Uji Silang Serasi( Crossmatch )Dr JUNAEDI WIBAWA MSi Med SpPK

Uji Silang Serasi

Merupakan suatu seri pemeriksaan yang dilakukan pretransfusi untuk menjamin kecocokan darah yang akan ditransfusikan bagi resipien dan mendeteksi kemungkinan adanya Ab yang tidak diharapkan dalam serum resipien yang dapat mengurangi umur hidup atau menghancurkan eritrosit donor

Tujuan

1.Mencegah terjadinya reaksi transfusi2.Memberi keyakinan akan manfaat transfusi yang maksimal untuk penderita ( Menaikkan kesempatan hidup sel darah donor dalam tubuh pasien )

Macam Uji Silang Serasi

1.Mayor Crossmatch -Sel darah donor dicampur dengan serum resipien -Bila dalam serum resipien terdapat Ab terhadap sel donor maka terjadi destruksi sel donor

2.Minor Crossmatch -Serum donor dicampur dengan sel darah resipien -Bila dalam serum donor terdapat Ab terhadap sel resipien, maka terjadi destruksi sel resipien

APLIKASI KLINIS UJI SILANG SERASI

Mendeteksi ada tidaknya antibodi , baik antibodi komplet (IgM) maupun antibodi inkomplet (IgG) yang terdapat dalam serum / plasma pasien maupun dalam plasma donor yang mempunyai arti klinis yang dapat menyebabkan kerusakan sel darah merah Memastikan bahwa transfusi darah yang diberikan sesuai /kompatibel dan tidak menimbulkan reaksi apapun pada pasien serta sel-sel darah dapat mencapai masa hidup maksimum setelah diberikan Cek akhir uji kecocokan golongan darah ABO

Catatan

-Tes ini tidak akan menemukan kesalahan pada Rh typing Misalnya : Jika darah donor Rh + tapi salah diperiksa sebagai Rh maka bila diadakan Crossmatch dengan darah resipien yang Rh akan menghasilkan tes yang cocok (compatible), kecuali bila dalam serum resipien terdapat anti-Rh

-Sedangkan penggolongan ABO yang salah dari penderita atau donor biasanya akan menghasilkan crossmatch yang tidak cocok (incompatible)

METODE

-KONVENSIONAL ( Tube Test )-Gel Test

PRINSIP DASAR UJI SILANG SERASIREAKSI ANTIGEN ANTIBODIDILAKUKAN DALAM FASE DAN MEDIUM BERBEDA . MENGAPA ?

MENGAPA DILAKUKAN PADA FASE /MEDIUM YANG BERBEDA?Reaksi antigen antibodi yang dilakukan pada fase dan medium yang berbeda karena jenis2 antibodi golongan darah mempunyai karakter yang berbedaAntibodi seperti anti M,N,P, Lua ,Lub bereaksi baik dalam medium saline di suhu kamar, tapi kurang baik reaksinya dalam medium albuminAntibodi sistim Rhesus bereaksi baik dalam medium albumin tetapi tidak dalam medium saline( kecuali anti E)Anti Kell, Duffy, Kidd baru tampak reaksinya dengan antiglobulin

HUBUNGAN ANTARA SUHU & MEDIUM UNTUK DETEKSI ANTIBODI SPESIFIK PADA TES COMPATIBILITASTAB IAlbuminTab IISaline

A1MP1I-HLeaD-E-eD-E-cLea-LebD-E-cKFyaJkaSLea-LebA1MP1I-HLeaELeaD-E-cKFyaJkaSLea-Leb

SEBELUM MELAKUKAN UJI SILANG SERASILakukan tes validasi reagensia / alat:Anti serum AAnti Serum BAnti DCoombs serumBovine Albumin 22 %

Uji Silang SerasiHarus dilakukan 3 fase, mayor, minor dan autoUntuk permintaan lebih dari satu kantong, tidak boleh dilakukan metoda pooling, baik pada uji cocok serasi mayor maupun minor.Ada instruksi kerja / SOP , lembar kerja/lembar pemeriksaanHasil terdokumentasi dengan baik

BAHAN PEMERIKSAANCONTOH DARAH PASIEN : darah tanpa anti koagulan / darah dengan antikoagulan yang berumur kurang dari 48 jamCONTOH DARAH DONOR : darah dalam antikoagulan yang diambil dari slang kantong darahREAGENSIA : Saline / NaCl 0,9 % Bovine Albumin 22 % Coombs serum Coombs Control Cell ( CCC)

PERALATANTabung gelas ukuran 12 X 75 mmInkubator ( waterbath ) 37CSerofugeObjekglassMikroskop

BOVINE ALBUMIN 22 %

menurunkan zeta potensialmenyebabkan sel yang coated dengan antibodi berdekatan satu sama lain

ZETA POTENSIAL(BOVINE ALBUMIN 22 % MENURUNKAN ZETAPOTENSIAL )

PERSIAPAN UJI SILANG SERASISERUM RESIPIEN : jernih bebas dari SDM SUSPENSI S.D.M. RESIPIEN 3-5% DALAM SALINE , setelah sel dicuciPLASMA DONOR yang jernih bebas dari sel2 darahSUSPENSI S.D.M. DONOR 3-5% DALAM SALINE , setelah sel dicuci

TEKNIK UJI SILANG SERASIFASE I ( FASE SUHU KAMAR )2 tts serum pasien2 tts plasma donor1 tts sel donor susp 5 %1 tts sel pasien susp 5 %I ( MAYOR )II ( MINOR )KOCOK-KOCOKCENTRIFUGASI 3000 rpm/15 atau 1000 rpm/ 1 menitBACA REAKSI ---Hemolisis / agglutinasi . Bila tidak ada reaksi--- lanjut fase IITABUNG I & IIIII AC2 tts serum pasien

TEKNIK UJI SILANG SERASIFASE II ( FASE INKUBASI 37 C)I (MAYOR)II (MINOR)2 TTS BOVINE ALB 22 % KOCOK-KOCOK INKUBASI 37 C SELAMA 15 MENIT CENTRIFUGASI 3000 rpm / 15 atau 1000 rpm / 1 menit BACA REAKSI ------Bila tidak ada reaksi ----lanjut fase IIIIII AC

TEKNIK UJI SILANG SERASIFASE III ( FASE ANTIGLOBULIN )I (MAYOR)II (MINOR) TABUNG I& II CUCI DENGAN SALINE 3 X 2 TTS COOMBS SERUM KOCOK KOCOK CENTRIFUGASI 3000 rpm/15 atau 1000 rpm/ 1 menit Bila tidak ada reaksi , hasil kompatibelIII AC

Tambahkan 1 tetes CCC1 tetes CCCI ( MAYOR )II (MINOR)III ACPutar 3000 rpm15 Baca bila aglutinasi pemeriksaan benar

TUJUAN PENAMBAHAN ANTIHUMAN GLOBULIN ( COOMBS SERUM )1/3 dari semua antibodi yang dapat menyebabkan reaksi transfusi hanya dapat dideteksi dengan teknik antiglobulinReagen harus mampu bereaksi dgn antibodi/ komplemen yang diikat ag-ab tertentuContoh reaksi:Agglutinasi ( CM POSITIP)

AGLUTINASIIgGANTI HUMAN GLOBULIN

AGLUTINASICOMPLEMENTANTI HUMAN GLOBULIN

COOMBS CONTROL CELLS ( CCC)Sel eritrosit normal yang dibuat coated oleh suatu antibodi inkompletCCC umumnya dibuat dari sel normal golongan O Rh positip, dengan anti D inkomplet.

TUJUAN PENAMBAHAN CCCUntuk mengontrol Coombs serum apakah reagen Coombs serum masih baik /layak digunakanMenguji semua hasil pemeriksaan yang negatip, apakah hasil valid/ invalid

CCCCCCCCC

CARA MEMBUAT CCCBahan ;Sel O Rhesus positipAnti D modified ( IgG) yang sudah diketahui titernya Saline 0,9 %

CARA MEMBUAT CCCMengukur titer anti D slide testSiapkan suspensi sel O Rh pos 5 % dalam saline sesudah dicuci 3XSediakan 10 tabung untuk pengenceran anti DIsi masing2 tabung dengan 2 tetes salineIsi 2 tetes anti D kedalam tabung ke 1 yang sudah berisi saline, selanjutnya buat enceran berganda kedalam tabung2 berikutnya sampai tabung ke 10Teteskan suspensi sel O Rh pos 5% kedalam semua tabung yang sudah berisi masing2 2 tetes enceran anti -D

lanjutanKocok2 semua tabung dan inkubasi 37 C / 30 menitPutar semua tabung 3000 rpm/ 15 , baca dan catat reaksinya.Pada semua tabung yang belum tampak reaksi aglutinasi , selnya dicuci dengan saline ( 3 X )Tambahkan 2 tetes Coombs serum kepada sediment sel yang sudah dicuciKocok2 dan centrifugasi 3000 rpm / 15 Baca reaksinya

Titer Anti-D incomplet = 512Enceran Anti D modified yang bereaksi sensitasi ( Coated ) dan memberikan hasil Coombs test 2+ pada enceran 128 X

1 1 1 1 1 1 1 1 1 12 4 8 16 32 64 128 256 512 10241 2 3 4 5 6 7 8 9 1037C/30 2+ + (+) - - - - - - -Coombs Test 4+ 3+ 2+ 2+ + (+) -

lanjutanDari percobaan diatas hasil 2+ Coombs Test jatuh pada enceran 128XUntuk membuat CCC dimodifikasi : Sel susp 5 % : enceran 128 X Sel susp 10%: 64X Sel susp 20% : 32X Sel susp 40% : 16XSelanjutnya :

CONTOH1.Buatlah suspensi sel O Rhesus positip yang sudah dicuci 3 X, 40 % dalam saline2.Ambil 1 tetes anti-D, encerkan dengan saline 15 tetes (volume menjadi 16 tetes )3.Tambahkan suspensi sel O Rh positip 40 % sebanyak 8 tetes4.Inkubasi 37 C selama 30 menit (coated)5.Putar , kemudian supernatan dibuang6.Cuci selnya dengan saline ( 3X)7.Endapan sel jadikan suspensi 5% ( 40%5% , akan diperoleh 64 tetes CCC 5 % )

Suspensi sel O 40% 8 tetes1 tetes anti-D diencerkan saline 15 tts ( 16 tetes)Inkubasi 37C 30 PutarBuang SupernatantCuci sel dg Saline 3XBuat Suspensi 5%Suspensi sel5% ( 64 tts)Endapan sel

INTERPRETASI HASIL UJI SILANG SERASI Bila Mayor dan Minor fase 1 sampai fase 3 tidak menunjukkan reaksi aglutinasi dan atau hemolisis , hasil diinterpretasikan kompatibel (cocok) darah dapat keluar Bila Mayor dan Minor fase 1 sampai fase 3 menunjukkan adanya reaksi aglutinasi dan atau hemolisis , hasil diinterpretasikan inkompatibel (tidak cocok) darah tidak dapat keluar

REAKSI TRANSFUSI

A1MP1I-HLeaD-E-eD-E-cLea-LebD-E-cKFyaJkaSLea-LebD-E-cKFyaJkaSLea-LebELeaA1MP1I-HLeaTAB IAlbuminTab IISaline

Fase Suhu Kamar(20 25 C )Fase Inkubasi( 37 C)Fase Antiglobulin

ANTIBODI PADA FASE UJI SILANG SERASIFASE I : Fase suhu kamar dengan medium salineFase ini dapat mendeteksi : 1. Antibodi yang komplet ( IgM / Cold antibodi ) misalnya terdapat pada ketidak cocokan pada penetapan golongan darah ABO 2. Adanya Alloantibodi (antibodi komplet )seperti : anti M, anti Lewis, anti N, anti P1, anti A1 3. Adanya auto antibodi : anti-H, anti-I

FASE II : Fase inkubasi 37C didalam medium Bovine AlbuminFase ini dapat mendeteksi : beberapa antibodi sistim Rhesus seperti : anti D, anti E, anti c antibodi inkomplet lain :anti- K, Fya, Fyb,Jka, S, Lea, Leb Mengapa 37C ? Memberi kesempatan kepada antibodi untuk coated pada sel

FASE III : Fase antiglobulin . Pada fase ini akan terdeteksi aglutinasi antibodi inkomplet : anti D, anti E, anti C, anti Duffy, anti Kell, anti Kidd, anti S dll.

YANG PERLU DIPERHATIKANSuhu inkubasi 37 CLama inkubasi minimal 15 menit, jika waktu dikurangi maka antibodi inkomplet tidak akan coated dengan sempurna sehingga akan lepas pada waktu pencucianCara pencucian sel untuk menghilangkan sisa globulin yang bebas harus sempurna. Karena sisa glubulin yang tertinggal akan dapat menetralisir anti globulin serum ( Coombs serum )

CONTOH AHG YANG MENETRALISIR ANTIBODI BEBASNEGATIP PALSU

AGAR REAKSI SILANG TIDAK MEMBERIKAN HASIL NEGATIP PALSUSaline harus bersih, jernih, tidak berwarna, tidak terkontaminasi serumSuhu inkubator harus tepatLama inkubasi harus tepatPencucian sel darah merah harus bersihHasil negatip harus dikontrol dengan menggunakan CCC

CROSSMATCHING DENGAN METODE GEL

METODA GELDitemukan oleh Dr Yves Lapierre dari Perancis tahun 1985 3 tahun R+D di DiaMed, Switzerland Pertama kali digunakan untuk pemeriksaan rutin pada tahun 1988 di Eropa Sederhana, mudah dan cepatHasil reaksi stabil dapat disimpan / foto copyNo-washing stepSampel yang diperlukan sedikitPembacaan reaksi makroskopisMengurangi limbah

MATERIALID DispensorAutopipette 10, 25, 50 ulPipette tipsTest tubes Working tableIncubator 37CID-centrifugePen marker

ReagentsLISS/Coombs card

ID Diluent 2 (modified LISS)

Prinsip Teknologi Gel TestMaterial gel dengan SephadexAglutinasi yang berukuran besar akan berada pada permukaan gelAglutinasi yang lebih kecil ukurannya dapat lewat pori-pori gel, tergantung ukurannyaSel yang tidak beraglutinasi akan langsung mengendap di dasar

PRINSIP GEL TEST

PEMBUATAN SUSPENSI SEL 1%Ambil ID Diluent 2 : 1 mlPipet 10 ul sel donor (PRC) kedalam tabungyang berisi 1 ml ID Diluent 2Campur sel donor 1%dan ambil 50 ul masukkan kedalam microtube

25 l serum/plasma 50 l suspensi sel 1%

TEKNIK PEMIPETAN GEL TEST

Inkubasi 37C 15 menitSentrifus selama 10 menit

HASIL REAKSI METODA GEL

A 4+B 3+C 2+D 1+E Negatip

KEGUNAAN GEL TESTPenetapan golongan darah ABO/Rh Penetapan golongan darah lain Skrining dan identifikasi antibodiCrossmatching.Partial D