelitian

• Botol plastik, cool boxPengambilan Sampel

• Autoclave, Analytical balance, gunting, pinset, sumpit plastik, mikrotube 1,5 ml, rak mikrotube, centrifuge, refrigerator, waterbath, vortex, mikropipet, mikrotips, timer,, sarung tangan, spidol marker

Isolasi

• PCR Chamber, GeneAmp PCR System 9700, Mesin Rotor-Gene Q yang dihubungkan dengan perangkat komputer, vortex, microcentrifuge, deep freezer, mikrotube 0,2 ml dan 0,5 ml, mikropipet, mikrotips, cooler block, beaker glass, sarung tangan

Amplifikasi

• Bejana elektroforesis dilengkapi dengan power supply, tangki, sisir, tutup, Analytical balance, Botol Scott, Gelas ukur ukuran 50 ml, corong, microwave, Ultraviolet illuminator, sendok kecil, mikropipet, mikrotips, waterpass, cooler block, parafilm, sendok pipih, refrigerator, kamera digital, sarung tangan

Elektroforesis

BAHAN-BAHAN PENELITIAN

Pengambilan Sampel

• Larutan Preservasi Alkohol : Gliserol (4:1)

• Es Curai

Isolasi

• Sampel kepiting

• Nuclei Lysis Solution

• 0,5M EDTA pH 8,0

• Proteinase K• RNase

Solution• Protein

Precipitation Solution

• Isopropanol• Ethanol 70%• DNA

Rehydration Solution

• Es curai

Amplifikasi

• Promega Go Taq® Green Master Mix

• Plasmid (+) standar sebagai kontrol positif WSSV

• Nuclease Free Water (NFW)

• Primer WSSV 270 dan WSSV 345

• DNA template

Elektroforesis

• Agarose • TAE (Tris

Acetic Acid EDTA) Buffer 50X

• Sybr Safe• Loading Dye • DNA Marker • Ethidium

Bromide (EtBr)

• Aquadest Steril

Amplifikasi dengan Real

Time PCR• Rnase-free

water, • 2x QuantiTect

Probe PCR Master Mix

• Primer WSSV 270 dan Primer WSSV 345

• Probe WSSV 296T

• Standar Positif (+) WSSV 2 x 105

• DNA template

Metode PCR Konvensional

Metode Real Time PCR

METODE PENELITIAN

Metode penelitian yang digunakan adalah metode survei dengan analisis deskriptif kualitatif. Penelitin

ini akan dilakukan dalam beberapa tahap yakni pengambilan sampel, penelitian di laboratorium, dan

analisis data.

PROSEDUR PENELITIAN

Setting Profil PCR

Preparasi Reagen PCR

Proses Real Time PCR

Interpretasi Data

Amplifikasi

Pengambilan Sampel Isolasi

Pemeriksaan dengan Real

Time PCRPemeriksaan dengan PCR Konvensional

Analisis Data

Elektroforesis

Kepiting sebanyak 7 ekor dari setiap lokasi tambak

8,5µl NFW x (jumlah sampel + 2)*

1µl F1 x (jumlah sampel + 2)*

1µl R1 x (jumlah sampel + 2)*

12,5µl Master Mix x (jumlah sampel + 2)*

23µl 23µl23µl23µl

2 µl template DNA sampel


2 µl plasmid + sebagai kontrol

positif

Kontrol Negatif

First Step PCR

ELEKTROFORESIS

Pembuatan Gel Agarose

Loading Hasil Amplifikasi PCR

Running Elektroforesis

Dokumentasi Gel dengan UV

Stok 105 104 103

1µl + 9µl NFW

1µl + 9µl NFW

23µl 23µl23µl23µl 23µl

23µl 23µl

2 µl NTC2 µl template DNA sampel

2 µl plasmid kontrol + 105



Pengenceran

Standar Positif Pembuat

an Campuran Reaksi

Real Time PCR

9 µl Rnase-free water x (jumlah sampel + 4)*

0.5µl Primer WSSV270 x (jumlah sampel + 4)*

0.5µl Primer WSSV345 x (jumlah sampel + 4)*

12.25 µl 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix x

(jumlah sampel + 4)*

0.5µl Probe WSSV296T x (jumlah sampel + 4)*



Analisa Data...

Data yang diperoleh dari hasil penelitian akan dianalisis secara deskriptif kualitatif yaitu membandingkan hasil DNA WSSV yang terdeteksi dengan menggunakan metoda PCR Konvensional dan Real Time PCR.

HASIL DAN PEMBAHASANPengamatan Gejala Klinis

Pengukuran Kualitas Dan Kuantitas DNA Genom

Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR Konvensional

Hasil Deteksi Wssv Dengan Real Time PCR

Perbandingan Hasil Deteksi PCR Konvensional Dan Real Time PCR

PENGAMATAN GEJALA KLINIS

Lokasi Organisme Jumlah (ekor)

PasekanScylla serrata 2Helice tridens 1

Pachygrapsus marmoratus 4

KarangsongHelice tridens 4

Ocypode quadrata 1Uca minax 2

Total 14

Secara fisik, semua sampel kepiting yang diperoleh tidak menunjukkan gejala klinis terserang virus white spot, yaitu adanya

bintik putih pada bagian tubuh.

Pengukuran Kualitas Dan Kuantitas DNA Genom

Sampel

Panjang Gelombang (nm) Konsentrasi/

C (ng/µl)

Rasio Absorbansi

(R)A260 A280

Pachygrapsus marmoratus (A1) 0,031 0,012 160 2,583Pachygrapsus marmoratus (A2) 0,039 0,018 185 2,167Pachygrapsus marmoratus (A3) 0,001 0,009 5 0,111Pachygrapsus marmoratus (A4) 0,133 0,074 665 1,797

Scylla serrata (B1) 0,021 0,007 105 3,000Scylla serrata (B2) 0,067 0,035 330 1,914Helice tridens (C1) 0,016 0,004 75 4,000Helice tridens (D1) 0,200 0,111 1005 1,802Helice tridens (D2) 0,109 0,050 540 2,180Helice tridens (D3) 0,354 0,180 1765 1,967Helice tridens (D4) 0,115 0,053 565 2,170

Uca minax (D5) 0,099 0,046 490 2,152Ocypode quadrata (D6) 0,059 0,026 290 2,269

Uca minax (D7) 0,064 0,030 320 2,133

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

SPEKTROFOTOMETER

ELEKTROFORESIS

1Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR Konvensional

:

M = Marker 100 bp DNA Ladder 9 = Sampel C1 Helice Tridens

1 = Kontrol Positif (76 bp) 10 = Sampel D1 Helice Tridens

2 = Kontrol Negatif 11 = Sampel D2 Helice Tridens

3 = Sampel A1 Pachygrapsus marmoratus (76 bp) 12 = Sampel D3 Helice Tridens

4 = Sampel A2 Pachygrapsus marmoratus (76 bp) 13 = Sampel D4 Helice Tridens

5 = Sampel A3 Pachygrapsus marmoratus (76 bp) 14 = Sampel D5 Uca minax

6 = Sampel A4 Pachygrapsus marmoratus 15 = Sampel D6 Ocypode quadrata (76 bp)

7 = Sampel B1 Scylla serrata (76 bp) 16 = Sampel D7 Uca minax (76 bp)

8 = Sampel B2 Scylla serrata (76 bp)

Keterangan :

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Hasil Deteksi WSSV Dengan Real Time PCR

Pengenceran Standar Kurva

Konsentrasi WSSV

CT

(S

iklu

s ke

-)

Konsentrasi WSSV

CT

(S

iklu

s ke

-)

Kurva standar sampel asal tambak Pasekan memiliki nilai slope -4,45724, nilai

efisiensi 67,63% dan nilai R2 mencapai 0.99398.

Adapun persamaan garis dari kurva standar yaitu y = -4.457x + 39.629 dengan y adalah nilai Ct dan x adalah log konsentrasi virus yang

diuji.

y = -4.457x + 39.629

Kurva standar sampel sampel asal tambak

Karangsong memiliki nilai slope -4.64589, nilai

efisiensi 64,15% dan nilai R2 mencapai 0.99941.

Persamaan garis dari kurva standar yaitu y = -4.646x +

43.805 dengan y adalah nilai Ct dan x adalah log

konsentrasi virus yang diuji.

Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Pasekan

Keterangan :6 Sampel positif WSSV1 Sampel negatif WSSV

Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Karangsong

Keterangan :6 Sampel positif WSSV1 Sampel negatif WSSV

PERBANDINGAN HASIL DETEKSI PCR KONVENSIONAL DAN REAL TIME PCR

Keterangan :12 Sampel positif WSSV (terinfeksi WSSV)2 Sampel negatif WSSV (tidak terinfeksi WSSV

No. Kode Sampel Spesies PCR Konvensional* Real Time

PCR Nilai CtJumlah Kopi

WSSV

1. Kontrol + Std wssv 2 x 105 16.20 180,335.52. Kontrol + Std wssv 2 x 104 20.06 24,599.63. Kontrol + Std wssv 2 x 103 25.12 1,803.44. A1 Pachygrapsus marmoratus Positif Positif 29.84 157.05. A2 Pachygrapsus marmoratus Positif Positif 30.86 92.56. A3 Pachygrapsus marmoratus Positif Positif 31.68 60.87. A4 Pachygrapsus marmoratus Negatif Positif 30.92 89.98. B1 Scylla serrata Positif Positif 30.19 131.29. B2 Scylla serrata Positif Positif 31.67 61.010. C1 Helice tridens Negatif Negatif - -11. D1 Helice tridens Negatif Positif 37.39 24.112. D2 Helice tridens Negatif Negatif - -13. D3 Helice tridens Negatif Positif 37.83 19.314. D4 Helice tridens Negatif Positif 37.78 19.815. D5 Uca minax Negatif Positif 37.19 26.516. D6 Ocypode quadrata Positif Positif 36.67 34.317. D7 Uca minax Positif Positif 35.03 77.6

KESIMPULAN DAN SARANKESIMPULANBerdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat ditarik kesimpulan sebagai

berikut :1. Real Time PCR lebih mampu mendeteksi keberadaan WSSV pada kepiting

tanpa gejala klinis dibandingkan dengan PCR konvensional. 2. Kepiting yang berpotensi sebagai carrier WSSV diantaranya adalah

Pachygrapsus marmoratus, Scylla serrata, Helice tridens, Ocypode quadrata, dan Uca minax.

3. Deteksi dengan PCR konvensional tujuh sampel kepiting positif WSSV pada ukuran fragmen 76 bp, terdiri dari 3 sampel Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan Pasekan, sedangkan sampel Ocypode quadrata dan Uca minax asal Karangsong, Kecamatan Indramayu.

4. Deteksi dengan real time PCR menunjukkan 12 sampel positif WSSV yang ditandai dengan adanya akumulasi pada signal fluoresen. Dua belas sampel positif terdiri dari 4 sampel Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan Pasekan, 3 sampel Helice tridens, 1 sampel Ocypode quadrata dan 2 sampel Uca minax asal Karangsong, Kecamatan Indramayu.

SARANBerdasarkan kesimpulan diatas, saran yang dapat diberikan yaitu dianjurkan penggunaan real time PCR untuk deteksi WSSV yang tidak menunjukkan gejala klinis, serta perlu adanya penelitian lanjutan mengenai deteksi WSSV pada jenis kepiting lain.

TERIMA KASIH

aplikasi polymerase chain reaction pcr konvensional dan real time pcr untuk deteksi white spot...

Documents