TUGAS

BIOTEKNOLOGI

PEMANFAATAN AGROBACTERIUM UNTUK TRANSFORMASI

GENETIK TANAMAN DAN JAMUR

Nama Kelompok :

1. Budi Suwongso Wong 1110115

2. Hana Listiyana V. 1110127

3. Merry Enike 1110275

4. Kevin Kusuma Hadi 1110288

5. Kinia Tirta Ayu N. 1110342

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SURABAYA

SURABAYA

2015

PEMANFAATAN AGROBACTERIUM UNTUK TRANSFORMASI

GENETIK TANAMAN DAN JAMUR

Di era transformasi genetik sekarang ini, peran Agrobacteriumtumefaciens

(Agrobacterium) sangat besar dalam menghasilkan tanaman yang dimodifikasi untuk

mendapatkan sifat yang diinginkan. Peran Agrobacterium dalam hal ini ialah sebagai

kendaraan pembawa gen (DNA) yang diinginkan. A. tumefaciens merupakan bakteri aerob

obligat gram negatif yang hidup alami di tanah. Bakteri ini banyak menyebabkan penyakit

crown gall (tumor) pada tanaman dikotil. Kemampuannya dalam menyebabkan penyakit ini

berhubungan dengan gen penginduksi tumor yang ada pada plasmid (Ti) yang dijumpai

dalam bakteri tersebut. Dalam sel tumor yang terbentuk terkandung enzimenzim yang tidak

tampak pada tanaman normal, karena enzim tersebut hanya dihasilkan oleh sel

Agrobacterium. Enzim-enzim tersebut menghasilkan suatu senyawa gula spesifik yang

dinamakan opin. Senyawa opin ini merupakan makanan bagi Agrobacterium itu sendiri.

Aspek molekuler yang mendasari transformasi genetik oleh Agrobacterium ialah

proses transfer DNA dari Agrobacterium ke dalam genom sel tanaman. Di dalam sel

Agrobacterium terdapat tiga komponen utama yang berperan dalam transfer DNA ke dalam

sel tanaman (Sheng dan Citovsky, 1 996). Komponen pertama ialah suatu fragmen DNA

yang dikenal sebagai T-DNA, yaitu fragmen yang ditransfer ke dalam sel tanaman. T-DNA

terdapat dalam plasmid Ti yang berukuran 200 kb (kilo basa). Daerah T-DNA diapit oleh

sekuen DNA berulang yang berukuran 25 pb (pasang basa) pada sisi kanan dan kiri

Komponen kedua ialah (A.tumefaciens merupakan bakteri aerob obligat gram negatif

yang hidup alami di tanah. Bakteri ini banyak menyebabkan penyakit crown gall (tumor)

pada tanaman dikotil)daerah virulence (vir) yang berukuran 35-40 pb dan berada dalam

plasmid Ti. Letak gen vir bersebelahan dengan batas kiri TDNA. Gen-gen vir ini terbagi atas

7 yaitu A, B, C, D, E, G dan H. Gengen vir mensintesis protein virulensi yang berperan

menginduksi terjadinya transfer dan integrasi TDNA ke dalam tanaman. Empat gen-gen vir

yang paling penting mensintesis protein virulensi ini ialah vir A, B, D dan G. Jika ada sesuatu

yang menginduksinya, gen vir A dan G akan terekspresi dan mengaktifkan serangkaian gen-

gen vir lainnya. Senyawa kimia yang diketahui sebagai penginduksi gen vir antara lain

monosiklik fenolik acetosyringone. Senyawa induser tersebut dihasilkan tanaman ketika

tanaman dikotil luka dan mengeluarkan getah. Ekspresi gen vir juga sangat dipengaruhi oleh

senyawa induser dan kondisi pHdimana pH optimum untukekspresinya berkisar antara 5-

5,8(Hiei dkk, 1 997).

Komponen ketiga adalah gen chromosomal virulence (chv)yang terdiri atas chvA,

chvB, pscA dan att. Gen-gen tersebut terletakdi dalam kromosom Agrobacterium dan

mempuyai fungsi untukpelekatan bakteri pada sel tanaman dengan membentuk

senyawaprotein β-1,2-glukan. Berdasarkan sifat alamiah tersebut maka padadua dasawarsa

terakhir Agrobacterium dijadikan kendaraanpembawa gen target tertentu dengan cara

menyisipkan gen targetpada daerah T-DNA

Gambar 1. Proses infeksi alami dari Agrobacterium tumefaciens. Sel berwarna coklat adalah

sel Agrobacterium dan warna hijau adalah sel tanaman. Senyawa induser yang dikeluarkan

tanaman saat luka akan mengaktifkan gen vir A dan G untuk selanjutnya mengaktifkan gen-

gen vir lainnya sehingga proses transfer daerah T-DNA dari Agrobacterium ke dalam sel

tanaman terjadi. (sumber: http://www.rasmusfrandsen.dk/atmt. htm)

Manipulasi Agrobacterium untuk Tujuan Rekayasa Genetika

Masalah utama penyisipan DNA ke dalam plasmid Ti adalah ukuran plasmid Ti yang

besar (200 kb) dan daerah T-DNA pada umumnya tidak memiliki sisi unik untuk pemotongan

DNA. Besarnya ukuran ini menyulitkan dalam manipulasi dan menentukan tempat

pemotongan yang spesifik pada plasmid Ti. Selanjutnya para peneliti mengembangkan

strategi untuk menyisipkan DNA target ke dalam T-DNA. Strategi untuk memasukkan gen

target ke dalam T-DNA dapat dilakukan dengan dua pendekatan. Pertama dengan cara tidak

langsung memasukkan gen dengan posisi cis (bersebelahan) dengan gen virulen dalam

plasmid yang sama dan dikenal dengan vektor ko-integrasi. Pendekatan kedua dengan

melakukan kloning gen ke dalam daerah T-DNA di dalam plasmid yang berbeda yang

dikenal dengan sistem vektor ganda (Cramer dan Radin, 1990; Gelvin, 2003).

Syarat vektor ko-integrasi ialah mempunyai tempat yang tepat untuk menyisipkan

fragmen DNA, memiliki gen penyeleksi antibiotik yang aktif pada Escheria coli (E. coli)

maupun Agrobacterium, memiliki gen penanda untuk tanaman dan mempuyai ORI (origin of

replication) yang berfungsi di sel E. coli tetapi tidak aktif di Agrobacterium (Walkerpeach

dan Velten, 1994). Sedangkan pada vektor ganda membutuhkan dua plasmid di dalam

Agrobacterium. Plasmid pertama sebagai vektor yang mengandung fragmen DNA, dan

plasmid kedua sebagai penolong Ti yang menyediakan gen vir untuk fasilitator transfer gen

ke dalam sel tanaman. Kedua plasmid ini dapat bereplikasi dalam sel Agrobacterium.

Perkembangan terakhir menunjukkan bahwa vektor ganda lebih banyak digunakan untuk

kegiatan transformasi genetik baik pada tanaman dikotil maupun

monokotil. Dengan menggunakan vektor ganda penyisipan gen menjadi lebih mudah, karena

vektor yang mengandung batas T-DNA berukuran jauh lebih kecil dari plasmid Ti yang

sesungguhnya. Ukuran plasmid yang kecil memungkinkan adanya sisi enzim restriksi unik

dan penyisipan gen yang lebih besar.

Pemanfaatan Agrobacterium untuk Transformasi Genetik Tanaman

Lebih dari dua dekade teknik transformasi genetik untuk mendapatkan tanaman

dengan sifat agronomis tertentu berhasil dilakukan. Dengan teknik ini pemindahan gen dari

organisme yang sama atau organime yang berbeda dapat dilakukan. Tanaman hasil

transformasi genetik ini dinamakan tanaman transgenik. Potongan gen (DNA) asing yang

ditransformasi akan menyatu ke dalam genom tanaman. Melalui transformasi genetika ini

telah dihasilkan tanaman transgenik dengan sifat baru seperti ketahanan terhadap hama,

penyakit, herbisida, maupun peningkatan kualitas hasil, dan perbaikan kandungan nutrisi.

1. Ketahanan terhadap hama dan penyakit

Perakitan tanaman transgenik tahan hama merupakan merupakan salah satu

bidang yang mendapat perhatian besar dalam perbaikan tanaman. Perakitan tanaman

tahan hama umumnya mempergunakan gen dari Bacillus thuringiensis (Bt). Pada

tahun 1995, tanaman transgenik pertama mulai tersedia bagi petani di Amerika

Serikat, yaitu jagung hibrida yang mengandung gen cry IA(b), Maximixer, yang

dibuat oleh Novartis, tanaman kapas yang mengandung gen cry IA(c), Bollgard, sawi

(Barfield & Pua, 1991) dan kentang yang mengandung gen cry 3A, Newleaf, yang

dibuat oleh Monsanto. Sampai tahun 1998, lebih dari 10 jenis tanaman telah berhasil

ditransformasi untuk mendapatkan tanaman transgenik tahan hama. Tanaman tersebut

meliputi tembakau, tomat, kentang, kapas, padi, jagung, whitespruce, kacang hijau,

stroberi dan kanola (Schuler et al. 1998). Perakitan tanaman transgenik tahan penyakit

umumnya mempergunakan gen β-1,3-endoglukanase atau kitinase. Yoshikawa et al.,

1993 menggunakan gen β-1,3-endoglukanase dari tanaman kedelai untuk mengatasi

serangan jamur. Penggunaan gen tersebut didasarkan pada kemampuan gen β-1,3-

endoglukanase menghasilkan enzim β-1,3-endoglukanase yang berfungsi

mengkatalisis proses hidrolisis β-1,3-glukan yang merupakan komponen utama

dinding sel sebagian besar jamur. Hidrolisis tersebut menghasilkan elisitor berupa

karbohidrat yang selanjutnya menginduksi terbentuknya fitoaleksin anti jamur.

Perakitan tanaman tahan penyakit menggunakan gen β-1,3-endoglukanase telah

berhasil dilakukan pada tanaman buah kiwi (Nakamura et al., 1999), terong (Ito et al.,

1995) dan kubis (Manuhara et al., 2003).

2. Ketahanan terhadap herbisida

Gulma bersaing dengan tanaman dalam mendapatkan air, zat hara, sinar

matahari dan ruangan. Gulma tersebut juga merupakan tempat bagi serangga dan

hama penyakit, mengurangi kualitas tanaman dan menyisakan benih gulma pada

tanaman yang dipanen. Para petani mengendalikan gulma dengan membajak atau

mengolah tanah, menggunakan herbisida atau kombinasi keduanya. Kegiatan olah

tanah membuat permukaan tanah mudah terkena erosi akibat angin atau air. Melalui

perakitan tanaman tahan herbisida tertentu, petani dapat menggunakan herbisida

secara bijaksana untuk mengontrol gulma tanpa merusak tanaman. Hal ini merupakan

hasil peningkatan penggunaan herbisida yang ramah lingkungan dan mengurangi

pengolahan tanah.

Keberhasilan transformasi genetik didukung pula dengan ditemukannya enzim

restriksi yang mampu memotong molekul DNA pada tempat spesifik, dan enzim ligase

yang mampu menyatukan fragmen–fragmen DNA kembali sehingga dimungkinkan

mengembangkan rekombinasi DNA.

Transformasi genetik dengan menggunakan Agrobacterium merupakan sistem

transformasi genetik tidak langsung. Transformasi dengan Agrobacterium memiliki beberapa

keuntungan antara lain bersifat dapat diulang (reproducible), relatif lebih murah, memberikan

pola integrasi yang tegas, jumlah salinan dalam genom sedikit (1-3 salinan). Pada awalnya

teknik transformasi dengan Agrobacterium hanya berhasil pada tanaman dikotil karena

tanaman ini menghasilkan senyawa induser untuk menginduksi gen vir ketika tanaman luka

dan mengeluarkan getah. Tanaman tembakau dan solanaceae adalah contoh pertama tanaman

dikotil yang berhasil ditransformasi.

Perkembangannya kemudian, transformasi dengan Agrobacterium juga dapat

diaplikasikan pada tanaman monokotil dengan melakukan beberapa penyesuaian kondisi

seperti penambahan senyawa induser dan pH saat ko-kultivasi (Hiei dkk, 1994). Hiei dkk (1

994) telah berhasil membuktikan bahwa tanaman padi jenis japonica berhasil ditransformasi

menggunakan Agrobacterium dengan material tanaman berupa sel kalus embriogenik. Dalam

penelitiannya Hiei dkk menambahkan senyawa asetosiringone pada media dan menggunakan

media dengan pH 5,2 saat ko-kultivasi. Hingga saat ini studi transformasi genetik dengan

Agrobacterium terhadap tanaman pangan seperti padi terutama jenis indica (yang banyak

dibudidayakan dan dikonsumsi) terus dilakukan. Dengan berbagai optimasi kondisi

transformasi maka baru-baru ini Hiei dan Komari (2006) telah berhasil meningkatkan

efisiensi transformasi dengan Agrobacterium hingga 30% per embrio belum masak

(immature) yang digunakan pada sepuluh kultivar padi indica. Beberapa jenis tanaman

pangan dan non pangan hasil transformasi dengan Agrobacterium di Amerika yang

dilaporkan ialah kedelai, kapas, jagung, bit, alfalfa, gandum, canola, creeping bentgrass

(untuk pakan). Contoh tanaman transgenik ditampilkan pada Gambar 2

Gambar 2. Tanaman transgenik hasil transformasi menggunakan Agrobacterium dengan

berbagai sifat yang diinginkan. Kedelai, kapas dan jagung transgenik tahan penggerek

(A,B,C), tomat tahan simpan (D), padi mengandung provitamin A (E), padi mutan dengan

transposon (F)

Selain menyisipkan gen target untuk perubahan sifat tanaman tertentu yang

dikehandaki, transformasi genetik dengan Agrobacterium pada tanaman juga bermanfaat

untuk membuat populasi tanaman mutan. Dengan menggunakan Agrobacterium

memungkinkan diperoleh mutan dalam jumlah banyak dalam suatu periode yang relatif

singkat. Pembuatan mutan dilakukan dengan menggunakan elemen loncat (transposon)

misalnya transposon Ac/Ds. Transposon Ds akan berpindah posisi dalam genom pada tempat

berbeda dan tersisip pada gen-gen fungsional. Sedangkan elemen Ac menyandikan suatu

enzim yang mengaktifkan elemen Ds untuk bertransposisi. Adanya penyisipan Ds ini

memungkinan fenotipe tanaman menjadi beragam. Keragaman mutan ini dapat dijadikan

sebagai sumber plasma nutfah baru untuk selanjutnyan dapat dilakukan isolasi gennya.

Pemanfaatan Agrobacterium padaTransformasi Genetik Jamur

Selama ini diketahui bahwa transformasi dengan mediasi Agrobacterium (AMT,

agrobacterium-mediated transformation) merupakan sistem transformasi yang hanya dikenal

untuk transformasi tanaman, baik dikotil maupun monokotil. Akan tetapi dalam beberapa

tahun terakhir telah dilaporkan bahwa sistem transformasi dengan mediasi Agrobacterium

ternyata juga dapat digunakan untuk tarnsformasi organisme selain tanaman, seperti jamur

termasuk jenis kapang atau ragi. Teknik AMT telah dikembangkan sebagai teknik

transformasi jamur yang sangat efisien, baik untuk insersi gen secara acak maupun terarah.

Teknik ini telah menjadi pilihan untuk transformasi jamur (Weld dkk., 2006).

Teknik AMT telah diketahui mampu menghasilkan frekuensi transformasi yang lebih

tinggi secara nyata dan menghasilkan transforman yang lebih stabil dibandingkan teknik

biolistik (penembakan DNA) yang umumnya digunakan pada transformasi jamur. Pada

kondisi yang tepat, Agrobacterium mampu melakukan transfer DNA (T-DNA) kepada

berbagai jenis jamur. Beberapa jamur yang diketahui sangat sulit dilakukan transformasi

menggunakan sistem transformasi lain ternyata berhasil ditransformasi dengan teknik ko-

kultivasi dengan Agrobacterium (Weld dkk., 2006).

Teknik AMT merupakan sistem transformasi yang relatif sederhana. Teknik ini tidak

memerlukan pembuatan protoplas dan dapat digunakan untuk tujuan ‘penggantian-gen’

dengan cara rekombinasi homologus, maupun mutagenesis insersi melalui integrasi secara

acak. Beberapa contoh jenis jamur yang berhasil di transformasi dengan bantuan

Agrobacterium ialah Saccharomyces cerevisiae, Penicillium chrysogenum, Agaricus bisporus

(Schrammeijer dkk,. 2003; Bundock dan Hooykaas, 1996; Chen X dkk., 2000; Sun dkk.,

2002)

Gambar 3. jamur- yang berhasil ditransformasi dengan bantuan Agrobacterium ialah

Saccharomyces cerevisiae, Penicillium chrysogenum, Agaricus bisporus (A, B, C)

Gen Penanda dan Mutagenesis Insersi Acak pada Transformasi Jamur

Beberapa jenis gen penanda diketahui dapat digunakan sebagai gen penanda pada

jamur. Gen hph atau gen resistensi hygromycin B adalah yang paling umum digunakan untuk

seleksi transforman jamur karena efektivitasnya pada sebagian besar jenis jamur. Gen

penanda lainnya adalah gen resistensi terhadap phleomycin, sulfonylurea, nourseothricin,

bialaphos, carboxin, blasticid S dan benomyl. Selain itu sebagai alternatif terhadap gen

resistensi senyawa tersebut adalah dengan menggunakan gen penanda auxotrophic seperti

pyrG (homolog gene ura3 dari S. cerevisiae). Mutan yang kehilangan pyrG bersifat

auxotrofik urasil, sehingga vektor yang mengandung pyrG akan memungkinkan seleksi

transforman pada medium yang defisien urasil. Selain itu mutan yang defisien pyrG akan

bersifat resisten terhadap 5- fluoro-orotic acid (5FOA) yang bersifat toksik pada prototroph.

Dengan cara seleksi negatif/positif terhadap gen pyrG memungkinkan untuk melakukan

transformasi sekuensial menggunakan Blaster cassettes (Weld dkk., 2006).

Dengan memasukkan DNA ke dalam genom, baik melalui transformasi maupun

melalui pergerakan DNA secara in vivo melalui transposon, akan dihasilkan suatu seri mutan

dengan mutasi secara acak. Mutasi tersebut dapat diberi tanda (tagged). Dengan teknik ini

dimungkinkan untuk merusak suatu gen, menandai promotor atau enhancer, atau untuk

meningkatkan regulasi suatu gen. Isolat transforman diisolasi dan dianalisis perubahan

fenotip yang menjadi target. Dengan asumsi bahwa perubahan fenotip terjadi perusakan gen

oleh T-DNA, fragmen DNA di sekitar T-DNA tersebut diambil dengan teknik PCR seperti

inversePCR dan TAIL-PCR atau dengan teknik plasmid rescue. Bila terjadi integrasi

berurutan pada beberapa tempat, maka teknik semi-random PCR dapat digunakan untuk

memperoleh DNA genomik di sekitar T-DNA tersebut. Idealnya sistem penanda gen harus

memiliki frekuensi transformasi yang tinggi, integrasi secara acak satu salinan gen pada satu

lokus tanpa terjadi perubahan atau delesi baik pada TDNA maupun DNA genom. Dengan

demikian penggunaan T-DNA dalam mutagenesis insersi acak dapat digunakan dengan baik.

Pustaka

1. Bundock P, PJJ Hooykaas. 1996. Integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA

in the Saccharomyces cerevisiae genome by illegitimate recombination. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA. 93: 15272- 15275.

2. Chen X, Stone M, Schlagnhaufer C, Romaine CP. 2000. A fruiting bodyn tissue

method for efficient Agrobacterium Mediated transformation of Agaricus bisporus.

Applied and Environmental Microbiol. 66(1 0):4510-4513.

3. Cramer CL, DN Radin. 1990. Molecular biology of plant in Biotechnology of plant

microbes interaction. Nakas JP, C Hagedorn (eds).Mc Graw publishing Comp. New

York. Pp 1-49. Gelvin SB. 2003. Agrobacterium mediated plant transformation: the

Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool. Microbiol. Mol. Bio. Rev. 67(1): 16-37

4. Hiei Y, S Otha, T Komari,T Kumashiro. 1994. Efficient transformation of rice (Oryza

sativa L) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the

T-DNA. Tha Plant J. 6(0): 001-011

5. Hiei Y, T Komari. 2006. Improved protocols for transformation of Indica rice

mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Tissue and Organ Culture .

Springer 2006

6. Hiei Y, T. Komari, T. Kubo. 1997. Transformation of rice mediated by

Agrobacterium tumefaciens. Plant Mol. Biol. 35:205-218.

7. Schrammeijer B, A den Dulk-Ras, AC Vergunst, EJ Jacome, IJ Hooykaas. 2003.

Analysis of vir protein translocation from Agrobacterium using Saccharomyces

cerevisiae as a model: evidence for transport of a nover effector protein vir E3.

Nucleic Acid Res. 31(3): DOI: 10.1093/nar/gkg 179.

8. Sheng J, V Citovsky. 1 996. Agrobacterium-plant cell DNA transport: have virulence

proteins, will travel. The Plant Cell. 8:1699-1 710

9. Su CB, Kong Q, Xu W. 2002. Efficient transformation chrysogenum mediated by

Agrobacterium tumefaciens LBA4404 for cloning of vitreoscillia hemoglobin gen.

EJB electronic J. Biotechnol. 5(1): 2-7.

10. Walkerpeach CR, J Velten. 1994. Agrobacterium mediated gene transfer to plant

cells: co integrated and binary vektor sytem. Plant Mol. Biol. 1-19

11. Weld RJ, KM Plummer, MA Carpenter, HJ Ridgway. 2006. Approaches to functional

genomics in filamentous fungi. Cell Res. 16: 31-4