Enzim

Tugas Makalah Enzimologi

Kelas Enzim: Oksidoreduktase

Alkohol Dehidrogenase

oleh:Gaby Almira (10509028)Masyitha Ambarwati (10509085)

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2012

Alkohol DehidrogenaseDefinisi

Alkohol dehidrogenase (ADH) termasuk kedalam kelas enzim oksidoreduktase dengan sub- kelas dehidrogenase, dengan kode EC 1.1.1.1 (Nie, Xu, Mu, Wang, Yang, & Xiao, 2007). Alkohol dehidrogenase mengkatalisis reaksi oksidasi alkohol primer dan sekunder menjadi aldehid atau keton. Reaksi redoks ini melibatkan koenzim NAD+ atau NADP+ dan kofaktor PQQ. Reaksi kebalikannya juga dapat dikatalisis oleh ADH.Alkohol dehidrogenase terdapat pada hampir setiap organisme. Pada manusia dan beberapa hewan, enzim ini berfungsi untuk mendegradasi alkohol yang bersifat toksik. Alkohol dikonversi menjadi asetaldehid, molekul yang lebih toksik lagi. Namun asetaldehid dengan cepat diubah menjaid asetat dan molekul lain yang dapat dianfaatkan oleh tubuh kita. Pada manusia dan hewan, ADH paling banyak dihasilkan di hati dan lambung. Pada ragi, tanaman, dan bakteri, alkohol dehidrogenase mengkatalisis reaksi kebalikannya, yaitu mensintesis alkohol sebagai bagian dari proses fermentasi. Enzim ADH yang paling aktif adalah yang berasal dari ragi.Struktur alkohol dehidrogenase pada manusia:

Alkohol dehidrogenase pada manusia berbentuk dimer dengan berat molekul 80 kDa.Reaksi yang dikatalisis alkohol dehidrogenase pada manusia adalah sebagai berikut:

CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO +NADH+ H+

Data berikut adalah data alkohol dehidrogenase pada ragi roti, Saccharomyces cerevisiae.

Alkohol dehidrogenase adalah tetramer dengan masing-masing subunit mengandung satu atom zinc (Vallee and Hoch, 1955). Pada tiap subunit, ada dua sisik aktif gugus sulfidril yang berjauhan. Kedua gugus ini dapat dibedakan berdasarkan reaktivitasnya terhadap iodoasetat dan butil isosianat (Twu, Chin, and Wold, 1973). Residu histidin memiliki peranan penting dalam sisi aktif (Dickenson and Dickinson 1975 and LeBrun et al., 2004).Struktur alkohol dehidrogenase pada ragi:

Berat molekuler:149.5 kDa

pH optimum: 5.4 (Shore and Theorell, 1966)

Titik isoelektrik:6.91 (teoretis)

Koefisien ekstingsi:41,170 cm-1M-1Aktivator: reagen peangaktivasi sulfidril merkaptoetanol ditiotreitol sistein agen pengkelat logam berat(White and White 1997)

Inhibitor: logam berat dan reagen -SH tiourea

turunan purin dan pirimidin kloroetanol dan fluoroetanol N-alkilmaleimida iodoasetamida 1,10-fenantrolin 8-hidroksiquinolin analog beta-NADADH pada bakteri dan ragi akan memfermentasikan glukosa menjadi etanol dan CO2. Sesuai dengan reaksi berikut:

Glukosa + 2 ADP + 2 Pi 2 ethanol + 2 CO2+ 2 ATP + 2 H2O

Glukosa melalui proses glikolisis akan menghasilkan piruvat yang kemudian diubah menjadi asetaldehid dan CO2. Asetaldehid inilah yang diubah oleh alkohol dehidrogenase menjadi etanol. Varian ADH yang berperan dalam proses ini adalah ADH1. Proses fermentasi dari glukosa menjadi etanol ini adalah untuk meregenerasi NAD+.

Mekanisme kerja ADH pada manusiaTahapan:1. pengikatan koenzim NAD+ pada enzim2. pengikatan substrat alkohol melalui koordinasi dengan zinc3. deprotonasi His-514. deprotonasi nikotinamida ribosa5. deprotonasi Ser-486. deprotonasi alkohol7. transfer hidrida dari ion alkoksida kepada NAD+ menjadi NADH, dan zinc terikat pada aldehid atau keton8. pelepasan produk aldehid atau ketonTahapan ini diperoleh dari studi kinetika. Mekanisme yang terjadi pada ragi atau bakteri adalah kebalikannya.

Regulasi Gen

Tujuh gen untuk Saccharomyces cerevisiae telah diidentifikasi (Lertwattanasakul et al., 2007). ScADH1 mengkode enzim fermentatif yang memproduksi etanol (Bennetzen dan Hall, 1982). ScADH1 diekspresikan dalam jumlah banyak dengan kehadiran glukosa. ScADH2 mengkode isozim yang mengubah etanol menjadi asetaldehid (Ciriacy, 1975; Wills dan Jornvall, 1979; serta Russel dan Hall, 1983). ScADH2 diregulasi secara negatif dengan kehadiran glukosa. Gen ScADH3 ditekan jumlahnya degnan kehadiran glukosa dan protein pada mitokondria (Young dan Pilgrim, 1985). ScADH4, ScADH5, and ScADH6 mengkode protein ScADH4, ScADH5, and ScADH6. ScADH6 and ScADH7 diduga berkontribusi dalam menyeimbangkan jumlah NADP+/NADPH (Larroy et al., 2002).

Tabel 1. Variasi Alkohol Dehidrogenase Pada Manusia

KelasNama Resmi GenNama LamaNama LainUrutanProtein

IADH1AADH1ADH1ANM_000667

IADH1BADH2ADH1BNM_000668

IADH1CADH3ADH1CNM_000669

IIADH4ADH4ADH2NM_000670

IIIADH5ADH5ADH3NM_000671

VADH6ADH6ADH5NM_000672ADH6

IVADH7ADH7ADH4NM_000673

Adanya variasi jenis ADH menyebabkan bervariasinya laju metabolisme alkohol di dalam hati. Berdasarkan properti kinetik inilah maka kemampuan hati seseorang dalam mengoksidasi alkohol dapat diamati. Aktivitas alkohol dehidrogenase akan bervariasi antara pria dan wanita, tua dan muda, serta kondisi lingkungan (Edenberg, 2007).

Isolasi

a) Mengisolasi ADH dari Hati Manusia atau Hewan

2-5 gram hati manusia yang telah meninggal (12 jam) dihomogenisasi dalam 2-5 mL natrium fosfat 50 mM (pH 7,5) pada suhu 4C. Homogenat kemudian disentrifugasi selama 60 menit dengan kecepatan 10.000 x g. Supernatan kemudian digunakan untuk karakterisasi.

b) Mengisolasi ADH dari Bakteri

1) Cloning Gen Pengkode Alkohol DehidrogenaseUrutan basa nitrogen pengkode alkohol dehidrogenase (adhD) disesuaikan dengan basis data yang telah ada. Gen tersebut kemudian diperbanyak dengan menggunakan PCR dengan primer yang sesuai. Gen-gen yang telah diperbanyak kemudian dimurnikan dan dipotong dengan menggunakan enzim restriksi. Potongan ini kemudian disambungkan dengan vektor kemudian diinsersikan ke dalam sel inang (E.coli) untuk diperbanyak. Kemudian vektor hasil perbanyakan melalui kloning diisolasi kemudian ditempelkan pada vektor ekspresi untuk kemudia ditransformasikan ke dalam sel inang. (Machielsen, 2006)

2) Produksi dan Pemurnian

Sel inang yang mengandung vektor ekspresi kemudian diinokulasi ke dalam media LB cair. Sel diinkubasi overnight pada shaker. Kemudian dilakukan scale-up sehingga diperoleh kultur dalam jumlah yang lebih besar. Kultur di-induce dengan menggunakan IPTG, kemudian diinkubasi kembali. Sel kemudian dipanen, dilarutkan kembali dengan menggunakan Tris-HCl buffer dan diberi tekanan. Crude extract kemudian disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 10,000 x g. Supernatan yang dihasilkan digunakan untuk karakterisasi. Proses pemurnian dapat dilakukan menggunakan metode kolom kromatografi (Machielsen, 2006)

c) Mengisolasi ADH dari Ragi

Sel ragi sebanyak 100dian ditambahkan 2mM -mercaptoetanol, dan glass beads. Sel dihancurkan dengan menggunakan vortex. Sampel kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12,000 rpm. Supernatant kemudian digunakan untuk proses karakterisasi (Zanon, 2006).Karakterisasi

a) Penentuan Massa Molekular

Penentuan massa molekular dapat dilakukan dengan size exclusion chromatography. Enzim di dalam buffer disuntikkan ke dalam kolom. Larutan standar yang dapat digunakan adalah aldolase (158 kDa), BSA (67 kDa), ovalbumin (43 kDa), kimotripsinogen (25 kDA), dan Rnase (13,7 kDa). Selain itu dapat digunakan SDS PAGE. Massa molekul dari alkohol dehidrogenase adalah 80 kDa (Edenberg, 2007).b) Penentuan Aktivitas Enzim

Kecepatan proses reduksi-oksidasi ditentukan dengan metode kolorimetri. Proses oksidasi ditentukan dengan menambahkan alkohol, NAD+ dan glisin. Sedangkan untuk proses reduksi ditentukan dengan menambahkan buffer, aldehid/keton, dan NADH. BSA digunakan sebagai standar (Machielsen, 2006).c) Penentuan Suhu Optimum

Alkohol dehidrogenase ditambahkan dengan buffer glisin pada pH 8,8 kemudian ditambahkan substrat. Laju aktivitas enzim diukur pada rentang suhu 30-100C. Suhu optimum alkohol dehidrogenase adalah 70C (Machielsen, 2006).d) Penentuan pH Optimum

pH optimum ditentukan dengan cara enzim dilarutkan ke dalam buffer dengan beragam rentang pH. Kemudian ditentukan aktivitas enzim tersebut. pH optimum alkohol dehidrogenase adalah 6,1-8,8. (Nie, Xu, Mu, Wang, Yang, & Xiao, 2007)

e) Penentuan Parameter Kinetik

Parameter kinetik ditentukan melalui persamaan Michaelis-Menten sesuai dengan uji aktivitas yang telah dilakukan.

f) Penentuan Pengaruh Penambahan Garam, Logam, dan Inhibitor

Ke dalam enzim alkohol dehidrogenase ditambahkan beberapa jenis garam (K+, Mg2+, Mn 2+, Na+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Li2+, Ni2+, Co2+, Zn2+, Ca2+) serta inhibitor seperti EDTA. Aktivitas enzim kemudian diukur. Alkohol dehidrogenase mampu terstabilkan oleh ion logam monovalen dan divalen kecuali Cu2+. (Nie, Xu, Mu, Wang, Yang, & Xiao, 2007)

Aplikasi pembuatan alkoholPada awal perkembangannya, bioteknologi sangat identik dengan bisnis fermentasi alkohol. Ragi dan bakteri memiliki alkohol dehidrogenase yang berukuran besar. Gula didegradasi untuk menghasilkan energi, dan produk sampingnya adalah alkohol, yang diekskresikan keluar sel. Fermentasi banyak dipakai untuk memproduksi minuman beralkohol seperti bir dan wine. biokatalisSecara umum, enzim sebagai biokatalis memiliki keuntungan, yaitu bersifat selektif, tidak menghasilkan produk samping, dan umumnya bekerja optimum pada suhu dan tekanan yang tidak terlalu tinggi sehingga mengurangi penggunaan bahan bakar fosil. Karena itu, enzim dipandang lebih menguntungkan dari sisi ekonomis maupun lingkungan dibandingkan katalis konvensional.Alkohol dehidrogenase mampu mengubah gugus karbonil menjadi alkohol yang optis murni. Karena itu, dehidrogenase adalah katalis yang sangat penting dalam sintesis organik. Banyak pengembangan yang difokuskan untuk menemukan biokatalis yang dapat menghasilkan stereospesivitas yang sesuai untuk keperluan industri.

Dewasa ini, senyawa kiral adalah komponen paling penting dalam industri kimia dan farmasetika untuk produksi katalis kimia, liquid crystal, perasa, agrokimia, dan obat (Daubmann et al., 2006). Alkohol sekunder yang optis aktif banyak digunakan sebagai intermediet dalam pengenalan informasi kiral pada produk. Biokatalis ini dapat digunakan sebagai enzim yang sudah diisolasi atau masih dalam whole cell. ADH mengkatalisis reduksi stereoselektif keton prokiral dengan kemoselektivitas, regioselektivitas, dan stereoselektivitas yang mengagumkan (Wandrey, 2004).Contoh farmasetika dengan intermediet alkohol kiral adalah obat antihipertensif, obat penyumbat kanal kalsium dan kalium, agen antiaritmik, agonis -reseptor, obat antikolesterol, dan obat antiviral. Reaksi ini membutuhkan kofaktor NADH dan NADPH.

Pada salah satu penelitian, bioreduksi enansioselektif untuk senyawa obat pentoksifilin (PTX), propentofilin (PPT), dan denbufilin (DBF), menggunakan (R)-alcohol dehidrogenase dari L. kefir, (S)-aromatic alcohol dehidrogenase dari Thermoanaerobium sp. dan (S)-alcohol dehydrogenase dari Thermoanaerobium brockii. Setiap obat ini memiliki gugus metil keton pada strukturnya, yang kemudian akan direduksi secara biokatalitik oleh ADH.

Contoh pentingnya kiralitas pada senyawa-senyawa obat ini diberikan sebagai berikut. Metabolit (R)-hidroksi dari PTX ((R)-OHPTX), dikenal sebagai lisofilin, adalah kandidat obat untuk sindrom distress pernafpasan akut, luka paru-paru akut, septic shock, dan mukositis, serta efektif dalam pencegahan dan pengobatan diabetes tipe I. Sedangkan enansiomernya, ((S)-OHPTX) tidak aktif secara farmakologis.

Jalur bioreduksi xantin dengan gugus metil alkil keton

Hasilnya adalah sebagai berikut: Semua ADH yang diuji menunjukkan aktivitas enansioselektif (ee 99100%), namun hanya biokonversi LKADH yang memuaskan, yaitu dalam rentang 96-86%. Untuk TBADH and SAADH, yield-nya sangat rendah, yaitu sekitar 5-10%. Bahkan, pada SAADH untuk DBF, tidak ada produk yang dihasilkan.

Bioreduksi PTX, PPT and DBF dengan berbagai ADH.

ModifikasiReaksi alkohol dehidrogenase dari hati kuda dengan imidoester atau sianat pada pH 8 meningkatkan aktivitas enzim. Metil pikolinimidat meningkatkan aktivitas enzim hingga 19 kali lipat, dan memodifikasi skeitar 50 dari 60 gugus amino. Inhibisi produk menunjukkan bahwa reaksi yang dikatalisis oleh enzim native dan yang sudah dimodifikasi memiliki mekanisme yang sama, bi bi berurutan. Enzim yang sudah dimodifikasi memiliki 1% dari 53 kali lipat tetapan Michaelis-Menten yang lebih besar, dan turnover number yang 12-30 kali lipat lebih besar. Tahap penentu laju pada reaksi yang maju atau kebalikannya adalah penguraian kompleks enzim-koenzim. Enzim yang sudah dimodifikasi mungkin memberikan laju yang lebih besar karena kompleksnya dapat berdisosiasi lebih cepat.

Daftar Pustaka

Edenberg, H. J. (2007). Role of Alcohol Dehydrogenase and Aldehyde Dehydrogenase Variants. Alcohol Research & Health , 5-13.

Machielsen, R. (2006). Production and Characterization of a Thermostable Alcohol Dehydrogenase That Belongs to the Aldo-Keto Reductase Superfamily. Applied and Environmental Microbiology , 233-238.

Nie, Y., Xu, Y., Mu, X. Q., Wang, H. Y., Yang, M., & Xiao, R. (2007). Purification, Charecterization, Gene Cloning, and Expression of a Novel Alcohol Dehydrogenase with Anti-Prelog Stereospecificity from Candida parapsilosis. Applied and Environmental Microbiology , 3759-3764.

Zanon, J. P. (2006). Colorimetric Assay of Ethanol Using ALcohol Dehydrogenase from Dry Baker's Yeast. Enzyme and Microbial Technology .

Bryce V. Pupp. Enhancement of the Activity of Horse Liver Alcohol Dehydrogenase by Modification of Amino Groups at the Active Sites. Journal of Biological Chemistry Vol. 245 no. 7. (1969)

Z. Liu, et al. Enzymes from Higher Eukaryotes for Industrial Biocatalysis, Food Technol. Biotechnol. 42 (4) 237249 (2004).

Katja Goldberg, Kirsten Schroer , Stephan Ltz, dan Andreas Liese. Biocatalytic Ketone Reduction A Powerful Tool for The Production of Chiral Alcohols Part I:

Processes With Isolated Enzymes. Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76 : 237248.Elbieta Pkala dan Dorota elaszczyk. Alcohol Dehydrogenases as Tools for the Preparation of Enantiopure Metabolites of Drugs with Methyl Alkyl Ketone Moiety. Sci Pharm. 2009; 77: 917.