LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

LAPORAN RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGIPENGECATAN BAKTERIDISUSUN OLEH :

Nama

: Angga Teja Kusuma

NIM : 0470.0006 Kelompok : B4

2005JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNIVERSITAS KATOLIK SOEGIJAPRANATA

SEMARANG

1. PENDAHULUAN1.1 Tinjauan Pustaka

Untuk mengamati sel sel suatu mikroorganisme digunakan suatu cara yang disebut pewarnaan. Hal ini mutlak diperlukan karena sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa sehingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair (Hadioetomo, 1993).Pengamatan terhadap bakteri, lebih sering dilakukan dengan olesan terwarnai, daripada bakteri dalam keadaan hidup. Artinya, mikroorganisme yang akan diamati telah diberi zat pewarna kimia supaya lebih mudah dilihat dan dipelajari. Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai dapat mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan ada atau tidaknya struktur internal seperti spora dan butiran (Volk dan Wheller, 1993).Bakteri merupakan mikroorganisme yang menempati golongan prokariotik, karena tidak memiliki dinding inti yang jelas atau belum memiliki dinding inti yang sejati, sehingga semua bagian intinya tersebar di dalam sitoplasma secara bebas. Tetap memiliki faktor pembawa sifat yang tersimpan di dalam DNA yang berada di dalam kromosom namun tersebar luas dan bebas di dalam sitoplasma. Bukan berarti tidak memiliki inti namun hanya saja tidak memiliki dinding inti yang jelas sehingga tampak tidak berinti sel. Beberapa sifat morfologi bakteri perlu diperhatikan karena pertumbuhannya di dalam makanan dan juga karena bakteri memiliki ketahanan cukup tingggi selama pengolahan dengan panas maupun dengan suhu dingin (Schlegel & Schmidt,1994).

Pengecatan sederhana dapat digunakan untuk melihat morfologi dan komposisi sel bakteri karena asam nukleat bakteri dan beberapa jenis komponen dinding sel tertentu bermuatan negatif yang akan saling tarik-menarik dan berikatan kuat dengan metilen blue, sehingga terbentuklah warna sel biru (Cappuccino & Sherman, 1983).Menurut Lay (1994), ada 3 jenis pengecatan yang dapat digunakan pada pengecatan bakteri ini. Yaitu pengecatan sederhana, pengecatan gram, dan pengecatan endospora. Pengecatan sederhana adalah pewarnaan yang paling sederhana, dimana pada pengecatan ini hanya dilakukan dengan penambahan satu zat pewarna atau hanya melalui satu tahap pewarnaan saja pada olesan bakteri. Pengecatan gram adalah pewarnaan atau pengecatan dengan melalui beberapa tahap pengecatan dengan beberapa reagen yang berbeda. Pengecatan endospora adalah pengecatan yang bertujuan untuk mengamati endospora, dimana tidak semua jenis bakteri mampu membentuk endospora.Pewarnaan bakteri dapat dibedakan atas beberapa golongan, yang meliputi :

a. Pewarnaan sederhana

b. Pewarnaan diferensial

pewarnaan gram

pewarnaan asam cepat (acid-fast)

c. pewarnaan struktural

pewarnaan inti sel (Feulgen), yaitu pewarnaan inti sel bakteri

pewarnaan endospora, yaitu pewarnaan spora bakteri

pewarnaan dinding sel, yaitu pewarnaan dinding sel dari bakteri

pewarnaan kapsul, yaitu pewarnaan kapsul yang dibentuk oleh bakteri

pewarnaan flagella, yaitu pewarnaan flagel / alat gerak bakteri

d.pewarnaan untuk menguji komponen dalam sel seperti Glikogen, Lipida.

(Fardiaz, 1992).

Bentuk dan ukuran mikrobia merupakan karakteristik yang penting untuk identifikasi. Adapun 3 bentuk dasar sel bakteri : batang (baccil), bulat (coccus), dan lengkung (koma, vibrion, dan spiral). Bentuk bakteri yang paling dikenal ada 2 macam, yaitu batang dan bulat (Timotius, 1982).Hubungan bakteri dengan zat perwarna basa yang menonjol disebabkan oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi jika bakteri diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa. Oleh karena itu, pada percobaan digunakan metilen loeffer yang memiliki sifat basa dan alkalin sebagai pewarna sederhana. Pewarna alkalin lain yang umumnya digunakan dapat berupa pewarna basa seperti metylen blue, basic fuschin, dan violet kristal (Volk dan Wheller, 1993).Hal yang penting yang mempengaruhi keberhasilan pada pengecatan bakteri adalah penyiapan preparat yang baik yakni tidak terlalu tebal atau tidak terlalu tipis, biakan dapat tetap melekat pada gelas preparat selama pencucian berulang-ulang, sel-selnya tidak berubah bentuk setelah fiksasi dan pengecatan. Selain penyiapan preparat, pengolesan bakteri pada gelas benda tidak boleh terlalu tebal ataupun terlalu tipis. Sebab jika olesannya terlalu tebal, maka sel-sel bakteri akan bertumpang tindih, sehingga ketika bagian selnya tidak bisa teramati dengan jelas bila dilihat di bawah mikroskop, dan juga akan menylitkan dalam pewarnaan. Apabila terlalu tipis, hal yang dikhawatirkan adalah akan banyak sel yang hilang saat pencucian sehingga bisa saja semua bakteri akan hilang akibat pencucian selain itu mengingat kecilnya sel bakteri, sehingga akan menyulitkan dalam pengamatan (Hadioetomo, 1993).

Pada setiap proses pengecatan yang dilakukan, baik pengecatan sederhana, pengecatan gram, ataupun pengecatan endospora, selalu dilakukan proses fiksasi. Proses fiksasi ini dilakukan dengan cara melewatkan gelas benda pada nyala api spirius beberapa kali selama 1-2 detik. Proses ini bertujuan untuk lebih melekatkan bakteri pada gelas benda dan mematikan bakteri, karena sebenarnya bakteri yang hidup tidak dapat diamati, karena pada bakteri hidup, selnya tidak mengandung pigmen atau transparan, karena indeks bias sitoplasmanya hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair (Lay, 1994).

Pengecatan deferensial merupakan pengecatan yang memiliki keunggulan dalam mengelompokkan bakteri, karena dengan pengecatan ini bakteri bisa digolongkan menjadi bakteri gram positif dan gram negatif. Dimana hal yang membedakannya adalah lapisan membran selnya, untuk bakteri gram negatif hanya memiliki 5-20% peptidoglikan sedangkan bakteri gram positif memiliki 90% peptidoglikan di dalam membran selnya, dan dengan adanya peptidoglikan yang tebal meyebabkan bakteri tersebut tidak mudah terdehidrasi saat pelarutan ataupun pemanasan sehingga cat yang sudah masuk tidak dapat keluar lagi. Disamping itu ada pula faktor lain yang dapat mempengaruhi sifat gram negatif dan gram positif, yaitu penyiapan preparat yang terlalu tebal menyebabkan pelarutan kurang baik, konsentrasi dan kesegaran bahan untuk pewarna, waktu pelarutan yang terlalu lama menyebabkan warna pada sel bakteri gram positif ikut terlarut, pencucian dan pengeringan yang mempengaruhi keberadaan iodin, serta umur bakteri yang mempengaruhi keutuhan bakteri (Trihendrokesowo, 1989).

Pengecatan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling benyak digunakan dalam laboratorium. Selain itu pengecatan gram merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri. Pengecatan gram ini dapat digunakan untuk memilah bakteri menjadi kelompok gram negatif atau gram positif (Lay, 1994).

Dalam pengecatan gram pada bakteri, digunakan zat warna primer (violet kristal), larutan mordan (iodin), bahan peluntur (alkohol), dan zat warna penutup (safranin). Larutan mordan berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri, sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat, memperjelas zat warna, mempersulit pelarutan zat warna, dan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks kristal violet-yodium. Sedangkan etanol, berfungsi untuk melunturkan zat warna primer dengan daya kerja lambat, sehingga memperkecil kemungkinan terjadinya pemucatan yang berlebihan. Fungsi penambahan zat warna penutup adalah sebagai pembeda (kontras) terhadap zat warna primer, dan juga untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan zat warna primernya (Lay, 1994).

Perbedaan antara bakteri bergram negatif dan bakteri bergram positif disebabkan oleh perbedaan struktur dinding sel bakteri gram-positif dan gram-negatif, sehingga menyebabkan perbedaan larutan pemucat. Sebagian besar dinding sel bakteri gram-positif terdiri dari peptidoglikan, sedangkan dinding sel bakteri gram-negatif mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri gram-positif. Lipida ini akan larut dalam alkohol dan aseton yang digunakan sebagai larutan pemucat, sehingga pori-pori dinding sel membesar dan meningkatkan daya larut kompleks kristal-violet-yodium pada dinding sel bakteri gram-negatif. Selain itu yang menyebabkan adanya perbedaan antara bakteri bergram negatif dengan bakteri bergram positif adalah pada bakteri gram-positif akan terbentuk persenyawaan kompleks kristal-violet-yodium ribonukleat yang tidak larut dalam larutan pemucat. Persenyawaan kompleks ini tidak terbentuk pada bakteri gram-negatif sehingga diduga adanya perbedaan kandungan asam ribonukleat antara bakteri gram-positif dan gram-negatif. Faktor-faktor lain yang juga dapat menentukan jenis gram bakteri, yaitu pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan, kerapatan sel pada olesan, konsentrasi dan umur reagen-reagen yang digunakan, sifat dan konsentrasi dan jumlah pemucat yang dipakai, serta sejarah biakan (Hadioetomo, 1993).Pewarnaan gram ini memilahkan bakteri menjadi kelompok bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna kristal violet-yodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan pemucat sedangkan bakteri gram negatif berwarna merah karena kompleks tersebut larut sewaktu pemberian larutan pemucat dan kemudian mengambil zat warna yang kedua yaitu Safranin yang menyebabkan sel menjadi berwarna merah. Fungsi zat warna kedua hanyalah sebagai pembeda (kontras) terhadap zat warna kristal violet (Capuccino & Sherman, 1983).

Jenis bakteri yang termasuk gram positif adalah famili Micrococcaceae seperti Microsoccocus, Staphylococcus dan famili Streptococcaceae seperti Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus. Streptococcus merupakan bakteri berbentuk bulat yang hidup secara berpasangan, atau membentuk rantai pendek dan panjang tergantung dari spesies dan kondisi pertumbuhannya (Fardiaz, 1992).

Beberapa jenis bakteri yang merupakan jenis bakteri gram (-) adalah Eschericia coli, Enterobacter aerogenes, dan kelompok Pseudomonas. Sedangkan yang termasuk bakteri gram (+) adalah kelompok Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Streptococcus. (Hadioetomo, 1993).

Menurut Hadioetomo (1993), ada empat reagen yang digunakan dalam pengecatan gram

Cat utama, yaitu larutan violet kristal

Mordan, yaitu senyawa yang digunakan untuk mengindentifikasikan cat utama (kompleks antara cat utama dengan senyawa yang dicat lebih baik) misalnya larutan iodine

Bahan peluntur (decolorizing agent) yaitu solvent organik (alkohol atau aseton) yang dapat digunakan untuk melunturkan cat utama

Cat penutup seperti safranin, digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utamanya setelah dilunturkan. Karena cat penutup harus berbeda dengan cat utama.

Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Endospora berbentuk sangat padat dan bersifat sangat refraktif bila dilihat di bawah mikroskop, karena kandungan airnya sangat rendah. Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa, karenanya harus digunakan pewarna spesifik, dan yang biasa digunakan adalah pewarna hijau malasit (malachite green) (Fardiaz, 1992).Endospora hanya terdapat dalam bakteri berbentuk batang (basilus) dan dapat dilihat dengan pewarnaan endospora. Pada umumnya, bakteri pembentuk endospora memang berbentuk batang, dan setelah membentuk endospora sporangium, bakteri akan mati lalu mengalami lisis (pemecahan membran sel). Spora bekas lisis memiliki ukuran cukup besar, sehingga dapat terlihat jelas pada mikroskop. Spora bekas inilah yang menunjukkan adanya endospora (Lay, 1994).Dalam percobaan pengecatan endospora, setelah penetesan pewarna malachite green, dilakukan pemanasan. Pemanasan ini bertujuan untuk mengembangkan lapisan luar spora yang bersifat tahan terhadap perubahan faktor luar, yang dalam hal ini adalah penambahan bahan kimia berupa larutan pewarna malachite green, sehingga zat warna malachite green dapat masuk ke dalam spora. Setelah didinginkan, warna hijau tersebut terperangkap dalam spora, sehingga struktur endospora dapat diamati (Lay, 1994).

Pengecatan bakteri akan berhasil, jika sebelum melakukan pengecatan diperlukan penyiapan preparat yang baik, yaitu tidak terlalu tebal atau terlalu tipis, tetap melekat pada gelas preparat selama pencucian berulang-ulang, sel-selnya tidak berubah bentuk atau morfologi setelah fiksasi dan pengecatan (Hadioetomo, 1993).

1.2 Tujuan Praktikum

Tujuan praktikum ini adalah mengetahui cara pengecatan pada bakteri dan yeast yang benar. Mengamati bentuk dari bakteri dan yeast. Mengetahui cara pengelompokan bakteri dalam gram positif atau gram negatif.

2. MATERI DAN METODA

2.1 Materi

2.1.1 Bahan

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah larutan violet kristal, lugol, alkohol 95%, larutan safranin, larutan malachite green, metilen blue.

2.1.2 Alat

Peralatan yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas objek, ose, mikroskop, bunsen, Bacillius subtilis, Streptococcus thermophilus, Echerichia coli, Sacharomyses cerevisiae.

2.2 Metoda

2.2.1 Pengecatan sederhana

Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat diberi aquades 1 tetes kemudian ditambahkan biakan (B. Subtilis, S. Thermophilus) sedikit dengan menggunakan jarum ose. Dibiarkan dulu sampai kering dan difiksasi, setelah difiksasi diberi perwarna violet kristal. Setelah itu dipanaskan 3 menit tetapi jangan sampai kering, jika mulai kering ditambahkan violet kristal 1 tetes lagi. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan alkohol, Setelah itu dikeringkan. Setelah kering ditetesi dengan metylen blue, lalu didiamkan selama 10 detik kemudian dicuci dengan air mengalir. Kemudian dikeringkan, setelah itu diamati dalam mikroskop dan hasilnya digambar.

2.2.2 Pengecatan gram

Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat dibersihkan dengan alkohol kemudian dikeringkan kemudian ditetesi dengan aquades sebanyak 1 tetes. Tambahkan mikroorganisme (Escherichia coli dan Streptococcus thermophilus) yang diambil dengan jarum ose dan diletakkan pada kaca preparat dan kemudian dibiarkan sampai kering. Setelah kering, kemudian difiksasi dan diberi pewarna violet kristal. Dan dibiarkan di meja selama 1 menit. Kemudian dibilas dengan air mengalir, dan sisa air yang tertinggal dibuang dan ditetesi dengan lugol. Tunggu lagi selama 1 menit, kemudian dicuci kembali dengan air dan kemudian dihilangkan warnanya dengan alkohol. Setelah itu diberi pewarna safranin dan didiamkan selama 10 detik. Setelah kering, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Hasilnya diamati di bawah mikroskop dan digambar.

2.2.3 Pengecatan endospora (B. Subtilis)Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat diberi aquades 1 tetes kemudian ditambahkan biakan (B. Sublitis) sedikit dengan menggunakan jarum ose. Dibiarkan dulu sampai kering dan difiksasi, setelah difiksasi diberi perwarna hijau malasit dan dibiarkan selama 20 menit tanpa pemanasan atau selama 5 menit diatas pemanas air. Setiap kali perwarna menjadi kering tetesi kembali pewarnanya. Kemudian dicuci dengan air mengalir selama 20-30 detik, setelah itu diberi safranin selama 30 detik. Setelah itu dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Hasilnya diamati di bawah mikroskop dan digambar.

2.2.4 Pengecatan endospora yeast (Saccaromyces cereviseae)

Langkah pertama yang dilakukan adalah preparat diberi aquades 1 tetes kemudian ditambahkan biakan (Saccharomyces cerevisiae) sedikit dengan menggunakan jarum ose Dibiarkan dulu sampai kering dan difiksasi, setelah difiksasi diberi perwarna violet kristal. Setelah itu dipanaskan 3 menit tetapi jangan sampai kering, jika mulai kering ditambahkan violet kristal 1 tetes lagi. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan alcohol, Setelah itu dikeringkan. Setelah kering diberi warna yang kedua yaitu safranin, didiamkan selama 10 detik dan dicuci dengan air mengalir. Kemudian dikeringkan, hasilnya diamati di bawah mikroskop dan digambar.3. HASIL PENGAMATANJenis pengecatanJenis mikroorganismeGambarKeterangan

Pengecatan sederhanaBacillus subtilisPerbesaran : 40 x 10Warna : biru

Bentuk : bacillus, berkoloni1. MO

Pengecatan sederhanaStreptococcus thermophilusPerbesaran : 40 x 10Warna : biru

Bentuk : coccus, menyebar1. MO

Pengecatan gramEcherichia coliPerbesaran : 40 x 10Warna : merahBentuk : fibrio, menyebar1. MO 2. pewarna

Pengecatan gramStreptococcus thermophilusPerbesaran : 40 x 10Warna : merahBentuk : coccus, menyebar1. MO

EndosporaBacillus subtilisPerbesaran : 40 x 10Warna : hijauBentuk : bacillus, berkoloni1. MO

EndosporaSacharomyses cerevisiae.Perbesaran : 40 x 10Warna : merah mudaBentuk : coccus, berkoloni1. MO

4. PEMBAHASANPada praktikum kali ini masing-masing kelompok mencoba untuk mengamati morfologi dari bakteri dan spora yeast. Karena ukurannya sangat kecil dan tidak dapat dilihat dengan mata telanjang serta pada mikroskop kurang jelas kenampakannya maka diperlukan suatu pewarnaan atau pengecatan untuk memperjelas morfologi dari masing-masing mikroba. Ini sesuai dengan pernyataan Hadioetomo (1993), bahwa kebanyakan sel mikrobia tidak berwarna atau mempunyai pigmen yang sangat sedikit dan tidak dapat mengadsorbsi ataupun membiaskan cahaya sehingga tidak dapat dilihat dengan mudah pada mikroskop karena indeks bias sitoplasma sel yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan mewarnai sel-sel tersebut dengan sel warna. Oleh karena itu, penggunaan zat warna terhadap bakteri yang dilakukan pada percobaan bertujuan supaya zat warna dapat mengadsorbsi atau membiaskan cahaya sehingga dapat meningkatkan kontras dengan sekelilingnya dan struktur sel bakteri dapat diamati.

Pada setiap proses pengecatan yang dilakukan, baik pengecatan sederhana, pengecatan gram, ataupun pengecatan endospora, selalu dilakukan proses fiksasi. Proses fiksasi ini dilakukan dengan cara melewatkan gelas benda pada nyala api spirius beberapa kali selama 1-2 detik. Proses ini bertujuan untuk lebih melekatkan bakteri pada gelas benda dan mematikan bakteri, karena sebenarnya bakteri yang hidup tidak dapat diamati, karena pada bakteri hidup, selnya tidak mengandung pigmen atau transparan, karena indeks bias sitoplasmanya hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair (Lay, 1994). Ini sesuai dengan yang kami lakukan dalam praktikum.Ada dua macam cara pewarnaan yang dilakukan selama percobaan, yakni pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram. Menurut Fardiaz (1992), pewarnaan bakteri dapat dibedakan atas beberapa golongan, yang meliputi :a. Pewarnaan sederhana

b. Pewarnaan diferensial

pewarnaan gram

pewarnaan asam cepat (acid-fast)

c. pewarnaan struktural

pewarnaan inti sel (Feulgen), yaitu pewarnaan inti sel bakteri

pewarnaan endospora, yaitu pewarnaan spora bakteri

pewarnaan dinding sel, yaitu pewarnaan dinding sel dari bakteri

pewarnaan kapsul, yaitu pewarnaan kapsul yang dibentuk oleh bakteri

pewarnaan flagella, yaitu pewarnaan flagel / alat gerak bakteri

d. pewarnaan untuk menguji komponen dalam sel seperti Glikogen, Lipida.

Percobaan yang pertama adalah pewarnaan sederhana dari bakteri Bacillus subtilis dan Streptococcus thermophilus. Proses pengamatan bakteri tidak akan sempurna jika kenampakan yang diperoleh kurang jelas, pewarnaan berguna untuk memperjelasnya. Pengecatan sederhana yang dilakukan dengan pemberian warna terlebih dahulu pada bakteri sebelum dilihat mikroskop, bertujuan untuk mengetahui ciri-ciri tertentu bakteri. Hal ini dikarenakan bakteri hidup sukar untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri-sendiri, walaupun biakan secara keseluruhan mungkin berwarna (Volk & Wheeler, 1993). Dikatakan oleh Lay (1994), bahwa pengecatan sederhana adalah pewarnaan yang paling sederhana, dimana pada pengecatan ini hanya dilakukan dengan penambahan satu zat pewarna atau hanya melalui satu tahap pewarnaan saja pada olesan bakteri. Ini sesuai dengan yang kami lakukan, karena hanya melewati satu tahap pewarnaan dalam pewarnaan sederhana. Pewarna yang dipakai adalah Methylen blue loefler (metilen biru). Pada percobaan pengecatan dilakukan dengan zat warna yang bersifat basa yaitu biru metilen (Lay, 1994). Hubungan bakteri dengan zat perwarna basa yang menonjol disebabkan oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi jika bakteri diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa. Oleh karena itu, pada percobaan digunakan metilen loeffer yang memiliki sifat basa dan alkalin sebagai pewarna sederhana. Pewarna alkalin lain yang umumnya digunakan dapat berupa pewarna basa seperti metylen blue, basic fuschin, dan violet kristal (Volk dan Wheller, 1993). Setelah diamati pada mikroskop dengan perbesaran 40 x 10 terlihat bahwa B. subtilis bentuknya basil (batang), berkoloni, dan berwarna biru. Warna biru tersebut muncul setelah adanya penambahan metilen biru. Bacillus subtilis adalah jenis bakteri yang menghasilkan spora berbentuk silinder yang tidak membengkak, sporanya langsing dan tidak melebihi diameter 0,9 m (Fardiaz, 1992). Bacillus subtilis merupakan bakteri berwujud silinder terentang (Schlegel & Schmidt,1994). Sedangkan pada Streptococcus thermophilus dengan perbesaran mikroskop 40 x 10 terlihat bahwa bentuknya bulat (coccus), menyebar, dan warnanya biru. Streptococcus merupakan bakteri berbentuk bulat yang hidup secara berpasangan, atau membentuk rantai pendek dan panjang tergantung dari spesies dan kondisi pertumbuhannya (Fardiaz, 1992). Sama seperti B.subtilis warna biru yang muncul juga dikarenakan adanya penambahan metilen biru. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna sederhana, karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka basa), dan zat-zat warna yang digunakan dalam pengecatan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif) (Hadioetomo, 1993). Jadi karena sifat metilen biru yang basa maka akan mudah menempel pada bakteri dan sulit hilang.

Dengan dilakukannya pewarnaan sederhana ini terlihat bahwa masing-masing bakteri memiliki bentuk yang berbeda-beda. Pengecatan sederhana yang dilakukan memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (kokus, basilus, vibrio, sprilum, dan sebagainya) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai (Hadioetomo, 1993).

Percobaan yang kedua adalah pewarnaan bakteri dengan cara pewarnaan gram. Ada dua bakteri yang dipakai yakni Echerichia coli dan Streptococcus thermophilus. Digunakan beberapa macam pewarna dalam praktikum ini, yakni violet kristal, larutan iodium gram (lugol), dan safranin. Dalam pengecatan gram pada bakteri, digunakan zat warna primer (violet kristal), larutan mordan (iodin), bahan peluntur (alkohol), dan zat warna penutup (safranin). Larutan mordan berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri, sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat, memperjelas zat warna, mempersulit pelarutan zat warna, dan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks kristal violet-yodium. Sedangkan etanol, berfungsi untuk melunturkan zat warna primer dengan daya kerja lambat, sehingga memperkecil kemungkinan terjadinya pemucatan yang berlebihan. Fungsi penambahan zat warna penutup adalah sebagai pembeda (kontras) terhadap zat warna primer, dan juga untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan zat warna primernya (Lay, 1994).

Pengecatan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling benyak digunakan dalam laboratorium. Selain itu pengecatan gram merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri. Pengecatan gram ini dapat digunakan untuk memilah bakteri menjadi kelompok gram negatif atau gram positif (Lay, 1994). Pebedaan bakteri gram positif dan gram negatif :

Pada saat pengecatan dengan cat utama, bakteri gram positif maupun gram negatif akan mengikat violet kristal dan menunjukkan warna ungu atau biru tua.

Pada saat penambahan mordan, pada bakteri gram positif maupun gram negatif sama-sama akan terbentuk kompleks violet kristal dengan lugol atau iodin dan tetap berwarna biru.

Pada saat pelarutan, bakteri gram positif akan mengalami dehidrasi membran sel namun tidak sampai pecah dan pori-porinya mengecil sehingga kompleks violet kristal dan lugol atau iodin tetap tertinggal di dalam sel dan bakteri tetap berwarna biru atau ungu. Sedangkan pada bakteri gram negatif, akan terdehidrasi sampai lemaknya terekstraksi dan pori-pori pada membrannya akan melebar sehingga semua kompleks violet kristal dan lugol atau iodin akan keluar dan sel bakteri menjadi tidak berwarna.

Pada saat penambahan cat penutup, bakteri gram positif tidak berpengaruh apa-apa dan warnanya tetap biru atau ungu. Sedangkan bakteri gram negatif akan mengikat cat penutup tersebut dan menjadi berwarna merah.

(Trihendrokesowo, 1989). Sewaktu pengamatan terlihat bahwa E.coli bentuknya fibrio, menyebar, dan warnanya merah. Ini berarti E.coli merupakan bakteri gram negatif. Pada pengamatan Streptococcus thermophilus terlihat bentuknya batang (coccus), menyebar, dan warnanya merah. Menurut Hadioetomo (1993), Beberapa jenis bakteri yang merupakan jenis bakteri gram (-) adalah Eschericia coli, Enterobacter aerogenes, dan kelompok Pseudomonas. Sedangkan yang termasuk bakteri gram (+) adalah kelompok Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Streptococcus. Terlihat bahwa ketidakcocokan terjadi pada Streptococcus thermophilus kami. Seharusnya warnanya adalah tetap ungu tua atau biru kalau menurut teori. Kemungkinan kesalahan terjadi karena penyemprotan alkohol yang berlebihan. Etanol 95% berfungsi sebagai larutan pemucat yang akan melarutkan zat warna utama, namun larutan ini bekerja lambat sehingga memperkecil kemungkinan terjadinya pemucatan yang berlebihan. Iodin merupakan larutan mordan, yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan cat utama dan berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan ini menjadi lebih kuat (Hadioetomo, 1993).

Percobaan yang ketiga adalah pewarnaan endospora. Ada dua mikroba yang dipakai yakni B.subtilis dan Sacharomyses cerevisiae. Pada B.subtilis pewarna yang digunakan adalah pewarna hijau malasit dan safranin sedang pada Sacharomyses cerevisiae pewarnanya violet kristal dan safranin. Endospora sukar untuk diwarnai oleh pewarna biasa. Endospora merupakan struktur di dalam sel pada tempat tempat yang khas yang dibentuk oleh bakteri jenis jenis tertentu, misalnya bakteri genus Bacillus dan Clostridium (Hadioetomo, 1993). Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa, karenanya harus digunakan pewarna spesifik, dan yang biasa digunakan adalah pewarna hijau malasit (malachite green) (Fardiaz, 1998). Sewaktu pengamatan B.subtilis terlihat bahwa bentuknya batang (basil), berkoloni, dan warnanya hijau. Bacillus subtilis merupakan bakteri berwujud silinder terentang (Schlegel & Schmidt,1994). Karena bentuknya batang maka B.subtilis dapat membentuk endospora. Bakteri pembentuk endospora umumnya adalah bakteri berbentuk batang, dan setelah membentuk endospora, sporangium mati dan akhirnya lisis dan spora bekas ukurannya cukup besar dan dapat dilihat di mikroskop (Hadioetomo, 1993). Endospora hanya terdapat dalam bakteri berbentuk batang (basilus) dan dapat dilihat dengan pewarnaan endospora (Lay, 1994). Setelah diwarnai warna B.subtilis berubah menjadi hijau ini semakin menunjukkan bahwa B.subtilis memiliki endospora. Pada pengamatan Sacharomyses cerevisiae terlihat bahwa bentuknya bulat (coccus), berkoloni, dan warnanya merah muda. Ini menunjukkan bahwa tidak hanya bakteri bentuk batang saja yang bisa membentuk endospora, tapi yeast juga bisa membentuknya.5. KESIMPULAN

Pewarnaan bakteri dapat digolongkan menjadi pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan struktural, dan pewarnaan untuk menguji keberadaan komponen tertentu di dalam sel.

Pengecatan sederhana adalah pewarnaan yang paling sederhana, dimana pada pengecatan ini hanya dilakukan dengan penambahan satu zat pewarna atau hanya melalui satu tahap pewarnaan saja pada olesan bakteri.

Pengecatan sederhana yang dilakukan memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (kokus, basilus, vibrio, sprilum, dan sebagainya) Pengecatan gram adalah pewarnaan atau pengecatan dengan melalui beberapa tahap pengecatan dengan beberapa reagen yang berbeda.

Pengecatan endospora adalah pengecatan yang bertujuan untuk mengamati endospora, dimana tidak semua jenis bakteri mampu membentuk endospora.

Adapun 3 bentuk dasar sel bakteri : batang (baccil), bulat (coccus), dan lengkung (koma, vibrion, dan spiral). Dalam pengecatan gram pada bakteri, digunakan zat warna primer (violet kristal), larutan mordan (iodin), bahan peluntur (alkohol), dan zat warna penutup (safranin). Dalam menyiapkan preparat tidak boleh terlalu tebal.

Pewarnaan gram memisahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif.

Beberapa jenis bakteri yang merupakan jenis bakteri gram (-) adalah Eschericia coli, Enterobacter aerogenes, dan kelompok Pseudomonas. Beberapa jenis bakteri yang termasuk bakteri gram (+) adalah kelompok Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Streptococcus. Pada saat penambahan cat penutup, bakteri gram positif tidak berpengaruh apa-apa dan warnanya tetap biru atau ungu. Bakteri gram negatif akan mengikat cat penutup tersebut dan menjadi berwarna merah. Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri.

Endospora hanya terdapat dalam bakteri berbentuk batang (basilus) dan dapat dilihat dengan pewarnaan endospora.

Pengecatan bakteri akan berhasil, jika sebelum melakukan pengecatan diperlukan penyiapan preparat yang baik, yaitu tidak terlalu tebal atau terlalu tipis, tetap melekat pada gelas preparat selama pencucian berulang-ulang, sel-selnya tidak berubah bentuk atau morfologi setelah fiksasi dan pengecatan.6. DAFTAR PUSTAKA

Cappuccino, I.G. & N. Sherman. (1983). Microbiology a Laboratory Manual. Addison-Wesley Publishing Company. Massachuset.

Fardiaz, S. ( 1992 ). Mikrobiologi Pangan 1. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Gaman, P. M. & K. B. Sherrington. (1994). Ilmu Pangan. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Hadioetomo, R. S. ( 1993 ). Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Hadioetomo, R.S. (1993). Mikobiologi Dasar dalam Praktek, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.Lay, B. W. ( 1994 ). Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.

Schlegel, H.G. & K. Schmidt. (1994). Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.Timotius, K. H. ( 1982 ). Mikrobiologi Dasar. Universitas Kristen Satya Wacana. Salatiga.

Trihendrokesowo. (1989). Petunjuk Laboratorium Mikrobiologi Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. Yogyakarta.Volk, W.A. & M.F. Wheeler. (1993). Mikrobiologi Dasar. Erlangga. Jakarta.

7. LAMPIRAN

PAGE