analisis toksisitas membran scaffold kitosan rgd …

ANALISIS TOKSISITAS MEMBRAN SCAFFOLD KITOSAN

RGD CANGKANG KEPITING TERHADAP SEL PULPA GIGI

MANUSIA Tri Kurnia Dewi1

1. Departemen Biologi Oral, Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas

Indonesia

Email: [email protected]

ABSTRAK

Pendahuluan:BATAN telah membuat membran scaffold kitosan RGD cangkang kepiting (SKRCK) dan membran scaffold kitosan cangkang kepiting (SKCK). Pembuatan SKRCK dan SKCK dalam bentuk membran bertujuan untuk mengatasi kasus one wall defect akibat periodontitis. Penambahan RGD bertujuan untuk meningkatkan perlekatan sel pada scaffold. Scaffold harus bersifat biocompatible (tidak toksik). Tujuan:Menganalisis toksisitas membran SKRCK terhadap sel pulpa gigi manusia. Metode:Sel pulpa gigi manusia dikultur selama 5 hari. Setelah itu kelompok perlakuan dipapar membran SKRCK dan membran SKCK (kontrol). Kemudian diinkubasi selama 24 jam. Hasil Penelitian:Nilai rerata viabilitas (%) sel pulpa gigi manusia pada kelompok SKRCK 1mg dan 2mg adalah 315,9 dan 298,9, sedangkan pada kelompok SKCK 1mg, dan 2mg adalah 514,7 dan 520,8. Kesimpulan:SKRCK tidak toksik terhadap sel pulpa gigi manusia.

ABSTRACT

Toxicity Analysis of Crab Shells Chitosan RGD Scaffold Membrane on Human Dental Pulp Cells

Introduction: BATAN has made crab shells chitosan RGD scaffold membrane (SKRCK) and crab shells chitosan scaffold membrane (SKCK). SKRCK and SKCK made in the form of a membrane aims to solve the case of one wall defects due to periodontitis. The addition of RGD aims to enhance cell attachment to the scaffold. The scaffold should be biocompatible (non-toxic). Objective:To analyze the toxicity of SKRCK membrane on human dental pulp cells. Methods:The human dental pulp cells were cultured for 5 days. After that the treatment group was exposed to the SKRCK membrane and membrane SKCK (control). Then incubated for 24 hours. Results: The mean viability (%) of human dental pulp cells in group 1mg and 2mg SKRCK was 315.9 and 298.9, whereas in the group

Analisis toksisitas ..., Tri Kurnia Dewi, FKG UI, 2016

Universitas Indonesia

SKCK 1mg and 2mg is 514.7 and 520.8. Conclusion: SKRCK did not give toxic effects on human dental pulp cells. Keywords: crab shells chitosan, scaffold, RGD, toxicity, human dental pulp cells Pendahuluan

Kerusakan tulang dapat disebabkan akibat trauma, infeksi jaringan

periodontal, tumor, kista, dan kelainan tumbuh kembang. Salah satu penyebab

kerusakan tulang yang sering terjadi adalah akibat penyakit periodontal atau

periodontitis. Hal tersebut dapat mempengaruhi kualitas hidup seseorang.1,2

Terdapat beberapa perawatan untuk mengatasi kasus kerusakan tulang, salah

satunya dengan menggunakan bone graft. Penggunaan bone graft memerlukan

prosedur bedah untuk mentransplantasikan bone graft pada tulang yang

mengalami kerusakan. Salah satu sumber bone graft yang dapat digunakan berasal

dari jaringan tubuh pasien sendiri (autograft). Namun, perawatan bone graft yang

menggunakan autograft memiliki beberapa kekurangan antara lain sulit

mendapatkan cukup tulang untuk ditransplantasikan dan timbulnya rasa nyeri

karena pembedahan ganda akibat pengambilan bone graft, sehingga tidak dapat

digunakan pada kasus kerusakan tulang yang luas. Selain autograf, material lain

yang dapat digunakan berasal dari jaringan spesies lain (xenograft). Namun,

xenograf memiliki resiko tinggi, yaitu terjadi reaksi imun yang tidak diinginkan

dan penularan penyakit.2

Beberapa tahun terakhir rekayasa jaringan telah banyak dikembangkan

untuk memperbaiki, menggantikan sebagian atau keseluruhan jaringan yang

mengalami kerusakan.3 Terdapat tiga komponen penting dalam rekayasa jaringan,

yakni growth factor atau sinyal molekul, stem cell, dan scaffold. Growth factor

atau sinyal molekul adalah faktor transkripsi yang berasal dari aktivasi gen selama

proses rekayasa jaringan.4 Stem cell adalah sel yang belum mengalami diferensiasi

menjadi tipe sel khusus serta memiliki aktivitas proliferasi yang tinggi akibat

pengaruh sinyal molekul tertentu sehingga dapat digunakan untuk regenerasi

jaringan yang rusak.5 Sumber adult stem cell dapat ditemukan pada gigi, salah

satunya berasal dari sel pulpa gigi manusia. Stem cell dari sel pulpa gigi manusia

memiliki kemampuan osteogenik.6 Scaffold berfungsi sebagai matriks



ekstraseluler sementara untuk perlekatan antar sel, proliferasi sel dan diferensiasi

sel untuk membentuk jaringan baru sesuai yang diinginkan. Berdasarkan

biomaterial penyusunnya scaffold diklasifikasikan menjadi protein-based

material, polysaccharide-based materials, dan artifical polymers. Salah satu

polysaccharide-based materials adalah kitosan.

Sumber kitosan didapat dari hewan krustasea seperti kepiting. Menurut data

Badan Pusat Statistik pada tahun 2014, nilai ekspor kepiting Indonesia mencapai

92.030,7 ton.7 Kepiting diekspor dalam bentuk beku tanpa cangkang, sehingga

produk samping berupa cangkang berkisar 25-50% dari total berat kepiting.8

Cangkang kepiting mengandung senyawa kitin sebanyak 70%.9 Kitosan adalah

derivat biopolimer dari kitin yang dapat digunakan sebagai material scaffold untuk

regenerasi tulang serta memiliki kemampuan osteoinduksi, biokompatibel,

biodegradable dan mampu mendeposisi matriks mineral tulang.10 Namun,

scaffold kitosan kurang memiliki sinyal bioaktif untuk perlekatan sel, proliferasi

sel dan diferensiasi sel.11 Oleh karena itu, perlu adanya peningkatkan kemampuan

perlekatan sel pada scaffold. Untuk mengatasi kekurangan scaffold kitosan perlu

adanya penambahan molekul bioaktif pada scaffold kitosan, salah satu molekul

bioaktif yang dilaporkan berkhasiat untuk meningkatkan respon sel pada

biomaterial yang memiliki keterbatasan kemampuan bioaktifitas adalah arginine-

glycine-aspartic acid (RGD).12

RGD adalah salah satu peptida adhesif yang berada pada protein matriks

ekstraseluler serta dapat digunakan untuk interaksi molekul. RGD juga dapat

ditemukan pada laminin dan kolagen. RGD akan mengenali integrin spesifik agar

RGD dapat bertindak sebagai perantara perlekatan sel spesifik terhadap scaffold

kitosan.13 Oleh karena itu, penambahan RGD pada scaffold kitosan diharapkan

dapat meningkatkan perlekatan sel terhadap scaffold kitosan.

Pada teknik rekayasa jaringan, stem cell diletakkan pada scaffold yang

berfungsi sebagai matriks ekstraseluler sementara untuk memfasilitasi perlekatan

sel, proliferasi, dan diferensiasi yang selanjutnya akan membentuk jaringan baru.3

Kitosan sebagai scaffold terdapat dalam berbagai bentuk sediaan. Salah satunya

berbentuk membran. Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN) telah membuat

kitosan dari cangkang kepiting dalam bentuk membran yang ditambahkan RGD



untuk mengatasi kelainan jaringan periodontal yang disertai kegoyangan gigi

terutama pada kasus kerusakan tulang one-wall defect. Aplikasi dari membran

scaffold kitosan dalam bentuk membran akan menyelimuti area kerusakan tulang

sehingga meminimalisir terjadinya pergerakan dan perpindahan scaffold kitosan.

Penambahan RGD diharapkan dapat meningkatkan perlekatan sel terhadap

scaffold kitosan. Namun, belum ada uji biokompatibilitas pada membran scaffold

kitosan RGD cangkang kepiting. Uji tersebut digunakan untuk mengetahui apakah

bahan uji dapat diterima oleh jaringan tubuh. Salah satu uji biokompatibilitas

adalah uji toksisitas.14

Analisis toksisitas digunakan untuk mengevaluasi respon sel dan jaringan

terhadap suatu biomaterial dengan mengukur sitotoksisitas material, serta analisis

toksisitas merupakan faktor penting dalam menentukan keberhasilan suatu

biomaterial. Suatu material dapat dikatakan bersifat toksik apabila setelah paparan

bahan uji, sel mengalami lisis atau terjadi penurunan proliferasi sel.15 Analisis

toksisitas scaffold kitosan RGD cangkang kepiting dilakukan menggunakan uji

viabilitas terhadap stem cell. Berdasarkan uraian di atas, penulis tertarik untuk

melakukan penelitian mengenai toksisitas pada membran scaffold kitosan RGD

cangkang kepiting produksi BATAN terhadap viabilitas sel pulpa gigi manusia

dengan uji MTT.

Tinjauan Teori

Terdapat tiga komponen utama dalam rekayasa jaringan, yaitu stem cell,

scaffold dan growth factor. Ketiga komponen tersebut bergabung membentuk

jaringan atau organ baru yang memiliki fungsi, struktur, dan sifat mekanis yang

sama atau lebih baik dari jaringan yang digantikannya.13 Scaffold adalah material

yang menyediakan matriks ekstraselular sementara untuk infiltrasi yang dapat

mendukung akitivitas sel. Berdasarkan sumbernya, scaffold dapat berasal dari

bahan alami, bahan sintetik, dan bahan keramik, dimana scaffold dapat

mengandung beberapa jenis faktor pertumbuhan untuk merangsang perlekatan sel,

migrasi dan proliferasi.15 Bahan sintetik dapat berasal dari polystrene, poly-l-

lactic acid (PLIA) dan polyglycolic acid (PGA). Bahan alami dapat berasal dari



kolagen, proteoglycans, alginate-based substate, dan kitosan. Bahan keramik

dapat berasal dari hidroksiapatit (HA) dan tri-calcium phosphat.16,17

Scaffold yang ideal harus memiliki karakteristik antara lain biocompatible,

mikrostruktur, biodegradible, porositas yang baik dengan ruangan yang saling

berhubungan untuk infiltrasi seluler, kemampuan menahan air, transfer nutrisi,

neovaskularisasi, dan adanya ruang untuk jaringan tulang yang baru tumbuh.3,13

Kitin dapat ditemukan di exoskeleton krustasea, seperti kepiting, udang,

serta dinding sel basil. Kitosan diperoleh dengan deasetilasi basa dari kitin.

Deasetilasi kitin dilakukan dengan hidrolisis kimia.3 Kitosan membentuk

kompleks larutan dengan molekul jaringan ikat seperti kolagen dan

glikosaminoglikan untuk membentuk struktur berpori tiga dimensi yang saling

berhubungan. Kitosan ini mampu membawa agen aktif biomolekul dan faktor

pertumbuhan.20 Kitosan memiliki sifat tidak toksik, tidak memberikan efek

antigenik, biocompatible, biodegradable, anti tumor dan anti bakterial.13 Kitosan

terdapat dalam berbagai bentuk sediaan untuk diaplikasikan dalam bidang

kedokteran dan kedokteran gigi seperti bubuk, hydrogel, fiber, membran dan

butiran.10 Aplikasi kitosan yang luas pada berbagai bidang bukan hanya karena

sumber kitosan yang melimpah di alam akan tetapi karena kitosan sangat

biocompatible dan efektif digunakan diberbagai aplikasi.21

Stem cell menjadi bagian yang sangat penting dalam regenerasi jaringan.

Stem cell ialah sel yang belum terspesialisasi serta memiliki aktivitas proliferasi

yang tinggi dan dapat diferensiasi menjadi tipe sel tertentu. Aktivitas seluler sel

dikontrol oleh faktor pertumbuhan atau sinyal molekul, yakni protein yang

mengikat reseptor membran spesifik dan memicu serangkaian jalur sinyal molekul

lain untuk mengatur aktivitas seluler sel. Molekul tersebut berperan sangat

penting selama perkembangan sel, sehingga stem cell dapat meregenerasi seluruh

jaringan.5 Contoh sinyal molekul untuk regenerasi tulang adalah bone

morphogenetic protein (BMP) dan transforming growth factor-b (TGF-b), sinyal

molekul tersebut dapat merangsang mesenkimal stem cell untuk berdiferensiasi

menjadi osteoblas dan selanjutnya membentuk tulang baru.

Salah satu sumber dari stem cell dapat ditemukan pada gigi, yakni dental

pulp stem cells (DPSCs). Pada uji in vitro DPSCs tikus mampu diferensiasi



menjadi odontoblast, osteoblast, adiposit, kondrosit, mioblast dan neuronal sel,

sedangkan uji in vivo pada tikus menunjukkan kemampuan diferensiasi menjadi

komplek dentin pulpa.32 Pada penelitian sebelumnya telah membuktikan bahwa

sel pulpa gigi yang mengandung DPSCs mampu proliferasi dan diferensiasi

membentuk odontoblast.33 Pada penelitian in vitro kultur DPSCs, dilaporkan

bahwa sel mampu berdiferensiasi menjadi sel osteoblast serta pada in vivo mampu

berdiferensiasi menjadi sel odontoblas.34 Penelitian lain, DPSCs yang ditanamkan

pada dentin manusia dan diimplantasikan ke immunocompromised tikus,

menunjukkan adanya struktur dentin reparatif pada permukaan dentin. Pada

penelitian in vivo, DPSCs mampu membentuk jaringan seperti tulang pada in

vivo.28

Perlekatan sel pada scaffold merupakan hal penting pertama dalam

regenerasi jaringan sebelum terjadi proliferasi dan diferensiasi sel.35,36 Terdapat

empat tahapan adhesi sel: melekat, menyebar, membentuk sitoskeleton, dan

membentuk kontal lokal.35 Interaksi sel dan scaffold dapat ditingkatkan dengan cara modifikasi scaffold

menggunakan sinyal molekul.11 Pada awalnya bahan yang digunakan untuk meningkatkan

perlekatan sel adalah protein seperti fibronektin, kolagen, atau laminin. Namun,

penggunaan protein memiliki kelemahan, antara lain protein harus diisolasi dari

organisme lain dan dimurnikan sehingga dapat menimbulkan respon imun yang

tidak diinginkan. Penggunaan material yang dilapisi protein pada jangka panjang

tidak memungkinkan karena dapat menimbulkan risiko infeksi dan inflamasi serta

mempercepat degradasi protein. Oleh karena itu, perlu adanya material yang dapat

mengatasi masalah di atas. Peptida menunjukkan stabilitas yang lebih tinggi

terhadap kondisi sterilisasi, temperatur, pH yang bervariasi, dan penyimpanan.

Peptida yang dilaporkan memiliki kemampuan untuk meningkatkan adhesi pada

scaffold adalah RGD.37

Arginine-Glycine-Aspartic Acid (RGD) ialah salah satu peptida adhesif yang

berada pada protein matriks ekstraseluler, serta dapat digunakan untuk interaksi

molekul. RGD dilaporkan memiliki kemampuan sebagai perantara perlekatan

sejumlah tipe sel terhadap material, menjadi perantara interaksi sel osteoblast dan

mencegah kehilangan osteoklas, dan dapat meningkatkan perlekatan sel.35,36,38

Penambahan RGD menunjukkan bahwa penambahan biomaterial lain seperti



RGD dalam scaffold kitosan mampu meningkatkan sifat biologis dan mekanik

scaffold kitosan.3 Hal ini didukung pula pada penelitian lainnya yang melaporkan

bahwa penambahan komponen matriks ekstraselular seperti ECM protein adhesi

dan cell binding peptides dapat meningkatkan biokompatibilitas material

tersebut.12

Prinsip kerja RGD adalah integrin-binding dengan protein matriks

ekstraseluler seperti fibronektin, vitronektin, fibrinogen, thrombospondin,

osteopontin, dan sialoprotein.39 RGD akan mengekspresikan integrin spesifik

sehingga dapat mengontrol RGD untuk berikatan dengan sel ke RGD dan menjadi

perantara perlekatan sel spesifik pada scaffold. Integrin adalah reseptor untuk

adhesi sel yang akan berinteraksi dengan matriks ekstraseluler termasuk

fibronektin, laminin, kolagen, dan molekul lainnya. Integrin mengirim sinyal dua

arah yang disebut sinyal inside out dan sinyal outside in, yang terdiri dari subunit

α dan β, serta bergabung menjadi satu pasang membentuk ligan.12 Integrin yang

penting dalam regenerasi jaringan adalah αVβ3, αVβ5 dan αIIβb3.38

Analisis toksisitas merupakan hal yang penting untuk menguji biomaterial

baru sebelum biomaterial dimanfaatkan secara luas, seperti obat, kosmetik,

makanan dan lain sebagainya.40 Analisis toksisitas secara in vitro dapat

menggunakan uji phototoxicity, uji viabilitas sel, uji metabolik, uji survival, uji

sitotoksisitas, uji mutagenisitas dengan bakteri, dan uji mutagenisitas dengan

mamalia. Analisis toksisitas secara in vivo dapat dilakukan dengan observasi efek

setelah paparan biomaterial bahan uji seperti efek karsinogenik, efek terhadap

sistem syaraf pusat, efek terhadap toksisitas akut dan kronik.41

Kultur sel adalah salah satu alat utama yang digunakan dalam biologi seluler

dan molekuler, dan merupakan suatu model yang sangat baik untuk mempelajari

fisiologi normal, biokimia sel (misalnya, studi metabolisme, penuaan), efek dari

obat, senyawa toksik pada sel, mutagenesis dan karsinogenesis.40 Kultur sel

adalah pengambilan sel dari hewan, tumbuhan atau manusia yang selanjutnya

ditumbuhkan dalam lingkungan buatan (medium). Kultur primer ialah tahap

kultur setelah sel diisolasi dari jaringan asalnya, kemudian sel berproliferasi

hingga mencapai confluence. Setelah confluence sel-sel harus disubkultur

beberapa kali (1-5 kali) dengan memindahkan sel ke tempat dengan medium



pertumbuhan yang baru, agar tersedia lebih banyak ruang untuk pertumbuhan

selanjutnya.

Uji viabilitas sel adalah uji yang digunakan untuk mengetahui apakah bahan

uji memiliki efek terhadap proliferasi sel atau menunjukkan efek sitotoksik

langsung yang menyebabkan kematian sel. Ada berbagai metode pengujian yang

dapat digunakan untuk mengetahui viabilitas sel eukariotik antara lain tetrazolium

reduction (MTT, MTS, XTT dan WST-1), resazurin reduction, protease markers,

trypan blue dan deteksi ATP. Pengukuran MTT dilihat dari segi metabolisme sel

secara umum ataupun aktivitas enzimatik. Perbedaan MTT dengan MTS, XTT

dan WST-1 adalah MTT bermuatan positif dan mampu menembus sel sedangkan

MTS, XTT dan WST-1 bermuatan negatif dan tidak mampu menembus sel.41,44

Uji MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)

adalah uji viabilitas sel menggunakan 96-well plate.45 MTT ialah bahan kimia

yang berwarna kuning dan sensitif terhadap cahaya. Substrat MTT disiapkan

dalam larutan fisiologis, dipaparkan pada sel yang dikultur, biasanya konsentrasi

akhir 0,2-0.5mg/ml , selanjutnya diinkubasi selama 1 sampai 4 jam.44

Prinsip kerja dari uji MTT ialah mengukur aktivitas seluler dari aktivitas

enzim succinic dehydrogenase yang berada pada mitokondria sel hidup untuk

mereduksi garam tetrazolium. Nilai aktivitas seluler yang diukur akan berbanding

lurus dengan nilai optical density (OD) dan konsentrasi sel yang digunakan. Sel

yang hidup dengan metabolisme aktif akan mengkonversi MTT menjadi produk

formazan yang berwarna ungu. Ketika sel-sel mati, kehilangan kemampuan untuk

mengkonversi MTT ke formazan, sehingga pembentukan warna inilah yang

berfungsi sebagai penanda sel tersebut masih hidup atau tidak. Jumlah produk

formazan yang dihasilkan umumnya sebanding dengan jumlah sel hidup. Selain

melibatkan enzim succinic dehydrogenase, mekanisme seluler perubahan dari

MTT ke formazan juga dapat melibatkan reaksi dengan NADH atau mengurangi

molekul yang mentransfer elektron ke MTT.47

Produk formazan dari MTT terakumulasi sebagai endapan larut dalam sel,

di dekat permukaan sel dan media kultur. Formazan tersebut harus dilarutkan

sebelum dilakukan pembacaan nilai optical density dengan alat pembaca.



Berbagai metode telah digunakan untuk melarutkan produk formazan,

menstabilkan warna, menghindari penguapan, dan mengurangi gangguan oleh

fenol merah dan komponen media kultur lain. Berbagai metode pelarutan yang

dapat digunakan antara lain: acidified isopropanol, DMSO, dimetilformamida,

sodium dodecyl sulfate (SDS), dan kombinasi deterjen dan pelarut organik.44

Nilai optical density (OD) dari kristal formazan yang telah dilarutkan dibaca

menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 490nm. Nilai viabilitas

dapat dihitung atau dianalisis dengan membandingkan nilai OD kelompok

perlakuan dengan kelompok kontrol dikali 100% menggunakan rumus sebagai

berikut:24

Viabilitas sel (%) = !"#$" !"!#$# !" !"#$%&$# !"#$%&'%(!"#$" !"!#$# !" !"#$%&$# !"#$%"&

x 100%

Metode Penelitian

Kultur Sel Gigi manusia diperoleh dari gigi premolar satu atau molar tiga bawah

impaksi yang dicabut dari pasien di Rumah Sakit Gigi dan Mulut, Fakultas

Kedokteran Gigi, Universitas Indonesia. Gigi direndam dalam α-MEM komplit

yaitu mengandung penstrep, fungizone dan FBS. Selanjutnya gigi dicuci dengan

PBS yang mengandung antibiotik. Kemudian gigi dibungkus dengan kasa steril

lalu dipecahkan dengan pastle dan mortal, jaringan pulpa gigi diambil

menggunakan jarum ekstirpasi dan dikoleksi pada petry dish yang berisi α-MEM

tanpa serum. Jaringan pulpa dan medium dipindahkan pada tabung centrifuge

15ml, lalu disentrifugasi (2000rpm, 10 menit). Selanjutnya supernatan dibuang

dan pada pelet ditambahkan larutan kolagenase dispase 2ml, lalu inkubasi pada

inkubator CO2 (37ºC, 5% CO2) selama 1 jam (setiap 15menit sekali tabung

digoyang-goyangkan). Kemudian ditambahkan α-MEM komplit untuk

menghentikan kerja kolagenase dispase sebanyak 2ml, dan disentrifugasi

(2000rpm, 10 menit). Selanjutnya supernatan dibuang dan pada pelet ditambahkan

medium komplit. Pelet sel dilarutkan dalam medium dengan cara pipetting.

Kemudian jumlah sel dihitung pada hemocytometer dengan pewarnaan trypan

blue. Setelah dihitung sel pulpa gigi manusia sebanyak 106 dikultur dalam flask



25cm2 dengan medium komplit. Medium diganti setiap 2 hari sekali dan sel

dipanen setelah sel cukup tumbuh.

Panen sel dilakukan dengan cara sebagai berikut: medium dalam flask

dibuang, kemudian dicuci dengan PBS. Lalu ditambahkan tripsin EDTA sampai

semua sel pada dasar flask terendam. Kemudian diinkubasi pada inkubator CO2

(37ºC, 5% CO2) selama 5-7 menit. Selanjutnya ditambahkan medium komplit dan

sel dikoleksi pada tabung 15ml, lalu disentrifugasi (2000rpm, 10 menit). Setelah

disentrifugasi supernatan dibuang dan pada pelet sel ditambahkan 1ml medium

komplit. Setelah itu pelet sel dilarutkan dalam medium dengan cara pipetting.

Sebelum sel ditempatkan pada tempat yang baru, jumlah sel harus dihitung

menggunakan hemocytometer (gambar 2.6). Sel yang dihitung adalah sel hidup

yang tidak terwarnai oleh trypan blue, memiliki ciri-ciri jernih dengan dikelilingi

refractile ring. Sel yang mati akan terwarnai oleh trypan blue dan tidak memilki

refractile ring.

Prosedur penggunaan hemocytometer diawali dengan hemocytometer

dibersihkan dengan cara diusap alkohol 70%. Lalu dikeringkan dan coverslip

ditempatkan pada kamar hitung. Kemudian 10µl larutan sel yang akan dihitung

dimasukkan ke dalam kamar hitung. Hemocytometer ditempatkan pada mikroskop

pada pembesaran 10x. Kemudian akan terlihat tampilan grid dengan luas tiap grid

1mm2 (gambar 2.6). Jika sel yang ada <100mm2 maka satu atau lebih squares

disekitar central square dihitung. Namun jika sel yang ada >1000mm2 hitung sel

pada lima square diagonal pada central square hemacytometer.40

Rumus perhitungan sel:40

Jumlah sel = jumlah sel x 104 x berapa kali pengenceran x volume total

larutan sel

Uji Toksisitas dengan Uji MTT Toksisitas dianalisis menggunakan uji MTT (3–[4,5-dimethylthiazol-

2yl]−2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide). Uji MTT ini mengukur toksisitas sel

secara tidak langsung yaitu berdasarkan aktifitas enzim succinic dehydrogenase

pada sel hidup setelah dipapar bahan uji. Sel pulpa gigi manusia dengan densitas



2x104 diletakkan pada 96-well plate lalu di kultur selama 5 hari hingga mencapai

confluent, penggantian medium dilakukan setiap 2 hari sekali. Setelah itu

kelompok perlakuan dipaparkan membran scaffold kitosan cangkang kepiting

dengan RGD dan tanpa RGD (1mg dan 2mg). Kemudian diinkubasi pada

inkubator CO2 (37ºC, 5% CO2) selama 1 hari. Uji MTT dilakukan dengan

menambahkan 15 µl larutan MTT (5mg/ml) pada semua kelompok uji.

Selanjutnya diinkubasi pada inkubator CO2 (37ºC, 5% CO2) selama 3 jam.

Kemudian tambahkan acidfied isopropanol 150 µl pada tiap well dilanjutkan

dengan inkubasi selama 1 jam pada orbital shaker dengan temperatur ruang untuk

melarutkan kristal formazan. Nilai optical density (OD) sampel dibaca

menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 490nm. Data dikoreksi

dengan nilai kosong medium kultur tanpa sel. Setiap kelompok uji minimal duplo

dan percobaan diulang dua kali. Berikut rumus viabilitas sel:40

Viabilitas sel = !"#$" !"!#$# !"#$%&' !"#$%&' !"#$%&$! !"#$%&'%( !"#$" !"!#$# !"#$%&' !"#$%&' !"#$%&$! !"#$%"&

x 100%

Hasil Penelitian

Pada penelitian ini dilakukan analisis toksisitas membran scaffold kitosan

RGD cangkang kepiting terhadap sel pulpa gigi manusia dengan uji MTT. Sel

pulpa gigi manusia yang digunakan pada penelitian ini adalah sel pulpa gigi

manusia yang dikultur selama 5 hari pada passage 3-5 (Gambar 5.1). Bahan uji

kitosan yang digunakan 2 macam, yaitu membran scaffold kitosan RGD cangkang

kepiting dan membran scaffold kitosan cangkang kepiting tanpa RGD dengan

berat 1mg dan 2mg yang dipaparkan pada kultur sel pulpa gigi manusia lalu

diinkubasi selama 24 jam. Viabilitas sel pulpa gigi manusia dinyatakan dalam

persen terhadap kontrol. Kemudian uji beda antara kelompok dianalisis

menggunakan uji ANOVA.



Gambar mikroskopik sel pulpa gigi manusia yang dikultur selama 5 hari dengan

pembesaran 10x.

Persentase viabilitas sel pulpa gigi manusia pada kelompok kontrol dan

kelompok perlakuan

Pada uji normalitas dengan Kolmogrov-Smirnov menunjukkan bahwa %

viabilitas sel pulpa gigi manusia pada semua kelompok uji (data tabel pada

lampiran 3) memiliki distribusi normal (p>0,05). Kemudian uji beda antara

kelompok dianalisis menggunakan Uji ANOVA menunjukkan perbedaan

bermakna antara kelompok kontrol dengan semua kelompok perlakuan (p≤0,05).

Selanjutnya dilakukan uji post hoc tukey untuk mengetahui kemaknaan antar

kelompok kontrol dengan masing-masing kelompok perlakuan (gambar 5.2).

Hasil penelitian ini menunjukkan perbedaan bermakna antara kelompok

kontrol dengan kelompok scaffold kitosan RGD cangkang kepiting 1mg (p≤0,03).

Kontrol dengan kelompok scaffold kitosan RGD cangkang kepiting 2mg

menunjukkan perbedaan bermakna (p≤0,05). Hasil penelitian menunjukkan bahwa

dengan pemberian membran scaffold kitosan RGD pada sel pulpa gigi manusia

tidak menyebabkan penurunan viabilitas sel pulpa gigi manusia. Kontrol

dibandingkan dengan kelompok scaffold kitosan cangkang kepiting 1mg dan 2mg

menunjukkan perbedaan bermakna (p≤0.01). Dengan demikian, hipotesis pertama

34



yang menyatakan bahwa membran scaffold kitosan RGD cangkang kepiting tidak

bersifat toksik terhadap sel pulpa gigi manusia dapat diterima.

Gambar 5.2 Grafik perbandingan persentase viabilitas sel pulpa gigi manusia kelompok kontrol

terhadap kelompok perlakuan ((±=standar deviasi, *= p≤0,05,**= p≤0,03,***= p≤0,01,NS= not

significant)

Perbandingan persentase viabilitas sel (%) pulpa gigi manusia pada

kelompok perlakuan

Uji normalitas, Kolmogrov-Smirnov menunjukkan bahwa data tabel

distribusi pada lampiran 3 memiliki distribusi normal (p>0,05). Kemudian

dianalisis dengan uji ANOVA antara kelompok scaffold kitosan RGD cangkang

kepiting 1mg dan scaffold kitosan RGD cangkang kepiting 2mg, kelompok

scaffold kitosan RGD cangkang kepiting 1mg dan scaffold kitosan cangkang

kepiting 1mg, kelompok scaffold kitosan RGD cangkang kepiting 2mg dan

scaffold kitosan cangkang kepiting 2mg, serta kelompok scaffold kitosan

cangkang kepiting 1mg dan 2mg (gambar 5.3). Pada uji ANOVA menunjukkan

perbedaan bermakna (p≤0,05). Signifikansi (p≤0.05) hanya terdapat pada antar

kelompok scaffold kitosan cangkang kepiting RGD (1mg dan 2mg) dengan

kelompok scaffold kitosan cangkang kepiting tanpa RGD (1mg dan 2mg).

100.133

315.997 298.996

514.732 520.833

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Kontrol KitosanRGD1mg KitosanRGD2mg Kitosan1mg Kitosan2mg

Viab

ilitass

el(%

)

***

**

*

***



Sedangkan untuk kelompok perlakuan yang sama antara 1mg dan 2mg, viabilitas

sel pulpa gigi manusia tidak menunjukkan perbedaan bermakna. Dengan

demikian, hipotesis kedua yang menyatakan membran scaffold kitosan RGD

cangkang kepiting tidak memberikan efek yang berbeda bermakna dibandingkan

dengan membran scaffold kitosan cangkang kepiting tanpa RGD terhadap

viabilitas sel pulpa gigi manusia tidak dapat diterima.

Gambar 5.3 Grafik perbandingan persentase viabilitas sel pulpa gigi manusia pada

kelompok perlakuan (±=standar deviasi, *= p≤0,05,**= p≤0.03,***= p≤0.01, NS= not significant)

Pembahasan

Pada kerusakan tulang yang besar khususnya pada kasus one wall defect

akibat periodontitis, cara perawatan bone graft kurang efektif digunakan karena

memiliki kekurangan antara lain keterbatasan tulang dan respon imun yang

ditimbulkan.2 Beberapa tahun terakhir rekayasa jaringan telah banyak

dikembangkan untuk mengatasi kerusakan tulang yang besar.50 Untuk mengatasi

defek tulang yang terlokalisir diperlukan scaffold yang memiliki perlekatan

adekuat dengan jaringan disekitarnya. Oleh karena itu, scaffold dibentuk dengan

bentuk sediaan membran agar dapat melapisi tulang yang mengalami kerusakan

315.997 298.996

514.732 520.833

0

100

200

300

400

500

600

700

800

KitosanRGD1mg KitosanRGD2mg Kitosan1mg Kitosan2mg

Via

bilit

as se

l(%)

**NS

NS

*



serta meminimalisir terjadinya pergerakan dan perpindahan scaffold. Kitosan

dapat digunakan sebagai scaffold karena memiliki sifat biocompatible,

biodegredable, tidak toksik, anti bakterial dan anti tumor.51 Namun scaffold

kitosan kurang memiliki sinyal bioaktif untuk perlekatan sel.11 Oleh karena itu,

untuk mengatasi kekurangan tersebut perlu adanya penambahan molekul bioaktif

pada scaffold kitosan. Salah satu molekul bioaktif yang dilaporkan berkhasiat

untuk meningkatkan perlekatan sel pada biomaterial adalah arginine-glycine-

aspartic acid (RGD).12 RGD akan mengenali integrin spesifik agar RGD dapat

bertindak sebagai perantara perlekatan sel spesifik pada scaffold kitosan.13

Biokompatibilitas suatu scaffold merupakan syarat penting yang harus

dimiliki oleh suatu scaffold. Uji toksisitas sel adalah suatu cara untuk mengetahui

biokampatibilitas suatu scaffold dan penting dilakukan untuk mengetahui respons

sel dan jaringan terhadap suatu biomaterial. Pada penelitian ini, uji

biokompatibilitas dilakukan menggunakan metode kultur sel yang dipapar bahan

uji secara langsung. Bahan uji dipapar langsung pada sel karena scaffold bersama

stem cell akan berkontak secara langsung dengan jaringan langsung pada saat

ditransplantasikan pada daerah yang mengalami kerusakan.15 Analisis toksisitas

dilakukan dengan menggunakan uji viabilitas berdasarkan uji MTT terhadap sel

pulpa gigi manusia. Sel pulpa gigi manusia dipilih karena pada penelitian

sebelumnya telah menunjukkan bahwa jaringan gigi manusia mengandung stem

cell atau biasa disebut dengan DPSCs.29 DPSCs bersifat multipoten dan mampu

berdiferensiasi menjadi odontoblas, osteoblast, adiposit, kondrosit, mioblast dan

neuronal sel. Oleh karena itu, DPSCs dapat digunakan pada rekayasa jaringan

untuk mengatasi defek tulang yang besar.35

Sel pulpa gigi manusia dikultur selama lima hari pada 96 well plate sebelum

dipapar dengan bahan uji. Pada hari ke-5 kultur sel pulpa gigi manusia mengalami

fase log dan sel telah membentuk monolayer pada wadah kultur. Fase log adalah

periode peningkatan eksponensial jumlah sel setelah fase lag maka sel akan

mengakhiri satu atau dua population doubling setelah confluent tercapai. Pada

fase log terjadi proliferasi tertinggi sel hingga mencapai 90-100% dan pada tahap

ini kultur mencapai tingkat reproduksi paling tinggi. Fase log merupakan waktu

38



optimal untuk dilakukan uji karena populasi sel memiliki tingkat keberagaman

yang sama dan tingkat viabilitas sel yang tinggi.42

Pada penelitian ini didapatkan persentase viabilitas sel pulpa gigi manusia

(%) terhadap kontrol pada semua kelompok perlakuan lebih tinggi dibandingkan

kelompok kontrol (gambar 5.2). Hal ini menunjukkan bahwa paparan bahan uji

tidak menurunkan viabilitas sel pulpa gigi manusia. Hal ini diperkuat dengan

beberapa penelitian lain tentang pengaruh membran scaffold kitosan RGD

maupun tanpa RGD. Pada penelitian yang dilakukan Nidia 2016 (belum

dipublikasikan) yang menggunakan membran scaffold kitosan RGD cangkang

kepiting dan membran scaffold kitosan cangkang kepiting tanpa RGD tidak

menurunkan proliferasi sel pulpa gigi manusia. Berdasarkan penelitian in vivo

pada DPSCs macaque yang dipapar scaffold kitosan dengan penambahan RGD

dapat meningkatkan proliferasi dan menginduksi marker osteogenik.3 Pada

penelitian in vitro yang menggunakan scaffold kitosan terhadap sel osteoblast

tikus menunjukkan scaffold kitosan tidak memberikan efek toksik terhadap sel

osteoblast tikus.52 Penelitian lain melaporkan penambahan RGD pada scaffold

kitosan dapat meningkatkan pertumbuhan sel osteoblast lebih baik dibandingkan

dengan tanpa penambahan RGD.53 Scaffold kitosan RGD dilaporkan tidak

menunjukkan efek toksik terhadap sel kondrosit dan fibroblast.54 Oleh karena itu,

hipotesis yang menyatakan bahwa membran scaffold kitosan RGD cangkang

kepiting tidak bersifat toksik terhadap sel pulpa gigi manusia dapat diterima.

Pada penelitian ini menggunakan membran scaffold kitosan RGD cangkang

kepiting dan membran scaffold kitosan cangkang kepiting tanpa RGD dengan

masing-masing memiliki berat 1mg dan 2mg. Hal ini untuk mengetahui apakah

peningkatan berat scaffold dapat mempengaruhi viabilitas sel pulpa gigi manusia

(%). Hasil penelitian ini (gambar 5.3) menunjukkan peningkatan berat scaffold

kitosan kepiting dengan atau tanpa RGD tidak menunjukkan perubahan efek yang

bermakna terhadap viabilitas sel pulpa gigi manusia. Hasil tersebut kemungkinan

disebabkan oleh varian berat yang belum cukup untuk menunjukkan perubahan

efek terhadap viabilitas sel pulpa gigi manusia. Pada penelitian ini perbedaan

significant terjadi pada viabilitas pulpa gigi manusia pada kelompok scaffold



kitosan RGD cangkang kepiting terhadap scaffold kitosan cangkang kepiting

tanpa RGD baik pada 1mg maupun 2mg.

Nampaknya penambahan RGD pada membran scaffold kitosan dapat

meningkatkan viabilitas sel pulpa gigi manusia jika dibandingkan dengan kontrol

namun tidak lebih baik dari tanpa penambahan RGD. Hasil ini didukung oleh

penelitian Nidia, 2016 (belum dipublikasi) yang melaporkan bahwa scaffold

kitosan kulit kepiting tanpa RGD menunjukkan peningkatan proliferasi lebih baik

dibandingkan dengan scaffold kitosan RGD cangkang kepiting. Namun pada

penelitian terkait karakteristik membran scaffold kitosan RGD cangkang kepiting

dan membran scaffold kitosan tanpa RGD yang dilakukan oleh Diwiya, 2016

(belum dipublikasi), dilaporkan bahwa ukuran pori, jarak pori, porositas dan wet

ability menunjukkan membran scaffold kitosan RGD cangkang kepiting lebih

baik.

Pada aplikasi klinis, membran scaffold yang digunakan akan melapisi

seluruh permukaan tulang yang mengalami kerusakan agar sel dan nutrisi untuk

perbaikan jaringan dapat terlokalisir pada jaringan tersebut. Penambahan RGD

pada membran scaffold kitosan cangkang kepiting digunakan untuk meningkatkan

perlekatan sel pada scaffold sehingga didapatkan perlekatan yang baik pula pada

jaringan. Perlekatan sel merupakan tahapan pertama sebelum sel mampu

berproliferasi. Penelitian ini menunjukkan bahwa penambahan RGD pada

membran scaffold kitosan cangkang kepiting tidak memberikan efek toksik

terhadap sel pulpa gigi manusia. Namun hubungan efek dan dosis perlu ditentukan

untuk mendapatkan gambaran apakah efek toksik dipengaruhi oleh dosis bahan

yang dipakai. Pada penelitian ini hanya dipakai dua varian berat scaffold dan

konsentrasi RGD yang dipakai juga sama.

Terdapat kelemahan dalam penelitian ini karena sel yang digunakan untuk

analisis toksisitas scaffold kitosan RGD cangkang kepiting adalah sel pulpa gigi

manusia, dimana sel pulpa gigi manusia tidak hanya terdiri stem cell namun juga

terdapat sel odontoblast, sel fibroblast, makrofag, sel mast, sel limfosit dan sel

dendrit.55 Oleh karena itu, adanya kemungkinan bahwa paparan bahan uji tidak

hanya berinteraksi dengan stem cell, namun sel lain yang ada pada sel pulpa gigi



manusia sehingga dapat mempengaruhi analisis toksisitas scaffold kitosan RGD

cangkang kepiting.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian ini, maka disimpulkan bahwa membran

scaffold kitosan RGD cangkang kepiting tidak toksik terhadap sel pulpa gigi

manusia.

Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lain dengan menggunakan variasi dosis lebih dari

2 dosis untuk menggambarkan hubungan dosis dengan efek scaffold kitosan

RGD cangkang kepiting terhadap sel pulpa gigi manusia.

2. Perlu adanya analisis karakteristik dari membran scaffold kitosan RGD

cangkang kepiting seperti porositas dan kemampuan menahan air (wet

ability).

Daftar Referensi 1. Angeles L, Clinical D, Angeles L, Residency PP, Angeles L, Angeles L. Carranza’s

Clinical Periodontology. 11th ed. Elsevier; 2012. 2. Lee M, Li W, Siu RK, et al. Biomaterials Biomimetic apatite-coated alginate / chitosan

microparticles as osteogenic protein carriers. Biomaterials. 2016;30(30):6094-6101.doi:10.1016/j.biomaterials.2009.07. 046.

3. Amir L, Suniarti D, Utami S, Abbas B. Chitosan as a potential osteogenic factor compared with dexamethasone in cultured macaque dental pulp stromal cells. Proquest J. 2014;358:406-414.

4. Guleria M, Dua H, Rohila S, Sharma AK. Stem Cells In Dentistry. Indian J Dent Sci. 2014;6(4):107-112.

5. Casagrande L, Cordeiro MM, Nör SA, Nör JE. Dental pulp stem cells in regenerative dentistry. 2011:1-7. doi:10.1007/s10266-010-0154-z.

6. Saadah N, Mat B, Ariffin Z, et al. The Assessment of Proliferation Rate of Dental Pulp Stem Cells and Stem Cell from Human Exfoliated Deciduous Teeth by Using Two Different Scaffold. International Medical J. 2013; 20 (5):593-596.

7. Badan Pusat Statistik dan Informasi Sekertariat Jenderal Kementrian Kelautan dan Perikanan. Statistik Ekspor Hasil Perikanan Menurut Komoditi, Provinsi, dan Pelabuhan Asal Ekspor 2014. Pusat Data, Statistik dan Informasi Sekertariat Jendral Kementrian Kelautan dan Perikanan. 2014.

8. Nuralam E, Arbi BP. Pemanfaatan Limbah Kulit Kepiting Menjadi Kitosan Sebagai Penjernih Air Pada Air Rawa Dan Air Sungai. 18(4):14-20.

9. Trisnawati E, Andesti D, Saleh A. Cangkang Kepiting Sebagai Bahan Pengawet Buah Duku Dengan Variasi Lama Pengawetan. 19(2):17-26.

10. Croisier F, Jérôme C. Chitosan-based biomaterials for tissue engineering. European Polymer J. 2013;49:780-792.

11. Chen LIN, Li B, Xiao X, et al. Preparation and evaluation of an Arg-Gly-Asp-modified



chitosan / hydroxyapatite scaffold for application in bone tissue engineering. Moleculer Medicine. 2015:7263-7270.doi:10.389 2/mmr. 2015 .4371.

12. Bellis SL. Advantages of RGD peptides for directing cell association with biomaterials. Biomaterials. 2012;32(18):4205-4210.doi:10.1016/j . biom at er ials. 2011.02.029.Advantages.

13. Saravanan S, Leena RS, Selvamurugan N. Chitosan based biocomposite scaffolds for bone tissue engineering. Int J Biol Macromol. 2016:1-12. doi:10.1016/j.ijbiomac.2016.01.112.

14. Swetha B, Mathew S, Murthy BVS, Shruthi N, Bhandi SH. Determination of biocompatibility:A review. Int Dent Med J Adv Res - Vol 2015. 2015;1:1-6. doi:10.15713/ins.idmjar.2.

15. Chen Y, Lee H, Chan H, Sung L, Chen H, Hu Y. Composite chondroitin-6-sulfate / dermatan sulfate / chitosan scaffolds for cartilage tissue engineering.2016;28(2007):2294-2305.

16. Brien FJO. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Mater Today. 2011;14(3):88-95. doi:10.1016/S1369-7021(11)70058-X.

17. Ikeda K, Yamamoto K. Fabrication and Characteristics of Chitosan Sponge as a Tissue Engineering Scaffold. BioMed Res Int. 2014;2014.

18. Di A, Sittinger M, Risbud M V. Chitosan : A versatile biopolymer for orthopaedictissue-engineering.2005;26:5983-5990.doi:10.1016/j. biomaterials. 2005.03.016.

19. Ho M, Wang D, Hou L, Hsieh H. Immobilization of RGD to promote the biocompatibility of porous chitosan membranes. :3-8.

20. Duarte ARC, Mano JF, Reis RL. Preparation of Chitosan Scaffolds for Tissue Engineering using Supercritical Fluid Technology. 2010;637:22-25. doi:10.4028/www.scientific.net/MSF.636-637.22.

21. Dash M, Chiellini F, Ottenbrite RM, Chiellini E. Progress in Polymer Science Chitosan A versatile semi-synthetic polymer in biomedical applications. ProgPolymSci. 2011; 36(8):981-1014.doi:10 1016 / j.progpolymsci \. 2011.02.001.

22. N.Nitar FT and TH. The Mechanical and Biological Properties of Chitosan Scaffolds for Tissue Regeneration Templates Are Significantly Enhanced by Chitosan. Material J. 2009:374-398. doi:10.3390/ma2020374.

23. Budiraharjo R, Neoh KG, Kang ET, Kishen A. Bioactivity of novel carboxymethyl chitosan scaffold incorporating MTA in a tooth model. Int Endod J. 2010:930-939. doi:10.1111/j.1365-2591.2010.01771.x.

24. Farea M, Husein A, Sukari A. Synergistic effects of chitosan scaffold and TGF b 1 on the proliferation and osteogenic differentiation of dental pulp stem cells derived from human exfoliated deciduous teeth. Arch Oral Biol. 2014;59(12):1400-1411. doi:10.1016/j.archoralbio.2014.08.015.

25. Deepthi S, Venkatesan J, Kim S, Bumgardner JD, Jayakumar R. An overview of chitin or chitosan/nano ceramic composite scaffolds for bone tissueengineering. IntJBiolMacromol. 2016.doi:10.1016/j.ijbiomac.2016.03 .041.

26. Aranaz I, Mengíbar M, Harris R, et al. Functional Characterization of Chitin and Chitosan. Current Chemical Biology.2009:203-230.

27. Niu X, Fan Y, Liu X, et al. Repair of Bone Defect in Femoral Condyle Using Microencapsulated Chitosan , Nanohydroxyapatite / Collagen Delivery System. J.Dent Res. 2011;35(7). doi:10.1111/j.1525-1594. 2011. 01274.x.

28. Huang GT, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs Those from Other Sources: Their Biology and Role in Regenerative Medicine. 2009;9:792-806.

29. Halim, D. Murti, H. Sandra, F. Boediono, A. Djuwantono, T. Setiawan B. Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis.pdf. 2010.

30. Volponi AA, Pang Y, Sharpe PT. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. 2010:715-722.

31. Tandon S, Saha R, Rajendran R, Nayak R. Dental Pulp Stem Cells from Primary and PermanentTeeth. J Clin Pediatr Dent. 2010;35(1).

32. Ishida K, Oshima M, Tsuji T. Tooth tissue and organ regeneration using stem cell. Tokyo Univ Sci. 2013;33:29-35.

33. Wang Y, Preston B, Guan G. Tooth bioengineering leads the next generation of dentistry.



Pediatr Dent. 2012:406-414. 34. Khorsand A, Eslaminejad MB, Arabsolghar M, et al. Autologous dental pulp stem cells in

regeneration of defect created in canine periodontal tissue. J Oral Implant. 2013;39(4):433-443. doi:10.1563/aaid-joi-d-12-00027.

35. Schaffner P, Dard MM. Cellular and Molecular Life Sciences Structure and function of RGD peptides involved in bone biology. 2003;60:119-132.

36. Tsai W, Chen Y, Li W, Lai J, Liu H. RGD-conjugated UV-crosslinked chitosan scaffolds inoculated with mesenchymal stem cells for bone tissue engineering. CarbohydrPolym. 2012;89(2):379-387.doi:10.1016 /j.carbpol. 2012.03.017.

37. Hersel U, Dahmen C, Kessler H. RGD modified polymers : biomaterials for stimulatedcelladhesionandbeyond. Biomaterial. 2003;24:4385-4415. doi: 10.1016/S0142-9612(03)00343-0.

38. Schaffner P, Dard MM. Review Structure and function of RGD peptides involved in bone biology. C Cell Mol Life Sci. 2003;60:119-132.

39. Vilac H, Ferreira PMT, Micaelo NM. New cyclic RGD peptides : synthesis, characterization, and theoretical activity towards avb3 integrin. ScieneDirect.2014;70:5420-5427. doi:10.1016/j.tet.2014.06.121.

40. R. Ian Freshney. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 6th ed. New York; 2000.

41. Runkel M, Gmbh A. Toxycology in Vitro / in Vivo. Screening. 42. CellCultureBasicsHandbook.

www.vanderbilt.edu/viibre/CellCultureBasicsEU.pdf(Available : 26 Mei 2016). 43. Jørgen Fogh NB. H and PP. A Review of Cell Culture Contaminations. Springer.

2016;7(1):26-41. http://www.jstor.org/stable/4291579 Accessed : 18-07-2016 04. 44. Riss TL, Moravec RA, Niles AL, Minor L. Cell Viability Assays.

neuro.surgery.duke.edu/files/documents/MTT_Cell_Viability.pdf (Available:26 Juni 2016).

45. Breyner NM, Hell CR, Carvalho LRP. Effect of a Three-Dimensional Chitosan Porous Scaffold on the Differentiation of Mesenchymal Stem Cells into Chondrocytes. 2010:119-128. doi:10.1159/000231472.

46. Type A, Collection C. MTT Cell Proliferation Assay Instruction Guide. 6597:1-6. 47. ProliferationassayMTTProtocol.:3-4. (Available: 25 Mei 2016)

https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwj_4v6H0sDOAhWMs48KHeS1DfMQFggvMAE&url=http://web.mnstate.edu/provost/mtt proliferation assay protocol.pdf&usg=AFQjCNG1QG3BaIcj7mjag3aujVAuzMxbmw&sig2=hmW2hVMeC

48. Reis RL, Román JS. Biodegradable System in Tissue Engineering and Regenarative Medicine.; 2005.

49. N GY, S GA, V YA. Chitosan and Its Applications : A Review of Literature. 2013;4(1):312-331.

50. Fernandes LL, Resende CX, Tavares DS, Soares GA, Castro LO, Granjeiro JM. Cytocompatibility of Chitosan and Collagen-Chitosan Scaffolds for Tissue Engineering. 2011;21:1-6.

51. Tsaia W-B, Chena Y-R, Liub H-L, Lai J-Y. Fabrication of UV-crosslinked chitosan scaffolds with conjugation of RGD peptides for bone tissue engineering. Elsevier. 2011:129-137.

52. Prabaharan M, P.R. Sivashankari. Prospect of Bioactive Chitosan-Based Scaffold in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Springer. 2016:47-57. doi:10.1007/978-81-322-2511-9.

53. Cohen S, Hargreaves K. Cohen’s Pathway of the Pulp. 10th ed. Elsevier; 2010.


analisis toksisitas membran scaffold kitosan rgd …

Documents