35

BAB 5 HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Pengaruh Toksisitas Rhodamin B dan Sakarin terhadap Gambaran

Histopatologi Hepar Tikus Putih (Rattus norvegicus)

Pengamatan gambaran histopatologi hepar tikus putih (Rattus norvegicus)

pada setiap kelompok dilakukan dengan pengamatan langsung dibawah

mikroskop binokuler Olympus BX51 dan dijelaskan secara desriptif kualitatif.

Bagian hepar tikus putih yang diamati menggunakan perbesaran 400x yaitu

hepatosit, vena sentralis, dan segitiga portalis yang meliputi vena porta

hepatika, cabang arteri hepatika dan duktus biliaris.

Lobulus hepar dipisahkan oleh jaringan ikat dan pembuluh darah.

Pembuluh darah pada hepar terdapat pada sudut-sudut lobulus, membentuk

bangunan yang disebut trigonum Kiernan atau area portal. Pada area portal

dapar ditemukan cabang arteri hepatika, cabang vena porta, pembuluh limfe,

dan duktus billiaris. Struktur lobulus hepar pada potongan melintang akan

terlihat sebagai struktur yang berderet dan radier dengan pusatnya yaitu vena

sentralis, dipisahkan oleh sebuah celah atau sinusoid hepar. Pada sinusoid

terdapat sel Kupffer jika dilihat secara mikroskopik. Selain itu, juga terdapat

sel-sel hepar yang disebut sebagai hepatosit (Nurzali, 2013).

Gambaran histopatologi hepar tikus putih (Rattus norvegicus) pada

kelompok kontrol negatif (K-) menunjukkan keadaan normal yang

ditunjukkan dengan adanya hepatosit dengan inti berada di tengah dan batas

selnya terlihat jelas. Pengamatan histopatologi dilakukan pada dua lokasi

yaitu daerah vena sentralis dan segitiga portalis. Hepatosit tersusun dan

36

memusat pada vena sentralis dan diantara hepatosit tersebut terdapat sinusoid

yang tampak putih dengan sel kupffer yang tampak lebih gelap dibandingkan

dengan hepatosit (Gambar 5.1). Menurut Nurzali (2013), sel kupffer

memiliki fungsi untuk memfagosit eritrosit tua, hemoglobin, dan mensekresi

sitokin. Pada daerah segitiga portalis juga tampak hepatosit tersusun rapi

memusat pada vena porta, serta susunan pembuluh limfe dan duktus biliaris

tidak mengalami perubahan (Gambar 5.1). Semua komponen penyusun

hepar pada kelompok kontrol negatif (K-) tidak terdapat perubahan (Gambar

5.1). Dengan demikian, gambaran histopatologi hepar tersebut digunakan

sebagai acuan untuk membandingkan kondisi histopatologi hepar pada

kelompok perlakuan dengan pemberian rhodamin B dan sakarin.

Gambar 5.1 Histopatologi Hepar Tikus Putih (Rattus norvegicus) Kelompok

Kontrol Negatif (K-) Perbesaran 400X. ( ) Hepatosit; ( ) Sinusoid; ( ) Sel Kupffer.

Gambaran histopatologi hepar tikus putih (Rattus norvegicus) kelompok

perlakuan 1 (P1) yaitu tikus yang diinduksi rhodamin B dengan dosis 22,5

mg/kgBB menunjukkan adanya abnormalitas dibandingkan dengan kelompok

kontrol negatif. Hal tersebut ditunjukkan dengan adanya nekrosis koagulasi

jaringan hepar di daerah vena sentralis (Gambar 5.2). Nekrosis koagulasi

Vena sentralis

Vena porta

Duktus biliaris

Cabang arteri hepatika

37

ditandai dengan struktur luar sel terlihat utuh, tetapi inti sel mengalami

perubahan yaitu piknotik (menghilang) serta sitoplasma terlihat eosinofilik

karena mengalami asidifikasi. Selain daerah vena sentralis, daerah segitiga

portalis juga diamati dan menunjukkan adanya perubahan pada sel hepatosit.

Hepatosit pada daerah vena sentralis dan segitiga portalis mengalami nekrosis

pada tahap karyoreksis dimana inti sel memudar dan tampak fragmen

kromatin serta pada tahap karyolisis yang ditandai dengan inti sel yang tidak

terwarnai (Gambar 5.2). Sel kupffer tampak jelas berada di sinusoid dengan

inti yang lebih gelap.

Gambar 5.2 Histopatologi Hepar Tikus Putih (Rattus norvegicus) Kelompok

Perlakuan 1 (P1) Perbesaran 400X. ( ) Hepatosit; ( ) Sinusoid; ( ) Sel Kupffer; ( ) Nekrosis Koagulasi; ( )Karyoreksis;

( ) Karyolisis.

Gambaran histopatologi hepar tikus putih (Rattus norvegicus) kelompok

perlakuan 2 (P2) merupakan tikus yang diinduksi sakarin dengan dosis

157,77 mg/kgBB menunjukkan perubahan yang tidak signifikan. Hal tersebut

ditandai dengan susunan hepatosit masih terlihat normal mengarah pada vena

sentralis dan vena portalis. Hepatosit terlihat normal dengan inti berada di

tengah dan batas sel terlihat jelas. Kelainan yang terjadi yaitu terlihat adanya

eritrosit berwarna kemerahan yang menandakan adanya kongesti pada hepar.

Vena sentralis Vena porta

Cabang arteri hepatika

Duktus biliaris

38

Selain itu, terjadi juga hiperplasia duktus biliaris yang ditandai dengan

bertambahnya jumlah sel epitel duktus biliaris. Sel kupffer terlihat jelas

berada pada sinusoid dengan inti lebih gelap (Gambar 5.3).

Gambar 5.3 Histopatologi Hepar Tikus Putih (Rattus norvegicus) Kelompok Perlakuan 2 (P2) Perbesaran 400X. ( ) Hepatosit; ( ) Sinusoid;

( ) Sel Kupffer; ( ) Kongesti; ( ) Hiperplasia duktus biliaris.

Gambaran histopatologi hepar tikus putih (Rattus norvegicus) kelompok

perlakuan 3 (P3) merupakan tikus yang diinduksi kombinasi rhodamin B

dosis 22,5 mg/kgBB dan sakarin dosis 157,77 mg/kgBB menunjukkan adanya

abnormalitas yang terjadi pada daerah vena sentralis dan segitiga portalis. Hal

tersebut ditunjukkan dengan adanya infiltrasi sel radang limfosit dengan inti

gelap berada diantara hepatosit pada daerah vena sentralis maupun segitiga

portalis. Duktus biliaris mengalami hiperplasia ditandai dengan bertambahnya

jumlah sel epitel. Beberapa hepatosit mengalami nekrosis pada tahap

karyolisis yang ditandai dengan tidak terwarnainya inti sel serta tahap

karyoreksis yang ditandai dengan inti sel memudar dan terdapat benang

kromatin. Sinusoid tampak putih jelas dengan adanya sel kupffer yang berinti

gelap (Gambar 5.4).

Vena sentralis

Vena porta

Cabang arteri hepatika

Duktus biliaris

39

Gambar 5.4 Histopatologi Hepar Tikus Putih (Rattus norvegicus) Kelompok Perlakuan 3 (P3) Perbesaran 400X. ( ) Hepatosit; ( ) Sinusoid;

( ) Sel Kupffer; ( ) Kariolisis; ( )Karyoreksis;

( ) Hiperplasia duktus biliaris; ( ) Infiltrasi sel radang.

Tabel 5.1 Perubahan Gambaran Histopatologi Hepar Tikus Putih (Rattus

norvegicus)

Kelompok Kongesti Hiperplasia

Duktus

Biliaris

Infiltrasi

sel

radang

Nekrosis

karyorek

sis

kariolisis

K- (Kontrol

Negatif)

- - - - -

P1 (Rhodamin B

22,5 mg/kgBB)

- - -

P2 (Sakarin

157,77 mg/kgBB

- - -

P3 (Rhodamin B

22,5 mg/kgBB

dan sakarin

157,77 mg/kgBB)

-

Keterangan:

- : tidak ada perubahan : ada perubahan

Hepar merupakan organ yang berperan dalam metabolisme zat xenobiotik.

Seluruh zat xenobiotik yang berasal dari saluran pencernaan akan melalui

vena porta hepatika dan terjadi metabolisme di hepar (Riczek, et al., 2011).

Rhodamin B dan sakarin termasuk zat xenobiotik karena tidak dibutuhkan

oleh tubuh. Oleh karena itu, rhodamin B dan sakarin akan mengalami

Vena sentralis

Vena porta

Cabang arteri hepatika

Duktus biliaris

40

metabolisme di hepar melalui dua tahap. Menurut Sobinoff, et al. (2012),

tahap I metabolisme yaitu tahap oksidasi dimana zat xenobiotik yang masuk

akan dikatalis oleh sekelompok enzim monooksigenase/Sitokrom P450 dan

tahap II yaitu senyawa hasil dari tahap I diubah menjadi berbagai metabolit

polar yang spesifik.

Rhodamin B (tetraethyl-3’,6;-diamninofluran) masuk ke dalam tubuh

sebagai zat xenobiotik melalui proses ingesti. Dalam saluran digesti rhodamin

B diserap oleh vena mesenterika dan selanjutnya akan melalui vena porta

hepatika untuk dimetabolisme pada hepar. Proses metabolisme utama

rhodamin B terjadi pada tahap satu metabolisme. Rhodamin B akan

dimetabolisme melalui fase oksidasi dan hidrolisis dengan bantuan enzim

Cytochrome P450 (CYP). Proses ini disebut dengan de-etilasi, dimana

rhodamin B akan dipecah menjadi 3’,6’-diaminofluoran dan N,N’-diethyl-

3’,6’ diaminofluoran (Webb, et al., 2014). Senyawa tersebut merupakan

senyawa radikal yang dapat beredar melalui pembuluh darah hingga merusak

jaringan tubuh. Metabolisme rhodamin B pada fase ini juga mengaktivasi

senyawa klorin (Cl) dengan bantuan enzim P450 (Lu Yongke & Caderbaum

A, 2008). Klorin (Cl) termasuk senyawa halogen dan radikal dimana senyawa

halogen sangat berbahaya karena memiliki reaktivitas yang tinggi untuk

mencapai kestabilan dalam tubuh dengan menyerang molekul terdekat dan

mencari pasangan elektron sehingga akan merusak bentuk molekul tersebut.

Aktivitas radikal dari senyawa klorin tersebut yang akan menimbulkan efek

toksik dan menyebabkan kerusakan sel tubuh karena sel-sel makromolekul

41

seperti protein, karbohidrat, lemak, dan asam nukleat hancur (Manurung,

2011).

Sakarin merupakan zat karsinogenik yang dapat menyebabkan kanker

setelah tubuh terpapar 5-10 tahun. Sakarin juga termasuk zat xenobiotik yang

dapat menjadi sumber ROS (Reactive Oxygen Species). Dalam proses

metabolisme fase satu sakarin membutuhkan lebih banyak molekul O2 untuk

proses oksidasi. Proses tersebut yang akhirnya akan membentuk senyawa

radikal superoxide (O2-) dan dapat memicu stress oksidatif. Menurut

Sobinoff, et al. (2012) xenobiotik yang dimetabolisme oleh sitokrom P450

akan menghasilkan superoxide (O2-). Jika superoxide bereaksi dengan SOD

maka akan membentuk H2O2, tetapi jika bereaksi dengan Fe maka akan

terbentuk hidroksi radikal. Hidroksi radikal inilah yang dapat menyebabkan

stress oksidatif. Amin and Almuzafar (2015), menambahkan bahwa

pembentukan radikal bebas (O2-) dari metabolisme sakarin dapat

menyebabkan perubahan fungsi hati dan ginjal.

Permatasari (2014), menyebutkan bahwa zat warna rhodamin B dapat

menyebabkan perubahan bentuk dari organisme sel jaringan hepar dari

keadaan normal menjadi patologis. Sel hepar mengalami nekrosis dan

jaringan disekitarnya mengalami disintegrasi. Kerusakan pada jaringan hepar

ditandai dengan terjadinya piknotik dan hiperkromatik dari nukleus.

Terhambatnya pasokan energi dalam hepar yang digunakan untuk

memelihara fungsi struktur endoplasmik mengakibatkan penurunan proses

42

sintesis protein yang menyebabkan sel hepar tidak mampu mengeluarkan

trigliserida dan mengakibatkan nekrosis.

Nekrosis terlihat pada kelompok perlakuan P1 dan P3. Nekrosis yang

terjadi pada jaringan hepar yaitu nekrosis koagulasi, sedangkan nekrosis pada

hepatosit yaitu pada tahap karyoreksis dan karyolisis. Perubahan

histopatologi yang tampak pada kelompok perlakuan P1 yaitu adanya

nekrosis koagulasi yang ditandai dengan warna sitoplasma lebih eosinofilik.

Sel hepar yang mengalami nekrosis tampak utuh tetapi inti sel mengalami

perubahan. Menurut Zachary (2016), nekrosis koagulasi merupakan respon

awal dari hipoksia, ischemia, maupun cedera karena zat toksik. Nekrosis

koagulasi dapat terjadi dari proses fagositosis. Cedera awal yang dialami oleh

sel tidak hanya mendenaturasi protein struktural, tetapi juga enzim lisosomal.

Pada keadaan normal enzim lisosomal dapat menyebabkan disintegrasi

proteolitik dari keseluruhan sel, tetapi karena adanya denaturasi tersebut,

disintegrasi proteolitik dari sel terhambat. Namun, degradasi asam nukleat

dari sel tersebut tetap terjadi. Hal tersebut yang menyebabkan tampaknya

perubahan pada inti sel, tetapi struktur luar sel tampak utuh.

Perubahan gambaran histopatologi pada kelompok perlakuan P2

menunjukkan adanya kongesti pada hepar. Terlihat bendungan eritrosit pada

vena sentralis dan vena portalis. Kongesti yaitu pembendungan darah di

dalam pembuluh darah pada suatu regio tertentu. Kongesti merupakan lesi

dualisme yaitu lesi yang menggambarkan gangguan sirkulasi dan dapat

sebagai indikator perbaikan jaringan (Bhadauria, 2012). Sehingga kongesti

43

yang terjadi pada kelompok perlakuan P2 ini dapat terjadi sebagai respon

inflamasi yang terjadi akibat zat toksik, serta dapat terjadi karena gangguan

sirkulasi darah ketika dilakukan dislokasi.

Perubahan gambaran histopatologi pada kelompok perlakuan P2 dan P3

menunjukkan adanya hiperplasia pada duktus biliaris. Kerusakan pada duktus

biliaris dapat menyebabkan adanya respon tubuh untuk mempertahankan

keadaan normal sel salah satunya yaitu dengan melakukan hiperplasia sel.

Hiperplasia merupakan kerusakan jaringan organ yang ditandai dengan

pertambahan ukuran organ akibat bertambahnya jumlah sel. Hiperplasia dapat

terjadi karena adanya akumulasi senyawa bersifat toksik, walaupun dengan

konsentrasi rendah namun dengan paparan cukup lama dalam tubuh dapat

menyebabkan kerusakan (Permatasari, 2014). Hiperplasia duktus biliaris

terjadi karena adanya senyawa (3’,6’-diaminofluoran) yang terakumulasi

dalam hepar sehingga menyebabkan proses metabolisme terganggu dan

akhirnya sel duktus biliaris mengalami hiperplasia.

Perubahan histopatologi pada P3 menunjukkan adanya infiltrasi sel

radang. Infiltrasi sel radang terjadi karena respon inflamasi yang terjadi pada

hepar. Senyawa radikal bebas yang dihasilkan dari metabolisme rhodamin B

dan sakarin merangsang makrofag untuk mensekresi sitokin dan kemokin,

dimana kemokin berfungsi untuk merekrut sel inflamator salah satunya sel

radang untuk menuju situs inflamasi. Menurut Cesta (2014), sel radang yang

paling dominan pada toksisitas subkronis yaitu limfosit dan monosit. Sel

44

limfosit dapat meningkat saat terjadi paparan terus menerus dan

membutuhkan sistem imun adaptif.

5.2. Pengaruh Toksisitas Rhodamin B dan Sakarin terhadap Ekspresi Tumor

Necrosis Factor Alpha (TNF-α) pada Hepar Tikus Putih (Rattus

norvegicus)

Pengaruh rhodamin B dan sakarin terhadap ekspresi TNF-α pada hepar

dapat diketahui menggunakan pewarnaan imunohistokimia (IHK) pada

preparat histopatologi hepar tikus putih. Karakteristik pewarnaan IHK

menggunakan kromogen berupa DAB (3,3’-diaminobenzidine) yang

merupakan substansi yang menyerap cahaya dan akan membentuk warna

cokelat pada preparat. Preparat yang terwarnai cokelat akan dihitung

persentase (%) warna menggunakan aplikasi Immunoratio.

Ekspresi TNF-α ditunjukkan dengan warna cokelat pada hepar tikus putih

(Rattus norvegicus) menggunakan antibodi TNF-α pada metode

imunohistokimia (IHK) (Gambar 5.5). Warna cokelat yang dihasilkan

merupakan hasil reaksi antara Streptavidin-Horse Radish Peroxidase (SA-

HRP) yang berikatan dengan antibodi sekunder dengan kromogen

Diaminobenzidine (DAB) (Duerr, 2006).

45

Gambar 5.5 Ekspresi Tumor Necrosis Faktor-Alpha (TNF-α) pada Gambaran

Imunohistokimia Hepar Tikus Putih (Rattus norvegicus) Perbesaran 400x

(kiri) dan 1000X (kanan).

46

Keterangan:

(1) Tikus kontrol negatif (K-); (2) Tikus perlakuan 1 (P1); (3) Tikus perlakuan 2 (P2); (4) Tikus perlakuan 3 (P3). Tanda panah merah menunjukkan ekspresi TNF-α.

Ekspresi TNF-α pada gambaran preparat IHK hepar tikus putih (Rattus

norvegicus) yang ditunjukkan dengan warna kecoklatan selanjutnya dihitung

presentasenya menggunakan Immunoratio dengan melakukan rataan lima

lapang pandang presentase ekspresi TNF-α pada hepar dengan perbesaran

400X. Gambar preparat IHK juga diambil menggunakan perbesaran 1000X

untuk melihat lebih jelas warna kecoklatan dari ekspresi TNF-α hepar. Data

hasil uji dari Immunoratio selanjutnya dianalisa menggunakan perhitungan

statistika. Analisa statistika menggunakan One Way ANOVA dengan aplikasi

SPSS for Windows 16 dan dilanjutkan dengan uji Tukey α = 0,05 (Lampiran

7).

Tabel 5.2. Ekspresi Tumor Necrosis Faktor-Alpha (TNF-α) Hepar Tikus Putih

(Rattus norvegicus) yang Diinduksi Rhodamin B dan Sakarin

Keterangan: Perbedaan notasi a, b, c menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan (p

47

Ekspresi TNF-α terlihat pada semua kelompok dan tersebar pada sel

hepatosit yang ditunjukan dengan tanda panah merah (Gambar 5.5).

Gambaran preparat IHK pada kelompok tikus kontrol negatif tanpa diberikan

perlakuan ditunjukkan oleh (Gambar 5.5 (1)) menunjukkan adanya ekspresi

TNF-α dengan presentasi paling rendah dibandingkan kelompok perlakuan

lainnya, yaitu memiliki rata-rata sebesar 31,99±1,09 % (Tabel 5.2). Adanya

ekspresi TNF-α pada kelompok kontrol terjadi karena TNF-α secara normal

terdapat dalam tubuh dalam jumlah relatif sedikit sebagai komponen

imunitas. Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) merupakan salah satu

sitokin yang dihasilkan oleh makrofag (sel kupffer) berfungsi untuk

merangsang dan mengaktifkan sistem imun terhadap respon inflamasi,

dimana dalam keadaan normal, antigen yang masuk memicu reaktivitas imun

pada imunitas nonspesifik maupun spesifik (Baratawidjaja, 2004).

Ekspresi TNF-α pada kelompok P1 yang diinduksi rhodamin B dosis 22,5

mg/kgBB ditunjukkan oleh (Gambar 5.5 (2)) memiliki rata-rata presentase

sebesar 66,26±0,95% dan mengalami peningkatan sebanyak 107,1%

dibanding dengan kelompok kontrol negatif (K-). Peningkatan presentase

ekspresi TNF-α pada kelompok P1 terjadi karena adanya inflamasi pada

hepar yang disebabkan oleh rhodamin B sehingga menginduksi produksi

Reactive Oxygen Species (ROS). Menurut BPOM (2005), rhodamin B

mengandung senyawa klorin (Cl) yang sangat reaktif, apabila tertelan

senyawa ini akan berusaha mencapai kestabilan dalam tubuh dengan cara

mengikat senyawa lain. Aktivitas radikal dari senyawa klorin tersebut yang

48

dapat meningkatkan produksi ROS. Produksi ROS yang berlebih dapat

menyebabkan aktivasi NF-kB, dimana NF-kB selanjutnya akan berpindah

menuju nukleaus dan menginduksi transkripsi gen diantaranya sitokin

proinflamasi TNF-α yang berperan sebagai indikator terjadinya inflamasi

(Suhartiningsih, dkk., 2012).

Ekspresi TNF-α pada kelompok P2 yang diinduksi sakarin dosis 157,77

mg/kgBB ditunjukkan oleh (Gambar 5.5 (3)) memiliki rata-rata presentase

sebesar 32,92±0,88 % dan mengalami peningkatan sebanyak 2,9% dibanding

dengan kelompok kontrol negatif (K-) (Tabel 5.2). Berdasarkan hasil analisa

statistika tersebut, kelompok (P2) tidak menunjukkan adanya peningkatan

ekspresi TNF-α yang signifikan dibandingkan dengan kelompok (K-) ditandai

dengan hasil notasi yang sama. Hal tersebut disebabkan karena hanya

sebagian kecil dari jumlah sakarin yang dimetabolisme dalam tubuh dan lebih

banyak yang langsung diekskresikan melalui urin, sehingga radikal bebas

yang dihasilkan juga dalam jumlah kecil. Amin & Almuzafar (2015)

menyebutkan bahwa sakarin dapat menyebabkan perubahan fungsi hati dan

ginjal karena dapat membentuk radikal bebas. Sebagian besar sakarin yang

masuk kedalam tubuh dieksresikan melalui urin dalam bentuk utuh dan

sebagian kecil dimetabolisme di hepar. Sakarin dosis tinggi (500 mg/kgBB)

dapat menghasilkan ROS dan peroksidasi lipid. Karena dosis sakarin yang

diberikan pada kelompok (P2) sebesar 157,77 mg/kgBB, sehingga ekspresi

TNF-α tidak menunjukkan hasil yang terlalu signifikan.

49

Ekspresi TNF-α pada kelompok P3 yang diinduksi kombinasi rhodamin B

dosis 22,5 mg/kgBB dan sakarin dosis 157,77 mg/kgBB ditunjukkan oleh

(Gambar 5.5 (4)) memiliki rata-rata presentase sebesar 78,89±0,52 % dan

mengalami peningkatan sebanyak 146,6% dibanding dengan kelompok

kontrol negatif (K-) (Tabel 5.2). Peningkatan presentase ekspresi TNF-α

tersebut menunjukkan hasil yang sangat signifikan dan merupakan hasil uji

tertinggi karena merupakan kombinasi dari dua zat xenobiotik. Radikal bebas

yang dihasilkan oleh metabolisme rhodamin B dan sakarin yang merupakan

kombinasi dari dua zat xenobiotik akan bergabung dan bersinergi sehingga

menghasilkan radikal bebas yang lebih banyak. Hal tersebut yang dapat

menyebabkan tingginya ekspresi TNF-α pada kelompok (P3) karena ROS

yang dihasilkan juga semakin meningkat.

Berdasarkan Tabel 5.2, rata-rata ekspresi TNF-α kelompok perlakuan (P1

dan P3) mengalami peningkatan yang signifikan dan memiliki perbedaan

nyata dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif (K-). Tetapi pada

kelompok perlakuan (P2) tidak mengalami peningkatan yang signifikan

dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif (K-). Kelompok P3 yang

merupakan perlakuan dengan induksi kombinasi rhodamin B dosis 22,5

mg/kgBB dan sakarin dosis 157,77 mg/kgBB menunjukkan hasil ekspresi

TNF-α paling tinggi yang membuktikan bahwa kombinasi dengan dosis

tersebut dapat menimbulkan efek toksik yang lebih besar dibandingkan

dengan pemberian rhodamin B atau sakarin saja.