LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“Materi Isolasi DNA“

Nama : Muhammad Bari Muwardi

NIM : 135040201111032

Kelompok : M1

Asisten : Finsa Dwi Arisandi

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2014

BAB l

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu

gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang

tergabung membentuk nukleotida. Materi genetik yang

terdapat di dalam inti sel makhluk hidup. Materi itu

berbentuk seperti tangga. Bukan tangga yang lurus, tetapi

tangga yang berpilin. Kedua sisi tangga dihubungkan oleh

anak tangga. Pada DNA, hanya ada dua jenis anak

tangga, yaitu anak tangga yang dibentuk oleh pasangan

basa nitrogen Adenin dan Timin (A-T) dan basa Guanin-

Citosin (G-C). Molekul DNA ini terikat membentuk

kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan

kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan

nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double

helix), dimana basa nitrogen dan kedua ”benang”

polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang

tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang

satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan

ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk

hidup dan disebut sebagai ”cetak biru kehidupan” karena

molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi

hereditas yang menentukan struktur protein dan proses

metabolisme lain. DNA dapat mengalami denaturasi dan

renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi.

I.2 Tujuan

Untuk pengetahui pengertian isolasi DNA

Untuk mengetahui macam-macam metode isolasi

DNA

Untuk mengetahui tahapan-tahapan isolasi DNA

Untuk mengetahui manfaat isolasi DNA

I.3 Manfaat

Praktikum isolasi DNA dilakukan, bermanfaat untuk

mengetahui adanya DNA murni pada tumbuhan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian isolasi DNA

Isolasi DNA adalah suatu teknik dimana hasil akhirnya

strand-strand DNA dapat terpisah dari dalam sel dalam

bentuk kumpulan strand berwujud benang-benang

putih. (Aditia, 2010)

Deoxyribonucleic acid (DNA) isolasi adalah proses

ekstraksi DNA dari berbagai sumber. Sumber untuk

isolasi DNA sangat beragam. Pada dasarnya dapat

diisolasi dari organisme hidup atau mati. Sumber-

sumber umum untuk isolasi DNA meliputi seluruh

darah, rambut, sperma, tulang, kuku, jaringan, noda

darah, air liur, bukal (pipi) kapas, sel epitel, urin

(Yuwono,2006)

DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for

subsequent molecular or forensic analysis. (Isolasi

DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA

untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya)

(Doyle, 1987)

DNA isolation is the most important step in molecular

biology analysis. Several DNA isolation techniques

which are developed were expensive. (Listanto,1996)

Arti: Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam

analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA

yang telah dikembangkan sangat mahal dan

memerplukan waktu yang lama.

2.2 Macam metode Isolasi DNA

Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990)

dengan Nitrogen Cair.

a.  Metode I.

Daun temulawak sebanyak 1 gram digerus

dengan PVP dannitrogen cair hingga menjadi

tepung. Sebanyak 10 mL bufer ekstraksi hangat

dan 2.5 mL 2-merkaptoetanol ditambahkanke

dalam sampel dan diinkubasi sambil digoyang

perlahan pada suhu 55 C, kecepatan 150 rpm

selama 1 jam. Selanjutnya diekstraksi ulang

dengan kloroform:isoamil alkohol (24:1) sebanyak

10 mL. Selanjutnya, dilakukan pemisahan dengan

sentrifugasi pada kecepatan 1000 g selama 5

menit. Aliquot yang terdapat pada bagian atas

dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan

dengan isopropanol dingin sebanya 2/ volume.

Kemudian diinversi dan diinkubasi dalam es

selama 30 menit. Pelet dikoleksi dengan

sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 20

menit. Pelet dicuci dengan buffer pencucii (etanol

76% dan ammonium  asetat). Sentrifugasi

dilakukan pada kecepatan 14000 g selama 10

menit. Pencucian dilakukan sebanyak 2 kali. Pelet

yang telah dicuci selanjutnya ditambahkan dengan

bufer TE dan ditambahkan RNAse A dengan

konsentrasi final 10 ug/mL. RNAse A diaktivasi

pada suhu 37 C selama 30 menit. Selanjutnya,

dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan

12000 g selama 5 menit. Pelet yang dihasilkan

diresuspensi dengan molecular water. Proteinase

K ditambahkan dengan dua variasi penambahan.

Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990)

tanpa Nitrogen Cair.

b. Metode II.

Sampel daun sebanyak 0.2 gram dan

digerus dengan PVP dan 0.75 mL buffer ekstraksi

(2% b/v CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM

Tris-HCl (pH 8), 0.2% (v/v) 2- merkaptoetanol).

Inkubasi dilakukan dengan incubator shaker pada

suhu 65°C dengan 50 rpm selama satu jam.

Sampel kemudian dibiarkan pada suhu ruang untuk

proses cooling. Sampel ditambahkan 0.75 mL

kloroform: isoamil alkohol (24:1) dan disentrifugasi

12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC.

Supernatan berisi DNA dipindahkan ke tabung baru

dan ditambahkan dengan 2/3 volume isopropanol

dingin kemudian diinversi perlahan sebanyak 10

kali. Smapel tersebut disentrifugasi 11.000 rpm

selama 10 menit pada suhu 4oC. Pelet yang telah

kering diberi 25 μL molecular water dan disimpan

pada suhu -20°C.

Metode Ekstraksi Modifikasi Zheng et al (1995).

c. Metode III.

Sampel daun 200 mg digerus hingga halus

dan ditambahkan buffer ekstraksi (25 mM EDTA

(pH 7.5), 50 mM TrisHCl (pH 8.0), 300 mM NaCl,

dan SDS 1%) sebanyak 400 μL dalam mortar

dingin. Sampel ditambahkan 100 μL buffer

ekstraksi di dalam tabung dingin dan ditambahkan

400 μL kloroform kemudian diinversi. Sentrifugasi

dilakukan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu

4oC. Lapisan atas yang terbentuk ditambahkan 800

μL etanol absolut dan diinkubasi pada suhu -20oC

selama 1 jam. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm

selama 3 menit pada suhu 4oC. Endapan berupa

pellet DNAditambahkan 500 μL Etanol 70% dan

disentrifugasi kembali. Pellet yang telah kering

diresuspensi dengan 50 μL molecular water dan

ditambahkan RNAse serta diinkubasi pada suhu

37oC selama 30 menit. Sentrifugasi 10000 rpm

dilakukan selama 5 menit. Pellet kering

ditambahkan 50 μL molecular water. Suspensi

tersebut disimpan pada suhu -20oC.

Ketiga metode tersebut di atas dimodifikasi

untuk mendapatkan DNA genom dengan kualitas

terbaik. Modifikasi dilakukan dengan variasi

penambahan etanol 76%, buffer pencuci (etanol

76% dan ammonium asetat 3M), Proteinase K,

RNAse A, kalium asetat 5M, dan PVP. Selain itu,

modifikasi juga dilakukan dengan variasi

penambahan larutan pada tahap yang berbeda.

(Utami, 2012)

2.3 Tahap Isolasi DNA

a. Pada prinsipnya isolasi DNA sel harus dipecah

terlebih dahulu dengan beberapa agensia, baik

secara fisik kimia atau dengan mempergunakan

enzim tertentu. Pemecahan dengan cara fisik

misalnya dengan menggunakan alat sonikator,

yaitu merupakan alatb yang menghasilkan suara 

ultra tinggi. Pemecahan dengan alat ini biasanya

cukup fektif untuk memecah sel bacteri, tetapi

kurang efektif untuk memecah sek eukaryote.

b. Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan

menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah

dinding sel. Seringkali penggunaan enzim ini

dikombinasikan dengan perlakuan fisik, misalnya

dengan pemansan sehingga sel lebih mudah

pecah. Senyawa lain yang sering digunakan untuk

memecah sel untuk isolasi DNA adalah CTAB

(Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide).

c. Setelah sel pecah selanjunya dilakukan isolasi dan

pemurnian DNA. Untuk mengisolasi suatu fragmen

DNA  tertentu, DNA genom kemudian dipotong

dengan menggunakan enzin endonuclease 

restriksi, enzim ini enzim yang dapat memotong

molekul DNA  di bagian tertentu. Hasil potongan

dengan enzim tertentu akan menghasilkan ujung-

ujung DNA yang sama sesuai dengan titik  potong

oleh enzim.

d. Selain  dengan menggunkan enzin endonuclease

restriksi, DNA genom juga dapat dipotong-potong

secara mekanis, misalnya menggunakan alat

sonikator.Hasil potongan dengan alat mekanis

adalah molekul DNA  yang ujungnya tidak

beraturan.

 (Yuwono,2006)

2.4 Manfaat Isolasi DNA (khususnya bagi pertanian)

a. Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.

b. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan

secara enzimatik melaluiteknik Hibridisasi

Southern

c. Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan

pustaka genomik.

d. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur

rutin peminakan DNA.

e. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan

(template) dalam prosedur  perbanyakan DNA

secara in vitro melalui teknik PCR. (Zubaidah,

2004)

BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan Fungsi

3.2 Langkah Kerja + dokumentasi

Masukkan ke dalam tube 2 mL

Vortex tube inkubasi dalam oven 65OC (15 menit)

dinginkan sebentar

Sentrifuge kecepatan 10.000 rpm (5 menit)

Ambil supernatant pindahkan ke tube (2 mL) baru

Campurkan buffer CTAB 1 ml + karbon +

mercaptoetanol 4µL

Timbang masing-masing daun jagung dan daun kacang

tanah 0,1 g dan gerus dalam mortar. Tambahkan

reagen cair + PVP

Tambahkan 500 µL Chisam

Tambahkan vortex lagi 5 menit

Sentrifuge 10.000 rpm 5 menit

Pindahkan supernatant + 300 µL isopropanol dingin

Bolak balik tube secara perlahan dan inkubasi dalam

freezer 15 menit

Sentrifuge 8000 rpm 5 menit

Ambil supernatant dan buffer pencuci 500 µL dan

vortex

Sentrifuge 9000 rpm 5 menit

Ambil supernatant dan keringkan 20 menit

Tambahkan buffer TE sebanyak 50 µL

Larutkan pellet DNA dan mengetuk tube perlahan

3.3 Analisis Perlakuan

Pertama timbang masing-masing daun kacang

dan daun jagung tanpa tulang daun dengan berat 0,1

gram. Dihaluskan dengan mortar kemudian campurkan

buffer CTAB 1 ml, karbon dan mercaptoetanol 4µL

kemudian timbang 0,4 g dan gerus dalam mortar lalu

tambahkan reagen cair dan PVP. Masukkan ke dalam

tube 2 mL, Vortex tube lalu inkubasi dalam oven 65OC

selama 15 menit kemudian dinginkan sebentar.

Sentrifuge larutan dengan kecepatan 10.000 rpm

selama 5 menit. Ambil supernatant dan pindahkan ke

tube sebanyak 2 mL (baru). Tambahkan 500 µL

Chisam kemudian divortex lagi selama 5 menit dan

disentrifuge 10.000 rpm selama 5 menit. Pindahkan

supernatant dan 300 µL isopropanol dingin. Bolak balik

tube secara perlahan dan inkubasi dalam freezer 15

menit. Lakukan sentrifuge lagi 8000 rpm 5 menit. Ambil

supernatant dan buffer pencuci 500 µL dan vortex.

Sentrifuge 9000 rpm selama 5 menit. Ambil

supernatant dan keringkan 20 menit.Kemudian

tambahkan buffer TE sebanyak 50 µL. Terakhir

larutkan pellet DNA dan mengetuk tube perlahan.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil (DNA Terlihat/tidak + dokumentasi hasil)

Berdasarkan hasil pengamatan pada isolasi DNA daun

jagung terlihat adanya DNA hal ini dilihat dari adanyan

benang double helix. Sedangkan pada isolasi DNA daun

kacang tanah terlihat adanya RNA hal ini karena tampak

benang single helix.

4.2 Pembahasan (bandingkan dengan literature)

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

5.2 Kritik dan Saran

5.2.1 Kritik dan Saran untuk Praktikum Tahun Depan

5.2.2 Kritik dan Saran untuk Asisten

DAFTAR PUSTAKA

Aditia.2010.IsolasiDNA.http://sharkestaditia.blogspot.com/201

0/03/i solasiDNA.html Diakses 20 Desember 2014

Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation

procedure for small quantities of fresh leaf tissue.

Phytochem. Bull. 19: 11-15.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen,

Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas

comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA

Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum

Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan.

Malang: Universitas Negeri Malang

Puspita, 2010.TahapanIsolasi DNA. http://puspitt .multiply.com

/journal/item/14/ISOLASI- DNA? &show_interstitia

l=1 &u=%2Fjournal%2Fitem. Diakses tanggal 20

Desember 2014

Zubaidah, 2004. Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA

Baru pada Bakteri Radioresisten Deinococcus

radiodurans. Prosiding Seminar Nasional Sains dan

Teknik Nuklir, Bandung, Juni 2004.

Aditia.2010.IsolasiDNA.http://sharkestaditia.blogspot.com/

2010/03/isolasiDNA.html Diakses 20 Desember 2014.

Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation

procedure for small quantities of fresh leaf tissue.

Phytochem. Bull. 19: 11-15.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen,

Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas

comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA

Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum

Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang:

Universitas Negeri Malang

Puspita, 2010.TahapanIsolasi DNA. http://puspitt .multiply.com

/journal/item/14/ISOLASI-DNA? &show_interstitia l=1

&u=%2Fjournal%2Fitem. Diaksestanggal 21 Desember

2014

Zubaidah, 2004. Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA

Baru pada Bakteri Radioresisten Deinococcus

radiodurans. Prosiding Seminar Nasional Sains dan

Teknik Nuklir, Bandung, Juni 2004