Fakultas Kedokteran Universitas HasanuddinMakassar, Februari 2010

ASISTENSI DAN PENJELASAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

SISTEM RESPIRASI

24/02/2010 1

PEMBAGIAN KELOMPOK / ASISTEN PRAKTIKUM RESPIRASI

A1 –B1—A9 : LAODE MALI RAY

A2—B2 : DERVIN ARIANSYAH

A3—B3 : RUQNUDDIN

A4—B4 : IRFAN ADI SAPUTRA

A5—B5—B9 : RINI MAGFIRAH

A6—B6 : AMINAH

A7—B7 : RAFIQAH NURDIN

A8—B8 : HASMIA24/02/2010 2

TATA-TERTIB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGISISTEM RESPIRASI

24/02/2010 3

24/02/2010 4

24/02/2010 5

 

DIAGNOSIS LABORATORIUM PENYAKIT INFEKSI SALURAN NAFAS

 BAHAN PEMERIKSAAN:

Infeksi saluran nafas bagian Atas : apusan tenggorok, darah

Infeksi nafas bagian bawah:• Sputum• Bilas bronchus

24/02/2010 6

1. Preparat langsung dari sputum atau bilas bronchus yang diwarnai Gram dan/atau tahan asam.

2. Isolasi dan identifikasi:Bentuk dan sifat koloniBentuk & sifat pewarnaanSifat-sifat biokimia.

3. Tes Kepekaan antibiotik

TAHAPAN PEMERIKSAAN LABORATORIUM UNTUK MENDIAGNOSIS PENYAKIT INFEKSI

SALUTAN NAFAS

LABORATORY EXAMINATION

24/02/2010 8

24/02/2010 9

Mycobacterium tuberculosis

Karakteristik : 1.Berbentuk batang lurus atau agak bengkok dengan ukuran 0,2 - 0,4 x 1 - 4 um.2.Tumbuh lambat, koloni tampak setelah lebih kurang 2 minggu bahkan stelah 6-8 minggu3.Suhu optimum 35-37°C, tidak tumbuh pada suhu 25°C atau lebih dari 40°C.4.Tidak tahan panas dan sinar UV, akan mati pada 6°C selama 15-20 menit5.Biakan dapat mati jika terkena sinar matahari langsung selama 2 jam.6.Bakteri Tahan asam7.Bersifat non motil, non spora, non kapsul8.Tidak dapat tumbuh pada medium kultur biasa hanya pada enriched media egg-based, yaitu LOWENSTEIN JENSEN MEDIUM (LJ), KUDOH, OGAWA, and BACTEC9.Obligatif aerob, 10.Dinding M. tuberculosis sangat kompleks, terdiri dari lapisan lemak cukup tinggi (60%). Penyusun utama dinding sel M. tuberculosis ialah asam mikolat, lilin kompleks complex-waxes), trehalosa dimikolat yang disebut cord factor, dan mycobacterial sulfolipids yang berperan dalam virulensi.

24/02/2010 10

Cont. Karakteristik Mycobacterium tuberculosis

11. Produksi niasin (+)12. Tidak bersifat endotoksin maupun eksotoksin13. Replikasinya spectrum luas : bisa dormant14. Membutuhkan waktu 18 jam untuk menggandakan diri15. Dapat bertahan hidup pada sputum yang kering16. Sulit dibedakan gram +/-17. Penyebaran : hematogenik18. Manifestasi klinis tidak spesifik

TB droplet nuclei

04/17/23 11

KONSENTRAT SPUTUM

• Sputum konsentrat : sputum yang telah dihilangkan bahan-bahan lain yang ada di dalamnya dengan tujuan bakteri tahan asam lebih mudah dideteksi

24/02/2010 12

NO SPUTUM BIASA SPUTUM KONSENTRAT

1 LEUKOSIT + -

2 BAKTERI LAIN + -

3 CARA B’KELOMPOK : MENYEBAR (4-5 SEL)

KOLONI (>10 SEL)

KONSENTRAT SPUTUM

Disediakan• Sputum penderita batuk khronis• Larutan dekontaminan yang terdiri dari

campuran: 25 ml NaOH 4%, 25 ml sodium citrate, dan 250 mgr N-Acethyl-L-cystein.

• Larutan buffer (Phosphat Buffer Saline = PBS) atau aqaudest yang steril

• Tabung reaksi bertutup sekrup• Vorteks• Sentrifus

24/02/2010 13

KONSENTRAT SPUTUM

Cara mengerjakan• Campurkan sama banyak larutan dekontaminan dengan sputum

dalam tabung bertutup sekrup.• Vorteks sampai merata selama 10 detik,• Biarkan selama 15 menit pada suhu kamar,• Lalu encerkan 18 kali dengan phosphat buffer saline atau aqaudest

steril.• Sentrifus dengan kecepatan 3000 g selama 30 menit pada suhu 4oC,• Buang supernatannya dan resuspensikan endapannya dengan 1 ml

larutan buf-fer atau aquadest steril, dan campur baik-baik dengan vorteks selama 30 detik

• bagian supernatan inilah yang dipakai untuk pembuatan preparat atau untuk biakan.

24/02/2010 14

Komposisi Media Löwenstein-Jensen

• -asparagin, KH2PO4,Mg sitrat, Mg sulfat, gliserin

• -putih telur ayam/bebek• -malakhit hijau steril 2%

24/02/2010 15

MEDIUM LOWENSTEIN JENSEN

MEDIUM LOWENSTEIN JENSEN

• Koloni pada Media Löwenstein-Jensen akan tampak pertumbuhan dalam waktu 3−4 minggu berwarna putih kekuning-kuningan, permukaan kering, kasar (tidak licin) dan rapuh dengan tepi yang tidak beraturan (seperti bunga kol). Tepi : bergerigi

24/02/2010 16

PEWARNAAN GRAM DAN TAHAN ASAM

24/02/2010 17

PEWARNAAN GRAM

Tujuan• Melihat bentuk (morfologi ) bakteri • Melihat reaksi/sifat pewarnaan Gram dari bakteri.

Disediakan 1. Preparat hapus sputum. 2. Biakan bakteri A pd agar miring3. Biakan bakteri B pd agar miring4. Satu buah kaca benda 5. NaCl 0,9% steril.6. Satu set zat warna Gram.

Cara kerja

1. Kaca benda 2 bagi atas A dan B.

2. Buat preparat tipis dan rata bakteri A pd A, dan bakteri B pd bgn B

3. Keringkan dan fiksasi.

Kaca benda 2

A B

Cara kerja

4. Kaca benda/preparat 1 dan 2 mendatar di atas rak preparat,

5. Tuangi kristal violet → 1-2 menit.

Cara kerja6. Buang zat warna, dan

bilas

7. Tetesi lugol → 30 detik.

8. Buang lugol dan bilas.

9. Lunturkan dgn alkohol 96% dan segera bilas.

Cara kerja10. Tetesi air fuchsin → 2 menit.

11. Buang zat warna dan bilas.

Cara kerja12. Periksalah di bawah mikroskop 13. Gambarkan apa yang anda lihat !14. Buat kesimpulan hasil pewarnaan: - Warna Bakteri positif-Gram - Warna bakteri negatif-Gram - Warna sitoplasma sel - Warna inti sel - Warna latar belakang

Hasil pewarnaan Gram

PEWARNAAN TAHAN ASAM

Tujuan

Untuk melihat dan sifat tahan asam dari bakteri.

Metode

1. Ziehl-Neelsen

2. Modifikasi Kinjoun (metode Tanzil)

1. Metode Ziehl-NeelsenDisediakan

1. Preparat hapus dari Sputum penderita 1 yang sudah difiksasi.

2. Satu set bahan bahan pewarnaan Ziehl-Neelsen, yang terdiri dari:

- Larutan karbol fuchsin

- Alkohol Asam

- Larutan methylen blue

3. Satu obor kecil yang terdiri dari kapas yang dipintal pada ujung satu kawat.

4. Spiritus

Cara kerja

1. Letakkan preparat mendatar pada rak pewarnaan,

2. Tuangi seluruh kaca benda karbol fuchsin.

3. Panasi zat warna → menguap, dinginkan dan panasi lagi. (3 kali dlm 10’)

4. Cuci dengan air mengalir.

Cara kerja

5. Lunturkan dengan alkohol asam 3%. Pelunturan dilakukan sampai preparat nampak berwarna merah muda.

6. Segera cuci dengan air mengalir.

7. Beri zat warna kontras, yaitu larutan methylen blue 0,5%, selama 1 menit.

8. Cuci dengan air mengalir.

2. Metode Tanzil (Modifikasi Kinyoun)

Disediakan

1. Sputum penderita 2

2. Satu set bahan untuk pewarnaan modifikasi Kinyoun, yang terdiri dari :• Larutan Kinjoun (Carbol fuchsin)

• Larutan Gabbet, yang terdiri dari: Methylen blue dan alkohol asam

Cara kerja

1. Letakkan kedua preparat diatas rak pewarnaan 2. Tuangi larutan Kinyoun → 3- 5 menit.3. Buang zat warna dan bilas .4. Lunturkan dengan alkohol asam → semua zat warna

larut. 5. Segera bilas, dan keringkan

Cara kerja6. Tuangi preparat dengan Methylen blue → 3 menit.

7. Bilas dan keringkan.

8. Lihat di bawah mikroskop dengan pembesaran emersi , dan gambarkan morfologi serta tuliskan bentuk dan sifat pewarnaan dari sel bakteri serta latar belakang preparat.

04/17/23 32

Hasil Pewarnaan Tahan Asam

24/02/2010 35

Klebsiella pneumoniae

1.Gram negatif yang berbentuk batang (basil).2.Bersifat non motil3.fakultatif an aerob4.memfermentasikan laktosa5.Indol (-)6.Dapat mereduksi nitrat7.banyak ditemukan di mulut, kulit, dan sal usus, namun habitat alami dari Klebsiella pneumonia adalah di tanah8.Dapat menyebabkan penyakit karena mempunyai dua tipe antigen pada permukaan selnya:

• Antigen OAntigen O adalah lipopolisakarida yang terdapat dalam sembilan varietas.• Antigen KAntigen K adalah polisakarida yang dikelilingi oleh kapsula dengan lebih dari 80 varietas.

24/02/2010 37

TSI (Triple Sugar Iron) Test• Measures capability for gas

(clear area) or hydrogen sulfide (H2S black) production from fermentation of the carbohydrates glucose, sucrose, and lactose

• Red=Alkaline and only glucose fermenter

• Yellow=Acidic and ferments all three sugars

• A=Proteus mirabilis• B=Salmonella sp.• C=E. Coli

SIM (Sulfide Indole Motility) Test• Measures ability to produce

H2S (black), Indole from tryptophan metabolism (red), and motility through spreading of inoculum

• 1=K. pneumoniae• 2=E. coli• 3=P. vulgaris• 4=E. aerogenes

H2S Production in SIM

• How to Perform Test: Stab SIM media with inoculating needle.

• Property it tests for: This test is used to help differentiate species of the family Enterobacteriaceae. This test is used to determine the ability to reduce sulfur into H2S.

• Media and Reagents Used: SIM media contains the sulfur containing amino acid, cysteine, sodium thiosulfate, & peptonized iron or ferrous sulfate.

• Reading Results: H2S will react with the iron or ferrous sulfate and produce a black precipitate. A positive result has a black precipitate present and a negative result has no black precipitate.

Motility Test

• How to Perform Test: Stab motility media with inoculating needle.

• Property it tests for: This test is done to help differentiate species of bacteria that are motile.

• Media and Reagents Used: Motility media contains tryptose, sodium chloride, agar, and a color indicator.

• Reading Results: If bacteria is motile, there will be growth going out away from the stab line, and test is positive. If bacteria is not motile, there will only be growth along the stab line. A colored indicator can be used to make the results easier to see.

Methyl Red/Voges Proskauer (MR/VP)

• How to Perform Tests: Inoculate 2 glucose broths with inoculating loop. After 48 hours of incubation, add a few drops of MR to one tube, and VP reagents to the other tube.

• Properties they test for: Both tests are used to help differentiate species of the family Enterobacteriaceae. – MR—tests for acid end products from glucose fermentation. – VP—tests for acetoin production from glucose fermentation.

• Media and Reagents Used: – Glucose Broth– Methyl Red indicator for acid– Voges Proskauer reagents—A: 5% Alpha-Naphthol, & ethanol,

B: Potassium Hydroxide, & Deionized Water.

MR/VP continued

• Reading Results: – MR— a + result is red (indicating pH below 6) and a – result is yellow

(indicating no acid production)

– VP—A + result is red after VP reagents are added (indicating the presence of acetoin) and a – result is no color change.

Methyl Red: left – and right + VP: left + and right –

Citrate

• How to Perform Test: Inoculate slant with inoculating loop.

• Property it tests for: This test is used to help differentiate species of the family Enterobacteriaceae. It is selective for bacteria that has the ability to consume citrate as its sole source of carbon and ammonium as sole nitrogen source.

• Media and Reagents Used: Simmon’s Citrate Agar contains sodium citrate (carbon source), ammonium ion (nitrogen source), & pH indicator—bromthymol blue.

• Reading Results: – A + result is blue (meaning the bacteria metabolised citrate and

produced an acid end product) and a – result remains green

Citrate

Left positive and right negative.

Urea Hydrolysis

• How to Perform Test: Inoculate Urea broth with inoculating loop.

• Property it tests for: This test is done to determine a bacteria’s ability to hydrolyze urea to make ammonia using the enzyme urease.

• Media and Reagents Used: Urea broth contains a yeast extract, monopotassium phosphate, disodium phosphate, urea, and phenol red indicator.

• Reading Results: Urea broth is a yellow-orange color. The enzyme urease will be used to hydrolyze urea to make ammonia. If ammonia is made, the broth turns a bright pink color, and is positive. If test is negative, broth has no color change and no ammonia is made.

Sugar Fermentation Tests

Tube 1: Negative acid /Negative gasTube 2A: Must incubate longer (ambiguous result)Tube 2B: Positive acid /Negative gasTube 3A: Positive acid/ Positive gas

Lactose Fermentation

• How to Perform Test: Inoculate lactose broth with inoculating loop.

• Property it tests for: This tests for the bacteria’s ability to ferment lactose.

• Media and Reagents Used: Lactose broth contains beef extract, gelatin peptone, and lactose. A phenol red indicator is added to indicate acid production from fermentation.

• Results– A positive result is yellow after indicator is added (indicating

lactose fermentation)– A negative result will have no color change or will be redish.

Sucrose Fermentation

• How to Perform Test: Inoculate sucrose broth with inoculating loop.

• Property it tests for: This test is done to help differentiate species of the family Enterobacteriaceae. This tests for the bacteria’s ability to ferment sucrose and production of acid end-product

• Media and Reagents Used: Sucrose broth contains beef extract, gelatin peptone, and sucrose. Phenol red indicator is added to indicate an acid end-product.

• Results– A positive result is yellow after indicator is added (indicating

sucrose fermentation)– A negative result has no color change or is reddish.

Glucose Fermentation & Gas Production

• How to Perform Test: Inoculate broth with inoculating loop.• Property it tests for: This test is done to help differnetiate

species of the family Enterobacteriaceae. This tests for the bacteria’s ability to ferment glucose and produce gas and/or an acid end-product..

• Media and Reagents Used: Glucose broth contains beef extract, gelatine peptone, and glucose. A phenol red indicator is added to indicate an acid enproduct. A Durham tube is added to indicate gas production.

• Results– A positive result for acid is yellow after indicator is added

(indicating glucose fermentation)– A positive result for gas is a bubble in the Durham tube.– A completely negative result has no color change or reddish

color and no bubble.

Antibiotic Susceptibility Testing• Provide rapid and reliable guidance on antimicrobial

chemotherapy • Choice of drug is not solely dependent on the result• Significant pathogen• Pure culture• Sensitivity pattern cannot be

predicted• Rationalisation of the antimicrobial

agents stock list

‘Simple identification with enough antibiotic sensitivity data’

KEPEKAAN ANTIBIOTIK

• Lakukan pengukuran diameter zona jernih di sekitar disc antibiotik (zona inhibisi) dan bandingkan tabel rujukan untuk menentukan interpretasinya.

SIAP RESPON!!!

24/02/2010 55

TULIS NAMA, NIM,

KELOMPOK, ASISTEN

24/02/2010 56

1. Tuliskan karakteristik (min.5) dari :

a. Mycobacterium tuberculosis

b. Klebsiella pneumoniae

24/02/2010 57

2. a. Sebutkan 4 nama medium untuk mengkultur bakteri Mycobacterium tuberculosis

b. Apa komposisi yang terdapat pada medium Lowenstein jensen, dan jelaskan bagaimana penampakan bakteri yang tumbuh pada medium tsb

24/02/2010 58

3. Sebutkan Perbedaan dari sputum biasa dan sputum konsentrat

24/02/2010 59

4. a. Sebutkan reagen yang dibutuhkan untuk pewarnaan tahan asam

b. Bagaimana interpretasi pada pewarnaan tahan asam

24/02/2010 60

5. a. Sebutkan contoh bakteri penyebab infeksi saluran pernafasan (min.3)

b. Sebutkan tahapan pemeriksaan laboratorium untuk mendiagnosis penyakit infeksi saluran nafas

24/02/2010 61