deteksi akut hiv

Deteksi akut HIV-1 Infeksi oleh RT-LAMP

Donna L. Rudolph

☯

, Vickie Sullivan

☯

, S. MicheleOwen

☯

, Kelly A. Curtis *

☯

Laboratorium Cabang, Divisi HIV / AIDSPrevention, Pusat Nasional untuk HIV / AIDS, Hepatitis, STD, dan TB

Pencegahan, Pusat DiseaseControl dan Pencegahan, Atlanta, GA, Amerika Serikat

Penulis ☯These kontribusi sama untuk pekerjaan ini.

*[email protected]

Abstrak

A, tes hemat biaya cepat diagnostik untuk deteksi akut infeksi HIV-1 sangat de-bapak. Teknik amplifikasi isotermal, seperti reverse-transkripsi loop-dimediasi iso-termal amplifikasi (RT-LAMP), karakteristik pameran yang ideal untuk pengembangan

tes amplifikasi asam nukleat yang cepat (NAAT) karena mereka cepat, mudah untuk melakukan

dan tidak memerlukan kompleks, peralatan khusus dan ruang laboratorium. Dalam studi ini, kami

menilai kemampuan uji HIV-1 RT-LAMP untuk mendeteksi infeksi HIV akut dibandingkan

untuk tes antibodi cepat perwakilan dan beberapa tes laboratorium berbasis disetujui FDA.

HIV-1 RT-LAMP assay terdeteksi individu seroconverting satu sampai tiga minggu sebelumnya

dari tes antibodi HIV yang cepat dan hingga dua minggu lebih awal dari sebuah laboratorium berbasis antigen / anti-tubuh (Ag / Ab) enzim combo immunoassay (EIA). RT-LAMPwas tidak sensitif seperti alat tes RNA kualitatif berbasis laboratorium, yang bisa dikaitkan dengan nukleat secara signifikan lebih kecil

Volume masukan asam. Untuk pengetahuan kita, ini adalah demonstrasi pertama mendeteksi HIV akut

Infeksi menggunakan uji RT-LAMP. Ketersediaan NAAT cepat, seperti HIV-1 RT-LAMP assay, pada titik perawatan (POC) atau di laboratorium yang tidak memiliki akses ke besar

Platform NAAT bisa meningkatkan persentase orang yang menerima status infec-tion HIV akut atau konfirmasi status HIV mereka, sementara segera menghubungkan mereka dengan konseling

perawatan andmedical. Selain itu, pengetahuan awal status HIV dapat menyebabkan penurunan risiko tinggi

perilaku pada saat orang berada pada risiko yang lebih tinggi untuk transmisi virus.

Pengantar

Tes diagnostik rutin sangat penting untuk deteksi dini dan pengobatan infeksi HIV.

Karena individu berada pada risiko tinggi untuk transmisi virus selama infeksi awal atau akut,

diagnosis yang akurat dan tepat waktu dapat mengurangi transmisi HIVwhen individu yang paling

menular [1]. Deteksi dini HIV telah terbukti menyebabkan berkurangnya perilaku berisiko tinggi

dan untuk menghubungkan individu untuk pengobatan lebih dini, yang dapat mengurangi risiko penularan virus

[2, 3]. Pada tahun 2006, sebuah MMWR diterbitkan yang menganjurkan pengujian rutin, sukarela dewasa,

remaja, dan wanita hamil yang berusia 13-64 tahun di fasilitas pelayanan kesehatan sebagai praktek normal

[2]. Meskipun saat ini ada sejumlah besar tes diagnostik HIV disetujui FDA dengan

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0126609 20 Mei 2015 1/13

a11111

AKSES TERBUKA

Citation: Rudolph DL, Sullivan V, Owen SM, Curtis

KA (2015) Deteksi akut HIV-1 Infeksi oleh RT-LAMP. PLoS ONE 10 (5): e0126609. doi: 10.1371 /

journal.pone.0126609

Akademik Editor: Cecilio López-Galindez, Centro

Nacional de Mikrobiologi - Instituto de Salud Carlos

III, SPANYOL

Diterima: 26 Januari 2015

Diterima: April 6, 2015

Diterbitkan: 20 Mei 2015

Hak Cipta: Ini adalah sebuah artikel akses terbuka, bebas dari semua

hak cipta, dan dapat secara bebas direproduksi, didistribusikan,

ditransmisikan, dimodifikasi, dibangun di atas, atau digunakan

oleh siapa saja untuk tujuan yang sah. Karya ini dibuat

tersedia di bawah theCreative Commons CC0public

dedikasi domain.

Data Ketersediaan Pernyataan: Semua data yang relevan

dalam kertas.

Pendanaan: Para penulis tidak memiliki dukungan atau pendanaan untuk

laporan.

Bersaing Minat: Temuan dan kesimpulan

dalam laporan ini adalah dari penulis dan tidak

tentu mewakili pandangan dari Pusat

Pengendalian dan Pencegahan Penyakit.

sensitivitas tinggi dan spesifitas yang tersedia, masih ada 1,1 juta orang di Amerika Serikat hidup

dengan HIV pada akhir 2011, yang, 15,8% tetap tidak terdiagnosis atau tidak menyadari mereka

status infeksi [4]. Point-of-perawatan (POC) pengujian telah meningkatkan jumlah orang yang

disaring untuk HIV dan menerima hasil tes HIV mereka [5]. Di AS, contoh POC set-tings mungkin termasuk, namun tidak terbatas pada, klinik, unit pengujian mobile, penjara, dan

ruang gawat darurat

Untuk pengaturan laboratorium, algoritma tes HIV direvisi telah diterbitkan untuk meningkatkan

pada deteksi akurat akut infeksi HIV-1, serta HIV-2 [6]. Dalam algoritma ini,

spesimen disaring dengan sensitif HIV-1/2 immunoassay, sebaiknya generasi keempat

antigen assay / antibodi, diikuti oleh HIV-1/2 diferensiasi assay. Spesimen yang non-reaktif dianggap negatif. Spesimen yang memiliki reaktivitas sesuai pada pemutaran

dan uji tambahan yang dianggap positif HIV-1/2 antibodi; Namun, dalam kasus

hasil immunoassay sumbang, HIV-1 nukleat pengujian amplifikasi asam (NAAT) adalah recom-diperbaiki. NAAT sangat sensitif, virus tertentu, dan memungkinkan untuk mendeteksi infeksi approxi-kira dua minggu sebelumnya thanmost tes antibodi berbasis [5, 6].

Sampai saat ini, tidak ada pedoman yang pasti untuk tes HIV di POC tersebut. Tes cepat memiliki tes HIV facil-itated di POC karena mereka dapat diselesaikan dalam waktu singkat (khas-ly kurang dari 30 menit) dan memerlukan keahlian teknis minimal. Saat ini, ada nomor

tes antibodi cepat tersedia yang disetujui FDA; Namun, mereka tidak sensitif untuk

deteksi infeksi HIV awal yang paling tes berbasis laboratorium dan akan tetap pasca-infeksi periode dur-ing negatif, tapi pra-serokonversi [7]. Ketersediaan NAAT cepat untuk

menggunakan pada POC yang dapat meningkatkan kemampuan untuk mendeteksi infeksi akut. The Aptima HIV-1 Assay

(Hologic Inc, San Diego, CA) saat ini hanya NAAT diagnostik yang disetujui FDA, namun

Penggunaannya tidak layak untuk POC karena tingginya biaya per tes, persyaratan peralatan khusus,

dan kebutuhan untuk staf teknis terlatih. Idealnya, sebuah NAAT cepat harus diselesaikan dalam waktu singkat

kerangka waktu dengan beberapa langkah sederhana, mudah untuk menafsirkan, dan tidak memerlukan atau peralatan minimal.

Selain itu, NAAT cepat harus menunjukkan tingkat tinggi sensitivitas dan spesifisitas. -Mal Isother teknik amplifikasi yang menarik untuk pengembangan NAAT cepat karena mereka

tidak memerlukan siklus termal dan, oleh karena itu, reaksi dapat dijalankan di blok panas sederhana,

air mandi, atau perangkat pemanas portabel lainnya [8]. Salah satu teknik isotermal seperti, lingkaran-dimediasi

amplifikasi isotermal (LAMP), telah dikembangkan untuk mendeteksi DNA [9] dan RNA

(Reverse-transcription, lingkaran-dimediasi amplifikasi isotermal atau RT-LAMP) [10-

Teknik LAMP memiliki beberapa karakteristik yang menarik untuk pengembangan

NAAT cepat. Amplificationmethod ini sangat spesifik karena membutuhkan enam primer yang

mengenali delapan urutan yang berbeda di wilayah target yang sama. Metode ini kurang sensitif terhadap inhibitor bi-ological dari PCR, yang memungkinkan untuk amplifikasi langsung dari sampel biologis,

seperti seluruh darah, plasma dan cairan mulut, tanpa perlu untuk ekstraksi asam nukleat [14-

18]. Bahan diperkuat dapat dideteksi dalam 15-60 menit ketika diinkubasi pada konstan

Suhu (60-65 ° C) dan deteksi visual langsung dimungkinkan karena jumlah besar

DNA yang dihasilkan dari setiap reaksi [19]. Selain itu, beberapa kelompok telah memasukkan metode deteksi fluores sen ke assay LAMP untuk real-time atau deteksi mata telanjang langsung

[17] [19-22]. Kami telah menunjukkan sebelumnya pengembangan HIV-1 RT-LAMP

assay yang menggabungkan detectionmethod-urutan tertentu dan memungkinkan untuk simultan

deteksi RNA dan DNA dalam tabung reaksi tunggal [17].

Dalam studi ini, kami mengevaluasi kemampuan HIV-1 RT-LAMP assay untuk mendeteksi HIV akut di-fection dibandingkan dengan tes antibodi yang cepat perwakilan dan beberapa tes laboratorium berbasis.

Menggunakan dua set primer ditujukan terhadap daerah sangat kekal dalam transkripsi-tase (RT) dan integrase terbalik (INT) gen dan panel serokonversi baik ditandai dari baru-baru ini

orang yang baru terinfeksi, kami menunjukkan bahwa HIV-1 RT-LAMP uji mampu mendeteksi sampel

Deteksi akut HIV-1 Infeksi


dari orang dengan infeksi akut hingga 24 hari sebelum tes antibodi perwakilan cepat.

HIV-1 RT-LAMP assay, digunakan bersamaan dengan tes antibodi yang cepat saat ini, memiliki po-bangkan untuk meningkatkan jumlah individu yang menerima hasil HIV yang akurat dan tepat waktu di

POC atau dalam pengaturan laboratorium pilih, di mana biaya dan waktu kekangan melarang penggunaan platform NAAT stan-dard.

Bahan dan metode

RT-LAMPPrimers andQuenchers

Primer HIV-1 RT-LAMP khusus untuk wilayah gen RT sebelumnya telah dijelaskan [8].

RT primer mengenali urutan target di dalam lokasi genom 2900-3118, relatif terhadap

strain referensi HXB2. Dalam penelitian ini, versi terpotong dari RT pemadam penyelidikan dengan

3 'BHQ-1 label (AAACAATGAGACACC-BHQ1) dirancang untuk ditambahkan langsung ke dalam

campuran reaksi yang bertentangan dengan menambahkan pasca-reaksi, seperti dalam penelitian sebelumnya [8, 17]. Ini menghilangkan

kebutuhan untuk membuka tabung reaksi setelah amplifikasi dan mengurangi risiko amplikon menjadi

dirilis dan mencemari lingkungan kerja. Tambahan HIV-1 primer set itu de-masuk wilayah sangat lestari dari gen INT, menggunakan software PrimerExplorer V3 berhasil-bisa di Eiken Chemical Co Ltd (Jepang) situs (http://primerexplorer.jp/e /). Wilayah A

dalam gen integrase dipilih untuk desain primer karena tingkat tinggi urutan

konservasi dalam subtipe B dan di kelompok M subtipe, seperti yang dirangkum dalam HIV Kompendium Se-quence (http://www.hiv.lanl.gov/). HIV-1 urutan HXB2 (GenBank nomor acces-sion AF033819) digunakan sebagai acuan untuk menghasilkan primer. Urutan

dari primer INT dan pemadam penyelidikan tercantum pada Tabel 1. Semua primer disintesis di-rumah dan FIP dan BIP primer yang HPLC dimurnikan.

HIV-1 DNA dan RNA Linearitas Panel

HIV-1 DNA panel linearitas dibuat menggunakan garis sel monositik manusia OM-10.1

[23], yang berisi satu terintegrasi HIV-1 provirus per sel. DNAwas diekstrak menggunakan

QIAamp DNA Darah Mini kit (Qiagen, Valencia, CA), seperti yang dijelaskan sebelumnya [17]. Panel A

dibuat mulai dari 10

5

untuk 10

2

salinan / ml menggunakan serial, sepuluh kali lipat pengenceran di diethylpyrocar-Bonate (DEPC) air -treated (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sebuah kontrol DNA negatif Wegener-diciptakan dengan mengekstraksi sel mononuklear darah DNA fromperipheral (PBMC) terinfeksi dengan

HIV-2 isolat, NIH-Z (Advanced Biotechnologies, Inc., Columbia, MD). Karena genetik di-hayati antara HIV-1 dan HIV-2 dan spesifisitas uji RT-LAMP, HIV-1 primer

tidak memperkuat HIV-2 target.

HIV-1 RNA linearitas panel dibuat menggunakan supernatan dari sel 8E5 (ATCC,

Manassas, VA), yang mengandung genom provirus cacat tunggal HIV-1 per sel, tapi masih

Tabel 1. INT Primer andQuencher Probe Urutan.

Primer Nama HXB2 Lokasi Urutan (5 '! 3')

F3 4901-4920 GGTTTATTACAGGGACAGCA

B3 5070-5087 ATCCTGTCTACTTGCCAC

LoopF 4943-4962 CTTTCCAGAGAAGCTTTGCT

LoopB-HEX 5021-5042 HEX-AGCAAAGATCATTAGGGATTAT

FIP 4963-4986, 4923-4942 CTTGTATTACTACTGCCCCTTCACGATCCACTTTGGAAAGGACC

BIP 4994-5018, 5051-5069 TGACATAAAAGTAGTGCCAAGAAGATTTTACAATCATCACCTGCCATC

LoopB-Q 5021-5034 TAATGATCTTTGCT-BHQ1

doi: 10.1371 / journal.pone.0126609.t001



mengungkapkan virus dalam supernatan. Viral load dari supernatan sel ditentukan dengan menggunakan

Roche COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan HIV-1 Tes V2.0 (Roche Diagnostics, India-Napolis, IN) dan supernatan berduri menjadi HIV-1 seronegatif plasma manusia. Serial di-lutions dibuat dalam plasma untuk membuat panel yang berkisar dari 10

6

untuk 10

3

Salinan RNA / ml.

RNAwas diekstrak dari panel menggunakan Kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN, Valencia,

CA). Kontrol positif dan negatif termasuk RNA diekstraksi dari HIV-1 BaL dimurnikan virus

dan HIV-2 NIH-Z virus dimurnikan (Advanced Biotechnologies Inc, Columbia, MD), masing-ly. Aliquot dari kedua panel linearitas dibuat dan disimpan pada -80 ° C sampai digunakan.

HIV-1 Serokonversi Panel

Spesimen plasma Serial dikumpulkan dari 12 donor AS yang menjadi-HIV 1 terinfeksi selama

periode koleksi. Panel serokonversi diperoleh dari SeraCare Biologi

(N = 7) (Gaithersburg, MD) dan ZeptoMetrix Corp (n = 5) (Buffalo, NY) [24, 25]. Multi-spot HIV-1 / HIV-2 Rapid Test (Bio-Rad, Redmond, CA), GS HIV-1 Western blot (Bio-Rad),

generasi ketiga GS HIV-1 / HIV-2 Ditambah O EIA (Bio-Rad), generasi keempat GS HIVCombo

Ag / Ab EIA (Bio-Rad), dan APTIMA HIV-1 kualitatif Assay (Hologic Inc, San Diego, CA)

hasil tes dibandingkan dengan hasil dari uji RT-LAMP. Hasil tes ini rep-benci sebagai cepat Ab, WB, Ab EIA, Ag + Ab EIA dan RNA kualitatif, masing-masing. Untuk panel Ser-Acare, semua hasil tes HIV yang disediakan oleh produsen, dengan pengecualian dari

Multispot dan APTIMA, yang dilakukan di rumah sesuai dengan sisipan paket.

Viral load yang disediakan oleh produsen dan ditentukan menggunakan COBAS Ampli-Prep / COBAS TaqMan HIV-1 Tes V2.0 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), kecuali untuk

panel PRB970 dan PRB946, yang ditentukan oleh COBAS AmpliPrep / COBAS Taq-Man HIV-1 Tes V1.0 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) dan Amplicor HIV-1Monitor

Test (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), masing-masing. Batas bawah deteksi

COBAS TaqMan HIV-1 Tes V2.0, V1.0, dan Amplicor HIV-1 monitor Test adalah 20, 40, dan 50

salinan / mL, masing-masing. Untuk panel Zeptometrix, semua tes HIV dilakukan di rumah

menurut sisipan paket. The viral load untuk masing-masing sampel ditentukan oleh

COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan HIV-1 Tes V2.0. Untuk pengujian RT-LAMP, RNAwas mantan tracted dari panel menggunakan QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA).

RT-LAMPReaction

RT-LAMP reaksi dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya, dengan beberapa modifikasi [17].

Secara singkat, reactionmix RT-LAMP (25μL total volume) yang terdapat konsentrasi akhir

0.2μM setiap F3 dan primer B3, 1.6μM setiap FIP dan BIP primer (baik HPLC dimurnikan,

seperti yang direkomendasikan [26]), 0.8μM setiap LoopF dan LoopB primer (label 5 'HEX ditambahkan ke

LoopF untuk RT dan LoopB untuk INT), 0.8M Betaine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 8 mM

MgSO4, 1,4 mM dNTP (Roche Terapan Ilmu, Indianapolis, IN), 1X isotermal Amplifica-tion Buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA), 16UBst2.0 WarmStart DNA Polymerase

(New England Biolabs) dan 2U AMV reverse transcriptase (Life Technologies, Carlsbad,

CA). Penambahan enzim reverse transcriptase memungkinkan amplifikasi DNA dan

RNA secara bersamaan dalam tabung reaksi yang sama. Selain itu, 3 'BHQ1-label pemadam penyelidikan

ditambahkan ke dalam reaksi pada konsentrasi akhir 0.8μM. Untuk campuran reaksi, 10μL

dari diekstraksi DNA atau RNAwas menambahkan. Campuran reaksi dipanaskan pada suhu 60 ° C selama 60 menit,

menggunakan PCR Sistem GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA), kemudian diadakan pada 80 ° C

selama 2 menit untuk mengakhiri reaksi. Untuk tujuan evaluasi saat ini, masing-masing spesifik-orang diuji dalam rangkap dengan setiap set primer. Selain kontrol positif dan negatif,

reagen (tidak ada template) pengendalian termasuk dalam setiap menjalankan untuk memeriksa kontaminasi reagen.

Kehadiran produk diperkuat ditentukan secara visual dengan mengamati fluoresensi dalam tabung re-tindakan menggunakan lampu UV dari XR GelDoc + Imaging System (BioRad Laboratories,

Hercules, CA).

Hasil

-1 HIV INTRT-LAMP Sensitivitas

Sensitivitas dari HIV-1 RT-LAMP uji menggunakan primer RT sebelumnya telah de-jelaskan [8]. Sensitivitas tes untuk kedua DNA dan RNA menggunakan primer INT adalah

mirip dengan sensitivitas dilaporkan untuk primer RT. Sebuah amplifikasi percobaan perwakilan demonstrat-ing HIV-1 DNA dan RNA panel linearitas ditunjukkan inFig 1. Batas de-proteksi untuk DNAwas 10

2

salinan / mL dan 10

5

-10

4

Salinan RNA / mL, tergantung pada

eksperimen. Tidak ada amplifikasi diamati dalam kontrol negatif atau tabung kontrol reagen.

Evaluasi RT-LAMP Assay dengan akut HIV-1 Clinical Sampel

Untuk mengetahui kemampuan uji RT-LAMP untuk mendeteksi sampel dari akut infeksi HIV-1,

panel serokonversi diuji. Untuk sampel SeraCare (n = 7), hanya salah satu panel akan datang-reaktif selama periode pengumpulan sampel dengan uji Ab cepat. Sampel tertentu

menjadi cepat Ab reaktif 14 hari setelah pertama viral load terdeteksi dan kualitatif pertama

RNA positif (Tabel 2). Sebaliknya, semua panel SeraCare yang reaktif dengan HIV-1

RT-LAMP assay antara 0 dan 2 hari (median = 0) setelah yang pertama viral load terdeteksi dan

RNA kualitatif positif. Bagi kebanyakan panel, baik RT dan INT primer terdeteksi sampel

dari titik waktu yang sama; Namun, pada kasus tertentu, satu set primer terdeteksi sampel sebelum

yang lain. Berdasarkan data viral load dari panel, RT primer set terdeteksi semua

Sampel SeraCare di kisaran sensitivitas diharapkan dari pengujian tersebut (> 10

4

Salinan RNA / mL) dan

INT primer set terdeteksi 6 dari 7 panel di kisaran sensitivitas yang diharapkan. Dalam com-parison untuk tes berbasis laboratorium, uji RT-LAMP terdeteksi anggota di semua panel seroconver-sion sebelum Ab EIA, dan 0-7 hari (rata-rata = 3,5) sebelum Ag + Ab EIA. Tak satupun

serokonversi anggota panel becameWB positif selama periode pengumpulan sampel.

Untuk panel ZeptoMetrix (n = 5), tes Ab cepat terdeteksi anggota panel 7-29 hari

(Median = 19) posting pertama viral load terdeteksi dan RNA kualitatif pertama positif (Tabel 3). Di

Sebaliknya, uji RT-LAMP terdeteksi anggota panel dalam 0-5 hari (median = 5) pasca

pertama viral load terdeteksi dan RNA kualitatif positif, yang 7-24 hari (rata-rata = 15)

awal dari tes Ab cepat. Secara keseluruhan, reaktivitas yang sama diamati antara RT dan

INT primer untuk RT-LAMP dengan panel ini. Dibandingkan dengan tes berbasis laboratorium,

RT-LAMP assay terdeteksi anggota panel mana saja dari 2 sampai 14 hari (median = 9) sebelum

Ab EIA dan 0-14 hari (rata-rata = 2) sebelum Ag + Ab EIA. RT-LAMP assay adalah

mampu mendeteksi sampel 9-29 hari (rata-rata = 22) sebelum theWB assay. Secara keseluruhan, RT-LAMP

uji terdeteksi semua anggota panel Zeptometrix dalam sensitivitas viral load diharapkan kami

Kisaran (? 10

4

Salinan RNA / mL). Ringkasan hasil HIV-1 tes untuk panel ini, di rela-tion ke cepat hasil tes reaktif Ab pertama ditunjukkan inFig 2. SeraCare panel tidak di-disertakan dalam timeline karena waktu tindak lanjut pendek dan fakta bahwa hanya satu subjek

menjadi cepat tes Ab reaktif selama periode pengumpulan sampel.

diskusi

Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk menunjukkan kegunaan uji HIV-1 RT-LAMP untuk

deteksi akut infeksi HIV-1. Untuk pengetahuan kita, ini adalah demonstrasi pertama akut

Deteksi infeksi HIV dengan menggunakan uji RT-LAMP. Dalam studi sebelumnya, kami menunjukkan

kegunaan dari HIV-1 RT-LAMP assay untuk mendeteksi DNA dan RNA dalam satu reaksi yang-tion [16, 17]. Dalam penelitian ini, fokus utama adalah deteksi RNA, karena plasma tinggi

viral load merupakan ciri khas dari infeksi akut; Namun, DNA provirus juga dapat dideteksi di

Seluruh darah. Untuk mengaktifkan visualisasi mata telanjang langsung dari produk diperkuat, metode deteksi fluorescent se-quence khusus dikembangkan untuk uji HIV-1 RT-LAMP

[17]. Kami lebih memodifikasi metode deteksi dengan menambahkan probe pemadam langsung ke

reaksi, yang menghilangkan kebutuhan untuk membuka tabung reaksi pasca-amplifikasi. Besar

jumlah amplikon yang dihasilkan selama proses LAMP dan mengurangi risiko melepaskan

amplikon tersebut ke dalam lingkungan pengujian sangat penting untuk pengaturan non-laboratorium. Untuk POC

digunakan, hal ini menguntungkan untuk dapat menilai positif sampel segera pasca-amplifikasi,

tanpa langkah-langkah tambahan.

Perbaikan pengujian lebih lanjut termasuk desain set primer baru yang mengakui wilayah-con disajikan dalam urutan integrase HIV-1. Meskipun kinerja assay untuk RT

dan INT primer set ditunjukkan secara terpisah untuk tujuan perbandingan, set primer

dapat dikombinasikan dalam multiplex reaksi RT-LAMP tanpa mengubah sensitivitas reaksi yang-tion [16]. The APTIMA HIV-1 kualitatif Assay dan COBAS AmpliPrep / COBAS Taq-Man HIV-1 Tes V2.0 telah baik menunjukkan bahwa deteksi isolat klinis mungkin

difasilitasi dengan menargetkan dua terpisah, daerah dilestarikan dalam genom HIV karena

keragaman urutan HIV-1 [27, 28]. Selain itu, pendekatan multiplexing mungkin bermanfaat

untuk menghindari ketidaksesuaian potensial karena mutasi resistansi yang disebabkan oleh penggunaan antiretroviral.

Untuk penggunaan POC, uji RT-LAMP dapat dilakukan dengan menggunakan teknologi rendah, alat pemanas portabel,

Gambar 2. Ringkasan HIV-1 angka Uji Results.The menunjukkan waktu tes positif dalam kaitannya dengan tes antibodi cepat (Day 0) untuk kohort Zeptometrix.

Setiap segmen ditumpuk grafik batang merupakan subjek individu.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126609.g002



seperti ESEQuant Tabung Scanner (Qiagen, Valencia, CA) [29] atau non-diinstrumentasi nukleat

Asam (NINA) pemanas [8]. Kinerja yang sama antara perangkat ini dan termal tradisional

cyclers telah ditunjukkan untuk HIV-1 RT-LAMP assay [8]. Dalam penelitian ini, Howev-er, sebuah pengendara sepeda termal digunakan sebagai masalah kenyamanan untuk pengujian skala besar.

Karena penggunaan dominan tes cepat dalam pengaturan non-laboratorium, perwakilan

rapid test digunakan sebagai dasar utama untuk dibandingkan dengan uji RT-LAMP. Antibodi berbasis Multispot HIV-1 / HIV-2 Rapid Test dipilih untuk perbandingan, mengingat bahwa itu adalah saat-ly digunakan sebagai uji tambahan dalam algoritma pengujian laboratorium. Perlu dicatat, Howev-er, bahwa Multispot saat ini tidak Klinis Perubahan Peningkatan Laboratorium (CLIA) -waived untuk digunakan di POC tersebut. Dalam seroconverting individu, kami menunjukkan deteksi dini

(1-3 minggu) dengan uji RT-LAMP dibandingkan dengan Multispot HIV-1 / HIV-2 Rapid Test.

Karena RNA virus terdeteksi dalam plasma hingga 4 minggu sebelum antibodi, tergantung pada

tes khusus [30], hasil ini tidak terduga. Selain itu, penelitian telah menunjukkan

bahwa Multispot dan tes cepat lainnya yang disetujui FDA menunjukkan kelemahan signifikan dalam Meskipun LAMPmethod yang menarik untuk pengembangan POCNAAT cepat,

HIV-1 RT-LAMP assay juga dapat berguna dalam pengaturan laboratorium pilih, karena lebih cepat

perputaran waktu dan biaya yang lebih rendah dibandingkan dengan saat ini platform NAAT laboratorium. The-HIV 1

RT-LAMP assay diperkirakan biaya 15-40X kurang per tes dibandingkan dengan APTIMA, tergantung pada

biaya laboratorium individu untuk membeli kit APTIMA. Sehubungan dengan viral load untuk

setiap anggota panel serokonversi, RT-LAMP dipamerkan batas yang diharapkan deteksi untuk

uji, yang kira-kira 10

4

Salinan RNA / mL. Selain itu, RT-LAMP memiliki sedikit atau

tidak ada keterlambatan dalam waktu untuk deteksi dibandingkan dengan saat ini disetujui FDA NAAT di individu serocon-verting. The viral load dari semua orang yang baru terinfeksi termasuk dalam studi ini melampaui

batas deteksi untuk pengujian tak lama posting pertama hasil tes RNA-positif. Demikian juga, puncak viral

beban selama infeksi HIV akut diperkirakan> 100.000 eksemplar RNA / mL [33].

Saat ini, generasi keempat adalah yang paling sensitif dari immunoassay laboratorium plat-bentuk, karena mendeteksi anti-HIV-1 IgG dan IgM antibodi dan HIV-1 antigen p24. Cepat

tes generasi keempat, seperti Tentukan HIV-1/2 Ag / Ab Combo (Alere, Orlando, FL)

[24, 34, 35], akan cenderung segera CLIA-dibebaskan untuk digunakan di POC, tetapi data menunjukkan bahwa tidak

sensitif untuk mendeteksi infeksi akut sebagai platform laboratorium [24, 36-43]. Meskipun p24

antigen menyempit jendela dari infeksi deteksi, asam nukleat tetap awal de-tectable biomarker untuk infeksi HIV [44]. Untuk mendukung ini, uji RT-LAMP terdeteksi di-fection hingga dua minggu lebih awal dari GS HIVCombo Ag / Ab EIA.

Salah satu kelemahan dari uji RT-LAMP adalah bahwa format saat ini tidak sensitif seperti

yang APTIMA HIV-1 RNA kualitatif Assay, satu-satunya NAAT disetujui FDA untuk HIV-1 diag-nosis. Dalam penelitian ini, para APTIMA mendeteksi infeksi hingga lima hari lebih awal dari

RT-LAMP assay. Hal ini tidak mengherankan mengingat perbedaan besar dalam masukan volume sampel menjadi-tween dua tes. Ketika mempertimbangkan proses ekstraksi yang terjadi sebelum

menambahkan sampel untuk reaksi, uji RT-LAMP digunakan hanya 7% dari volume sampel ulang quired untuk APTIMA. Telah menunjukkan bahwa sensitivitas uji RT-LAMP dapat

ditingkatkan dengan meningkatkan volume keseluruhan reaksi [16]. Selain itu, asam nukleat HIV bisa

terkonsentrasi langsung dari spesimen klinis melalui membran capture / konsentrasi

metode [18, 45].mendeteksi-ing infeksi awal HIV [31, 32].

Idealnya, uji HIV-1 RT-LAMP akan digunakan dengan seluruh darah yang diperoleh dari jari

tongkat. Dalam studi saat ini, kami menunjukkan kinerja uji dengan sampel plasma, mengingat

kesulitan dalam memperoleh baik ditandai, memanjang sampel darah seluruh dari baru-baru ini

baru terinfeksi. Atau, panel serokonversi komersial dengan yang sudah ada sebelumnya tes HIV

Data yang tersedia dan dapat digunakan untuk menilai waktu tes positif relatif terhadap masing-masing



lainnya. Hal ini tidak diantisipasi bahwa hasil uji akan berbeda secara signifikan dengan darah utuh, karena

kinerja HIV-1 RT-LAMP assay telah dibuktikan dalam studi sebelumnya [8].

Penelitian yang sedang berlangsung melibatkan evaluasi tunggal digunakan, alat pemanas pakai dengan reagen RT-LAMP lyophi-lized untuk mendeteksi HIV dari spesimen darah utuh. Lain limita-tion dari penelitian ini adalah bahwa tes itu khusus dirancang untuk mendeteksi subtipe BHIV

infeksi, karena fokus utama dari laboratorium kami adalah deteksi HIV di AS. Untuk dunia

menggunakan, kelompok M-dilestarikan uji RT-LAMP lebih disukai. Evaluasi paralel dari RT-LAMP assay subtipe-con dilayani sedang dilakukan di laboratorium kami.

Singkatnya, ketersediaan NAAT cepat, seperti uji HIV-1 RT-LAMP, bisa

meningkatkan diagnosis orang dengan infeksi akut yang mungkin akan terjawab oleh skr-sewa tes antibodi yang cepat. HIV-1 RT-LAMP assay memiliki potensi untuk dilaksanakan di

POC, sebagai tes tambahan atau konfirmasi, di mana pengujian NAAT saat ini tidak layak

karena keterbatasan biaya dan waktu.

Ucapan Terima Kasih

Para penulis ingin mengucapkan terima kasih Silvina Masciotra untuk menyediakan hasil tes untuk

Zeptometrix panel.

Penulis Kontribusi

Disusun dan dirancang percobaan: KCDR SMO. Melakukan percobaan: DR VS.

Menganalisis data: KCDR. Kontribusi reagen / bahan / alat analisis: KC SMO DR VS.

Menulis kertas: DR KC.

deteksi akut hiv

Documents