uji stabilitas igg anti escherichia coli k99 asal ... · work effectively. the objective of this...

UJI STABILITAS IgG ANTI Escherichia coli K99 ASAL

KOLOSTRUM SAPI DALAM KEMASAN

MIKROKAPSUL

DINI NURWAHYUNI

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2015

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Uji Stabilitas IgG Anti

Escherichia coli K99 Asal Kolostrum Sapi dalam Kemasan Mikrokapsul adalah

benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan

dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang

berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari

penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di

bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Januari 2015

Dini Nurwahyuni

NIM B04100047

ABSTRAK

DINI NURWAHYUNI. Uji Stabilitas IgG Anti Escherichia coli K99 Asal

Kolostrum Sapi dalam Kemasan Mikrokapsul. Dibimbing oleh SRI MURTINI

dan ANITA ESFANDIARI.

Teknik mikroenkapsulasi berfungsi untuk melindungi IgG anti Escherichia

coli (E. coli) K99 asal kolostrum sapi terhadap pengaruh pH di saluran pencernaan

sehingga IgG anti E. coli dapat bekerja secara efektif. Tujuan penelitian ini adalah

untuk mengevaluasi stabilitas IgG anti E. coli K99 asal kolostrum sapi dalam

mikrokapsul menggunakan teknik agar gel presipitation test (AGPT) dan enzyme

linked immunosorbent assay (ELISA). Imunoglobulin G (IgG) murni asal

kolostrum dikemas dalam mikrokapsul dengan waktu penyalutan selama 30 dan

60 menit. Keberadaan dan spesifisitas IgG anti E. coli diamati dalam mikrokapsul

yang dilarutkan dengan larutan penyangga 0.2 M NaHCO3 dan 0.06 M

Na3C6H5O7.2H2O pH 8. Pelarutan kemudian diatur dalam kondisi asam dan basa

(8, 4, dan 9). Keberadaan IgG dideteksi dengan teknik ELISA tidak langsung,

sedangkan spesifisitasnya dideteksi dengan teknik AGPT dan ELISA tidak

langsung. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa konsentrasi IgG total dari

mikrokapsul dengan waktu penyalutan 30 dan 60 menit berkisar antara 0.971–

1.012 μg/ 100 μl. Hasil uji ELISA dan AGPT menunjukkan reaksi negatif antara

IgG anti E . coli dari pelarutan mikrokapsul terhadap antigen E. coli K99,

sedangkan reaksi positif ditunjukkan oleh IgG anti E. coli tanpa penyalutan. Hasil

negatif diduga akibat rusaknya IgG anti E. coli selama proses pelarutan.

Kata kunci: AGPT, E. coli K99, ELISA, IgG, mikrokapsul

ABSTRACT

DINI NURWAHYUNI. Stability Test of IgG Anti Escherichia coli K99 from

Bovine Colostrum in Microcapsule. Supervised by SRI MURTINI and ANITA

ESFANDIARI.

The function of microencapsulation technique is to protect the IgG anti

Escherichia coli (E. coli) K99 from bovine colostrum towards pH effect in the

digestive tract so it can work effectively. The objective of this experiment is to

evaluate the stability of IgG anti E. coli K99 from bovine colostrum in

microcapsule using agar gel presipitation test (AGPT) and enzyme linked

immunosorbent assay (ELISA) techniques. Purified IgG from colostrum were

packaged in the form of coated-microcapsules 30 and 60 minutes. The occurrence

and spesificity of IgG anti E. coli in was observed in microcapsules diluted with

0.2 M NaHCO3 and 0.06 M Na3C6H5O7.2H2O buffer pH 8. The dilution was

subsequently subjected to acid and alkali condition (8, 4, and 9). The IgG anti E.

coli occurrence was detected with indirect ELISA technique, while it specificity

were detected by AGPT and indirect ELISA techniques. The result show that total

IgG concentration from coated microcapsules of 30 and 60 minutes were 0.971–

1.012 μg/ 100 μl. ELISA and AGPT showed negative reaction between

microcapsule diluted IgG anti E. coli againts E. coli K99 antigens, in contras with

positive reaction in IgG anti E. coli uncoated. The negative result suspected due

to the destruction of IgG anti E. coli during the dilution process.

Keywords: AGPT, E. coli K99, ELISA, IgG, microcapsule.

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran Hewan

UJI STABILITAS IgG ANTI Escherichia coli K99 ASAL

KOLOSTRUM SAPI DALAM KEMASAN

MIKROKAPSUL

DINI NURWAHYUNI

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2015

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberi

kekuatan dan hidayah sehingga penulis dapat menyusun skripsi ini. Tema yang

dipilih dalam penelitian adalah ”Uji Stabilitas IgG Anti Escherichia coli K99 Asal

Kolostrum Sapi dalam Kemasan Mikrokapsul”. Penyusunan skripsi ini dilakukan

sebagai salah satu syarat memeperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada

Fakultas Kedokteran Hewan.

Penulis menyampaikan terima kasih kepada Dr Drh Sri Murtini, MSi selaku

pembimbing I dan Dr Drh Anita Esfandiari, MSi selaku pembimbing II yang telah

memberikan bimbingan dan pengarahan selama penyusuna skripsi ini. Ucapan

terima kasih juga disampaikan kepada Papa (Wahyudin, MSi), Mama (Tini

Maryani), adik (Dina Nurwahyuni dan Arif Muhammad Nurdin) dan seluruh

keluarga atas doa dan kasih sayangnya. Teman-tema Acromion 47 khususnya

Shine, Shovia, Intan, Abid, Donny, Nafisatul, Riena, serta keluarga Ginastri atas

dukungan dan semangat yang tak henti-hentinya sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Penulis juga mengucapkan terima kasih

kepada teman satu tim penelitian (Amanda), serta semua pihak di Laboratorium

Reproduksi Balai Penelitian Ternak (Balitnak) Ciawi, Bogor atas bantuan dan

kerja samanya.

Semoga penulis dapat menghasilkan laporan yang bermanfaat khususnya

bagi penulis, umumnya bagi pembaca.

Bogor, Januari 2015

Dini Nurwahyuni

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL ix

DAFTAR GAMBAR ix

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Tujuan Penelitian 2

Manfaat Penelitian 2

METODE PENELITIAN 2

Waktu dan Tempat 2

Bahan 3

Alat 3

Metode 3

Purifikasi IgG Anti E. coli K99 3

Pembuatan Mikrokapsul 4

Pengujian Keberadaan IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul 4

Pengukuran konsentrasi IgG total dalam Mikrokapsul dengan ELISA 4

Deteksi IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul dengan Teknik AGPT 5

Deteksi IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul dengan Teknik ELISA 5

Analisis Data 6

HASIL DAN PEMBAHASAN 6

Pengukuran Konsentrasi IgG total dalam Mikrokapsul dengan ELISA 6

Deteksi IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul dengan Teknik AGPT 8

Deteksi IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul dengan Teknik ELISA 9

KESIMPULAN 10

SARAN 10

DAFTAR PUSTAKA 10

RIWAYAT HIDUP 13

DAFTAR TABEL

1 Rataan absorbansi standar dan persamaan regresi linear 7 2 Rata-rata konsentrasi IgG total (μg/ 100 μl) dalam mikrokapsul 7 3 Nilai absorbansi IgG anti E. coli K99 9

DAFTAR GAMBAR

1 Hasil uji ELISA 7 2 Hasil AGPT kontrol 8 3 Hasil AGPT perlakuan 8

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Diare merupakan gejala adanya gangguan pencernaan yang ditandai dengan

pengeluaran feses dalam jumlah dan frekuensi melebihi normal dengan

konsistensi cair. Feses dikeluarkan oleh penderita tanpa kesulitan karena terjadi

peningkatan peristaltik usus (Ganong 2002). Diare dapat disebabkan oleh

beberapa macam mikroorganisme, salah satunya Escherichia coli (E. coli).

Escherichia coli tersebar di seluruh dunia dan dapat ditularkan melalui air atau

pakan yang terkontaminasi oleh tinja. E. coli merupakan salah satu bakteri

penyebab kolibasilosis pada anak sapi, terutama pada periode neonatal. E. coli

juga merupakan suatu agen penyakit pada hewan peka yaitu hewan menyusui dan

hewan muda terutama hewan yang berumur kurang dari satu minggu (Carter dan

John 1990). Agen infeksius ini memiliki banyak serotipe dan serotipe yang

banyak terdapat di lapangan adalah E. coli enterotoxigenic (ETEC) K99, F41 atau

K99F41 (Supar 1996).

Escherichia coli K99 merupakan bakteri penting karena menyebabkan diare

yang mematikan pada anak sapi (Supar et al. 1998). Prevalensi diare pada anak

sapi perah akibat kolibasilosis berkisar antara 20–31% dengan tingkat mortalitas

65–85% (Supar 2001). Tingginya tingkat mortalitas pada anak sapi penderita

kolibasilosis sangat merugikan peternak. Kerugian yang timbul tidak hanya

berupa kematian, namun juga meningkatnya biaya pengobatan dan perawatan,

penurunan berat badan, serta terganggunya pertumbuhan.

Pengobatan diare menggunakan antibiotik dinilai ampuh untuk membunuh

bakteri. Penggunaan antibiotik secara berlebihan untuk pengobatan kolibasilosis

menyebabkan terjadinya resistensi terhadap antibiotik. Penelitian Supar (2001)

menunjukkan adanya resistensi bakteri E. coli K99 terhadap 9-15 macam

antibiotika yang sering dipakai di lapangan. Hal ini mengindikasikan bahwa

antibiotik tidak efektif untuk pengobatan dan pengendalian kolibasilosis.

Pendekatan melalui imunisasi pasif melalui pemberian kolostrum dapat dijadikan

alternatif untuk penanggulangan kasus diare akibat infeksi oleh ETEC K99

(Esfandiari et al. 2009).

Kolostrum merupakan sekresi yang dihasilkan oleh kelenjar ambing

mamalia pada tahap akhir kebuntingan sampai tiga hari setelah melahirkan

(Tizard 2004). Kolostrum mengandung dua komponen utama yaitu faktor

pertumbuhan dan faktor imunitas (Thapa 2005). Salah satu faktor imun yang

penting dalam kolostrum adalah antibodi (IgG) untuk kepentingan imunisasi pasif

dari induk kepada anaknya yang baru lahir (Selk 2006). Hal ini penting karena

anak sapi yang baru lahir tidak mendapatkan antibodi dari induk melalui plasenta

sehingga antibodi mutlak didapatkan dari kolostrum sebagai pasokan IgG (Tizard

2000).

Imunoglobulin G kolostrum menunjukan efektifitasnya melawan sejumlah

patogen saluran pencernaan, diantaranya Enterotoxigenic Escherichia coli

(ETEC) (Esfandiari et al. 2011). Stabilitas molekul IgG sangat dipengaruhi oleh

lingkungan saluran pencernaan. Aktivitas biologis dari IgG akan menurun dan

rusak oleh kondisi lingkungan saluran pencernaan, terutama rendahnya pH

2

(keasaman lambung) dan digesti enzim pepsin (Esfandiari et al. 2008). Stabilitas

IgG menjadi sangat penting apabila akan digunakan untuk terapi imunisasi pasif

yang diberikan secara oral.

Teknik mikroenkapsulasi pada penelitian ini bertujuan melindungi IgG anti

E. coli K99 asal kolostrum terhadap pengaruh pH di saluran pencernaan sehingga

IgG dapat bekerja secara efektif. Efektifitas IgG anti E. coli yang telah disalut

oleh kitosan-alginat menjadi mikrokapsul perlu diuji stabilitasnya. Uji stabilitas

dapat dilakukan dengan uji serologis seperti agar gel precipitation test (AGPT)

dan enzyme linked immunosorbant assay (ELISA). Agar gel presipitation test

merupakan salah satu teknik untuk menganalisa atau mendeteksi keberadaan

antibodi spesifik terhadap antigen tertentu pada media agar. Antigen dan antibodi

yang diuji harus mampu terlarut dalam agar, sehingga dapat berdifusi dan

membentuk garis presipitasi apabila antigen dengan antibodi tersebut homolog.

Enzyme linked immunosorbant assay merupakan salah satu uji primer untuk

mengukur interaksi antara antibodi dan antigen. Reaksi ikatan antigen dan atibodi

dideteksi dengan antibodi yang dikonjugasikan dengan enzim. Uji ini lebih

sensitif dan tidak berbahaya karena tidak menggunakan bahan radioaktif

(Suwarno 2003).

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi stabilitas IgG anti Escherichia

coli K99 asal kolostrum sapi dalam kemasan mikrokapsul menggunakan teknik

agar gel presipitation test (AGPT) dan enzyme linked immunosorbant assay

(ELISA).

Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang

keberadaan dan stabilitas IgG anti Escherichia coli K99 asal kolostrum sapi dalam

kemasan mikrokapsul tersalut kitosan-alginat.

METODE PENELITIAN

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan selama sembilan bulan yang dimulai pada bulan

Maret sampai dengan November 2014. Penelitian dilakukan di Laboratorium

Reproduksi Balai Penelitian Ternak (Balitnak) Ciawi, Laboratorium Bakteriologi

Balai Besar Penelitian Veteriner (Bbalitvet) Bogor, Laboratorium Patologi Klinik

Divisi Penyakit Dalam, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi,

Laboratorium Terpadu Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat

Veteriner, dan Laboratorium Terpadu, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.

3

Bahan

Bahan yang digunakan meliputi sampel kolostrum, amonium sulfat,

akuabides steril, phosphate buffer saline (PBS), larutan Brad Fort, sodium alginat,

kitosan, CaCl2, NaOH, akuades, 0.2 M NaHCO3, 0.06 M Na3C6H5O7.2H2O,

Agarose (0.9%-1%), NaCl 0.85%, antigen E. coli K99, larutan buffer karbonat

bikarbonat pH 9.6, larutan Phosphate Buffer Saline Tween-20 (PBST), larutan

PBS skim 5%, konjugat anti bovine IgG peroxidase (Cat. No. A-5295, Sigma

Chemical Co), substrat TMB.

Alat

Alat yang digunakan meliputi refrigerator, freezer, tabung mikrosentrifus,

alat sentrifus, kantong dialisis membran nitroselulosa, benang nilon, vorteks,

Encapsulator BUCHI B–390(R)

, pH meter, mikroskop cahaya, gelas obyek,

beakerglass, stirrer, magnet pengaduk, batang pengaduk kaca, gelas ukur 100 mL,

pipet ukur 10 mL, mikro pipet, timbangan, kertas perkamen, sudip, tabung

erlenmeyer, alat penyaring, alumunium foil, gelas arloji, timer, kamera, gelas

obyek, puncher, pipet pasteur, kertas saring, tabung mikro, cawan polysterene 96

sumuran (Nunc(R)

), inkubator, dan alat pembaca mikro-ELISA.

Metode

Kolostrum yang mengandung IgG anti E. coli K99 diperoleh dari induk sapi

yang divaksin dengan vaksin E. coli polivalen pada saat bunting trimester akhir.

Purifikasi IgG anti E. coli K99

Teknik purifikasi yang digunakan pada penelitian ini yaitu presipitasi garam

(presipitasi dengan 40% amonium sulfat jenuh). Kolostrum kontrol (tidak

mengandung anti E. coli) dan kolostrum yang mengandung anti E. coli masing-

masing sebanyak 300 ml dihomogenkan dengan stirrer, kemudian ditambahkan

amonium sulfat sebanyak 73 gram sedikit demi sedikit sampai mengental dan

homogen. Kolostrum yang telah ditambah amonium sulfat disentrifus dengan

kecepatan 5000 rpm pada suhu 4 ˚C selama 30 menit sampai terjadi pemisahan

antara supernatan dan pelet. Supernatan dan pelet dimasukkan ke dalam tabung

yang berbeda dan diberi label. Sebanyak 25 gram pelet dari kolostrum kontrol dan

perlakuan dilarutkan dalam 50 ml larutan PBS dan dihomogenkan menggunakan

vorteks. Setelah itu, supernatan dan pelet disimpan dalam refrigerator untuk

selanjutnya dilakukan proses dialisis.

Proses dialisis dilakukan dengan memasukkan 25 ml pelet kolostrum hasil

pengendapan amonium sulfat ke dalam kantong dialisis (berupa membran

netroselulosa). Selanjutnya kantong dialisis di masukkan dalam 1 liter PBS dan

diaduk menggunakan stirrer selama 24 jam pada suhu 40 ˚C dengan melakukan

pergantian pelarut dialisis setiap 6 jam sekali. Hasil proses dialisis ini berupa IgG

murni berasal dari kolostrum yang akan digunakan pada proses pembuatan

mikrokapsul.

.

4

Pembuatan Mikrokapsul

Mikrokapsul kolostrum yang mengandung IgG anti E. coli dibuat

berdasarkan modifikasi metode Li et al. (2007) dengan penyalut kitosan-alginat

menggunakan mesin Microencapsulator BUCHI B–390(R)

. Pembuatan

mikrokapsul dilakukan dengan metode ekstruksi yaitu mencampurkan larutan

hidrokoloid seperti alginat dengan suspensi IgG kemudian diekstruksi melalui

jarum (nozzle) dalam bentuk butiran ke dalam larutan pengeras seperti kalsium

klorida (Krasaekoopt et al. 2003). Mikrokapsul dibuat melalui beberapa tahap,

yaitu pembuatan mikrokapsul kitosan-alginat blanko dan dilanjutkan dengan

pembuatan mikrokapsul kitosan-alginat yang berisi sampel IgG murni.

Pembuatan mikrokapsul kitosan-alginat blanko dan mikrokapsul berisi IgG

anti E. coli murni dimulai dengan membuat larutan alginat 3% yang ditambahkan

akuades dengan perbandingan 1:1 (10 ml : 10 ml) kemudian dihomogenkan

menggunakan stirrer. Setelah larutan homogen, dilakukan proses pembuatan

mikrokapsul menggunakan alat Microencapsulator BUCHI B–390(R)

, dengan

ukuran nozzle 300, frekuensi 1000, elektroda 650, pressure 209–210 untuk

mikrokapsul blanko dan pressure 432 untuk mikrokapsul berisi sampel. Butiran

mikrokapsul yang dihasilkan kemudian ditampung dengan larutan CaCl2 yang

diaduk menggunakan stirrer agar butiran mikrokapsul tidak saling menempel satu

sama lain. Butiran mikrokapsul tersebut dicuci dengan akuades sebanyak tiga kali

pengulangan kemudian direndam dalam larutan kitosan 1% pH 4.0 dengan lama

perendaman 30 menit dan 60 menit. Mikrokapsul yang telah tersalut kitosan

dicuci dengan akuades sebanyak lima kali, lalu disimpan di refrigerator dalam

keadaan terendam akuades. Penyalutan dengan CaCl2 dan kitosan tersebut

menggunakan metode Areekul et al. (2006) sebagai two step method.

Pengujian Keberadaan IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul

Sebelum dilakukan pengujian IgG anti E. coli dalam mikrokapsul, sampel

mikrokapsul blanko maupun mikrokapsul berisi IgG anti E. coli dilarutkan

menurut metode Xue et al. (2004) ke dalam 5 ml larutan campuran 0.2 M

NaHCO3 dan 0.06 M Na3C6H5O7.2H2O pada pH 8. Imunoglobulin G yang telah

terlepas dari mikrokapsul kemudian diuji kandungan IgG anti E. coli dengan uji

AGPT dan ELISA. Sampel yang digunakan untuk uji ELISA diatur pH dalam

kondisi asam dan basa (normal, 4, dan 9). Sampel yang digunakan berupa IgG anti

E. coli dari mikrokapsul dengan waktu penyalutan 30 dan 60 menit, IgG kontrol

dan IgG anti E. coli non enkapsulasi hasil pemurnian dari kolostrum.

A. Pengukuran konsentrasi IgG total dalam mikrokapsul dengan ELISA

Anti-bovine IgG diencerkan dalam larutan buffer karbonat bikarbonat pH 9.6

dengan konsentrasi 3.5 µg/ml. Anti-bovine IgG kemudian dimasukkan ke dalam

semua sumuran cawan ELISA sebanyak 100 μl/ sumur (coating). Cawan ditutup

dan diinkubasi semalam pada suhu 4 ˚C. Setelah itu cawan ELISA dicuci dengan

PBS Tween–20 sebanyak lima kali.

Sebagai larutan blocking digunakan PBS Skim 5%. Larutan tersebut

kemudian dimasukkan ke dalam semua sumuran cawan ELISA sebanyak 100 μL/

sumur. Cawan diinkubasi selama satu jam pada suhu 37 ˚C selanjutnya dicuci

kembali lima kali dengan PBS Tween–20.

5

Sebanyak 100 μl larutan standar (IgG sapi) konsentrasi 0.5, 1, 2, 4, dan 8

dimasukkan masing–masing ke dalam dua sumuran cawan yang berbeda.

Sedangkan sampel yang akan diuji dimasukkan ke dalam sumuran cawan yang

lain sebanyak 100 μl/ sumur sesuai dengan pola yang telah ditentukan. Cawan

ELISA kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37 ˚C selama 1 jam lalu

dilakukan pencucian seperti prosedur di atas.

Sebanyak 100 μL konjugat anti-bovine IgG peroxidase yang diencerkan

1:10000 dimasukkan ke dalam semua sumur lalu diinkubasi pada suhu 37 ˚C

selama satu jam. Cawan ELISA dicuci kembali lima kali dengan PBS Tween–20

dan sebanyak 100 μL substrat TMB dimasukkan ke dalam setiap sumur. Cawan

ELISA kemudian diinkubasi pada suhu 37 ˚C selama 15 menit sampai ada

perubahan warna. Hasil reaksi diukur dengan alat pembaca ELISA pada panjang

gelombang 655 nm. Berdasarkan nilai absorbansi standar dihitung konsentrasi

IgG total dalam mikrokapsul menggunakan persamaan regresi linear dengan nilai

absorbansi sebagai Y dan X sebagai konsentrasi.

B. Deteksi IgG anti E. coli K99 dalam mikrokapsul dengan teknik AGPT

Sebanyak 0.1 gram agarose ditambahkan ke dalam 10 ml NaCl 8.5%

kemudian dimasukkan ke dalam autoclave dengan tekanan 15 lb selama 15 menit.

Agarose dipertahankan dengan menambahkan 0.1% sodium azide. Gelas objek

dibersihkan kemudian pada permukaan yang datar dituangkan sebanyak 3.5 ml

agarose hangat lalu dibiarkan sampai dingin dan mengeras. Sumur-sumur pada

gel dibuat dengan menggunakan puncher. Pola yang digunakan yaitu satu sumur

tengah yang dikelilingi oleh enam sumur perifer.

Antigen E. coli yang digunakan merupakan isolat bakteri E. coli yang

dibiakkan pada media nutrient agar (NA) lalu dicuci dengan larutan PBS. Antigen

E. coli kemudian disentrifus dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Setelah

itu, antigen E. coli dapat dipecah menggunakan sonikasi pada suhu 4 ˚C selama 20

menit.

Antigen E. coli dimasukkan pada sumur tengah, sedangkan sampel IgG anti

E. coli yang akan diuji dimasukkan ke dalam masing-masing sumur perifer

dengan menggunakan pipet pasteur. Gelas obyek diletakkan di atas kertas saring

basah agar kelembaban dapat terjaga dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24–

48 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya garis presipitasi (garis buram

putih) di antara sumur antigen dan sumur IgG anti E. coli. Hasil ini menandakan

bahwa antigen dan antibodi tersebut homolog.

C. Deteksi IgG anti E. coli K99 dalam mikrokapsul dengan teknik ELISA

Antigen K99 diencerkan dalam larutan buffer karbonat bikarbonat pH 9.6

sehingga konsentrasinya 5 µg/ml. Antigen kemudian dimasukkan ke dalam semua

sumuran cawan ELISA sebanyak 100 μL/ sumur (coating). Cawan ditutup dan

diinkubasi semalam pada suhu 4 ˚C. Keesokan harinya cawan ELISA dicuci

dengan PBS Tween–20 sebanyak lima kali.

Sebagai larutan blocking digunakan PBS Skim 5%. Larutan tersebut

kemudian dimasukkan ke dalam semua sumuran cawan ELISA sebanyak 100 μL/

sumur (blocking). Cawan diinkubasi selama satu jam pada suhu 37 ˚C, dan

selanjutnya dicuci kembali lima kali dengan PBS Tween–20.

6

Sampel yang akan diuji kemudian dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran

cawan ELISA sesuai dengan pola yang telah ditentukan. Setiap sumuran cawan

berisi sebanyak 100 μL sampel. Cawan ELISA kemudian diinkubasi kembali

pada suhu 37 ˚C selama 1 jam lalu dilakukan pencucian seperti prosedur di atas.

Sebanyak 100 μL konjugat anti-bovine IgG peroxidase yang diencerkan

1:10000 dimasukkan ke dalam setiap sumur lalu diinkubasi pada suhu 37 ˚C

selama satu jam. Cawan ELISA dicuci kembali lima kali dengan PBS Tween–20

dan sebanyak 100 μL substrat TMB dimasukkan ke dalam setiap sumur. Cawan

ELISA kemudian diinkubasi pada suhu 37 ˚C selama 15 menit sampai ada

perubahan warna. Hasil reaksi diukur dengan alat pembaca ELISA pada panjang

gelombang 655 nm. Hasil pengujian dianggap positif bila absorbansinya lebih

besar sama dengan nilai rataan absorbansi IgG kontrol negatif ditambah standart

deviasinya.

Analisis Data

Data yang diperoleh pada penelitian ini diolah dengan Microsoft excel 2007

dan dianalisis secara deskriptif.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini menggunakan sampel pelet dan supernatan IgG anti E. coli

hasil purifikasi. Purifikasi dilakukan untuk mendapatkan IgG anti E. coli murni

dari kolostrum. Pelet dan supernatan IgG anti E. coli dimasukkan ke dalam

mikrokapsul dengan lama penyalutan 30 dan 60 menit. Pengujian stabilitas IgG

anti E. coli dalam mikrokapsul dilakukan dengan dua metode yaitu AGPT dan

ELISA.

Pengukuran Konsentrasi IgG Total dalam Mikrokapsul dengan ELISA

Metode ELISA yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan IgG anti E.

coli K99 dalam mikrokapsul dan IgG non-enkapsulasi yaitu metode ELISA tidak

langsung. Hasil dari uji ini diekspresikan dalam nilai absorbansi. Semakin tinggi

nilai absorbansi maka semakin tinggi konsentrasi antibodinya. Nilai absorbansi ini

menunjukkan konsentrasi antibodi yang dideteksi. Hasil ELISA tidak langsung

dari sampel IgG anti E. coli pada pH 8, 4, dan 9 dari mikrokapsul dengan waktu

penyalutan 30 dan 60 menit ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi

lebih pekat. Semakin pekat warna yang terbentuk, maka nilai absorbansinya

semakin besar (Gambar 5). Banyaknya substrat yang terurai oleh enzim dalam

larutan akan mempengaruhi kekuatan warna yang terbentuk. Kekuatan warna

mununjukkan jumlah ikatan antigen-antibodi primer (Indardi 2005).

7

Gambar 3 Hasil Uji ELISA

Hasil perhitungan kensentrasi IgG kontrol (standar IgG) pada Tabel 1

dengan menggunakan persamaan regresi linear (y=a+bx) diperoleh persamaan

regresi liner y= 0.06+1.05x. Berdasarkan persamaan yang telah diperoleh maka

dapat diketahui nilai konsentrasi IgG total pada masing-masing sampel (Tabel 2).

Tabe l Rataan absorbasi standar dan persamaan regresi linear

Sampel uji

Kontrol

Rataan absorbansi

(y)

X

PBS* 0.095 0

1 1.071 0.5

2 1.268 1

3 1.486 2

4 1.163 4

5 1.565 8

Persamaan regresi linear → y = a+bx

y = 0.06 + 1.05x

Keterangan :* Phosphate buffer saline (sebagai kontrol negatif)

y = nilai absorbansi standar

x = konsentrasi standar IgG

a = 0.06

b = 1.05

Tabel 2 Rata–rata konsentrasi IgG total (μg/ 100 μl) dalam mikrokapsul

Sampel Konsentrasi IgG total

IgG anti E. coli penyalutan 30 menit pH 8 0.971 ± 0.062






IgG anti E. coli non enkapsulasi pH 7 1.027 ± 0.000



8

Berdasarkan hasil rata-rata konsentrasi IgG total pada Tabel 1 menunjukkan

bahwa teknik mikroenkapsulasi dapat mempertahankan kandungan IgG-nya. Hal

ini tampak pada besarnya konsentrasi antara IgG yang disalut maupun yang tidak

disalut. Konsentrasi IgG total sampel IgG anti E. coli pada pH 4 dari mikrokapsul

dengan waktu penyalutan 30 dan 60 menit lebih tinggi dibandingkan dengan

konsentrasi IgG total pada pH 8 dan pH 9. Konsentrasi IgG total pada pH 4 yang

tidak disalut mengalami penurunan sehingga konsentrasinya lebih rendah

dibandingkan dengan IgG yang tidak mengalami perubahan pH asam (IgG

normal).

Suartini et al. (2007) menyatakan bahwa IgG lebih tahan terhadap pengaruh

pH dibandingkan dengan IgY. Stabilitas IgG pada pH rendah (2–3) lebih tinggi

dibandingkan IgY (Shimizu et al. 1993). Berbanding terbalik dengan IgG, IgY

akan lebih cepat rusak pada pH asam dibandingkan dengan pH basa, hal ini

berkaitan dengan struktur protein IgY yang lebih sensitif terhadap pH asam

dibandingkan pH basa ( Shimizu et al. 1992).

Deteksi IgG anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul dengan Teknik AGPT

Agar gel presipitation test (AGPT) dilakukan untuk mengetahui keberadaan

antibodi spesifik (IgG anti E. coli) dalam mikrokapsul dengan waktu penyalutan

30 dan 60 menit terhadap antigen E. coli K99. Sampel yang diujikan baik kontrol

maupun perlakuan menunjukan hasil negatif pada uji AGPT. Hasil AGPT

ditunjukkan pada Gambar 3 dan 4.

Gambar 1 Hasil AGPT kontrol Keterangan: Ag= Antigen E. coli K99; 1, 2= supernatan IgG anti E. coli non

enkapsulasi; 3, 4= Pelet IgG anti E. coli non enkapsulasi; 5= Supernatan

IgG kontrol; 6= Pelet IgG kontrol.

Gambar 2 Hasil AGPT perlakuan Keterangan:

9

(A). Ag= Antigen Escherichia coli K99; 1, 2= supernatan IgG anti E. coli

penyalutan 30 menit; 3, 4= Mikrokapsul berisi pelet IgG anti E. coli

penyalutan 30 menit; 6, 7= Mikrokapsul blanko.

(B). Ag= Antigen; 1,2= Mikrokapsul berisi supernatan IgG anti E. coli penyalutan

60 menit; 3,4= Mikrokapsul berisi pelet IgG anti E. coli penyalutan 60 menit;

6,7= Mikrokapsul blanko.

Reaksi negatif dari uji AGPT menunjukkan bahwa antibodi terhadap E. coli

K99 tidak terdeteksi dalam mikrokapsul. Reaksi negatif ini ditandai dengan tidak

terbentuknya garis presipitasi di antara sumur antigen dan sumur antibodi. Hal ini

disebabkan karena kurangnya konsentrasi IgG anti E. coli yang diperoleh dari

hasil pelarutan mikrokapsul sehingga proporsi antara antigen dan IgG spesifik

(IgG anti E. coli) tidak mencapai proporsi yang optimal. Pembentukan garis

presipitasi terjadi apabila konsentrasi antigen dan antibodi seimbang (Kresno

1996). Menurut Tizard (1996), pada uji AGPT apabila konsentrasi antibodi lebih

sedikit dibandingkan dengan antigen, maka akan terbentuk kompleks antigen-

antibodi yang berukuran kecil sehingga larut dan tidak akan terbentuk garis

presipitasi.

Deteksi IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul dengan Teknik ELISA

Nilai cut off merupakan batas nilai positif dan negatif adanya antibodi anti E.

coli K99 dalam sampel. Nilai cut off diperoleh dari rata-rata absorbansi sampel

IgG kontrol non enkapsulasi pH 7 (1.097) ditambahkan dengan standar deviasinya

(0.55). Berdasarkan nilai absorbansi IgG kontrol non enkapsulasi, sampel IgG anti

E. coli dikatakan bernilai positif jika nilai absorbansi lebih besar atau sama

dengan nilai cut off (≥ 1.647) dan bernilai negatif jika nilai absorbansi kurang dari

atau sama dengan nilai cut off (≤ 1.647).

Nilai absorbansi yang menggambarkan pengaruh pH terhadap keberadaan

IgG anti E. coli K99 pada IgG anti E. coli dalam mikrokapsul dengan waktu

penyalutan 30 dan 60 menit serta IgG anti E. coli non enkapsulasi disajikan pada

Tabel 3. Hasil pengujian memperlihatkan rataan nilai absorbansi dan interpretasi

berdasarkan nilai cut off. Absorbansi bernilai positif tampak pada IgG anti E. coli

non-enkapsulasi pH 7, sedangkan absorbansi IgG anti E. coli pH 8, 4 dan 9 dari

mikrokapsul dengan waktu penyalutan 30 dan 60 menit bernilai negatif. Hasil ini

menunjukkan bahwa IgG anti E. coli K99 yang disalut dan dilarutkan pada buffer

0.2 M NaHCO3 dan 0.06 M Na3C6H5O7.2H2O dengan pH 8, serta perlakuan asam

dan basa pada pH 4 dan 9 tidak dapat terdeteksi.

Tabel 3 Nilai absorbansi IgG anti E.coli

Sampel uji ke- Rataan absorbasi Interpretasi

PBS 0.357 -

IgG anti E. coli penyalutan 30 menit pH 8 0.012 -


IgG anti E. coli penyalutan 30 menit pH 9 -0.041 -




IgG non-enkapsulasi pH 4 -0.077 -

10

IgG non-enkapsulasi pH 9 1.527 -

IgG anti E. coli non enkapsulasi pH 7 1.887 +

IgG anti E. coli non enkapsulasi pH 4 0.037 -

IgG anti E. coli non enkapsulasi pH 9 1.178 -

Interpretasi : (+) jika rata-rata nilai absorbansi ≥ 1.647

(-) jika rata-rata nilai absorbansi ≤ 1.647

Tidak terdeteksinya IgG anti E. coli K99 dari mikrokapsul dengan waktu

penyalutan 30 dan 60 menit diduga disebabkan karena rusaknya IgG anti E. coli

pada saat pelarutan oleh larutan campuran natrium karbonat dan trisodium sitrat

pada pH 8. Larutan campuran pH 8 ini akan mengganggu membran interphasic

dan melarutkan semua fragmen dari mikrokapsul dalam waktu singkat (Xue et al.

2004) sehingga IgG anti E. coli dapat dikeluarkan. Menurut Davalos et al. (2000)

stabilitas dan densitas permukaan IgG pada pH 8 lebih rendah dibandingkan

dengan IgY. Stabilitas IgY yang lebih tinggi pada pH 8 akan menyebabkan

densitas permukaan pada molekul antibodi IgY juga lebih tinggi, sehingga

imunoreaktifitasnya kemungkinan lebih baik dibandingkan dengan IgG. Selain itu,

IgY juga merupakan molekul yang lebih hidrofobik dibandingkan dengan IgG.

KESIMPULAN

Teknik mikroenkapsulasi IgG anti E. coli berhasil menyalut IgG dengan

konsentrasi berkisar antara 0.971–1.012 μg/ 100 μl. Namun demikian keberadaan

antibodi spesifik (IgG anti E. coli) dalam mikrokapsul tidak dapat terdeteksi

(negatif) berdasarkan uji stabilitas IgG anti E. coli dari mikrokapsul yang terlarut

menggunakan teknik ELISA dan AGPT. Hal ini diduga akibat dari kerusakan

struktur IgG anti E. coli pada proses pelarutan mikrokapsul.

SARAN

Kajian lebih lanjut mengenai teknik pelarutan mikrokapsul yang

mengandung IgG dan diperlukan teknik penyalutan mikrokapsul dengan variasi

waktu yang berbeda-beda untuk melihat keberhasilan penyalutan mikrokapsul.

DAFTAR PUSTAKA

Areekul W, Kruenate J, Prahsarn C. 2006. Preparation and in vitro of

mucoadhesive properties of alginate/ chitosan microparticles containing

prednisolone. Int J Pharm. 312 (1–2): 113–118.

Carter GR, John RC Jr. 1990. Diagnostic Procedurs in Veterinary Bacteriology

and Mycology. 5th

Ed. San Diego (USA): Academic Pr.

11

Davalos-Pantoja L, Ortega-Vinuesa JL, Bastos-Gonzalez D, Hidalgo-Alvarez R.

2000. A comparative study beetwen the adsorption of IgY and IgG on latex

particles. J Biomater Sci Polym Ed. 11: 657–673.

Esfandiari A, Wibawan IWT, Murtini S, Widhyari SD, Febram B. 2008. Produksi

kolostrum antivirus avian influenza dalam rangka pengendalian infeksi virus

flu burung. JIPI. 13(2): 69–79.

Esfandiari A, Wibawan IWT, Wulansari R, Murtini S. 2009. Produksi kolostrum

anti enteropatogen spesifik dalam rangka imunoterapi pasif guna mencegah

Kematian Neonatal Akibat Diare. Laporan Penelitian Hibah Bersaing XIV/

2. Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat, Institut Pertanian

Bogor.

Esfandiari A, Whidhyari SD, Hujarat A. 2011. Diare pada sapi neonatus yang

ditantang Escherichia coli K-99. JIPI. 16(3): 191–197.

Ganong WF. 2002. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Ed ke-20. Widjajakusumah

D, editor. Jakarta (ID): EGC. Terjemahan dari: Review of Medical

Physiology.

Indardi. 2005. Efek sistemik pemberian imunoglobulin y (IgY) anti

enteripathogenic Escherichia coli (EPEC) peroral pada mencit. [skripsi].

Bogor (ID): Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.

Krasaekoopt W, Bhandari B, Deeth H. 2003. Evaluation of encapsulation

techniques of probiotics for yoghurt. Int Dairy J. 13(1): 3–13.

Kresno SB. 1996. Imunologi: Diagnosa dan Prosedur Laboratorium. Edisi

Keempat. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta (ID): Balai

penerbit FKUI.

Li XY, Jin LJ, Mcallister, Stanford K, Xu JY, Lu YN, Zhen YH, Sun YX, Xu YP.

2007. Chitosan-alginate microcapsules for oral delivery of Yolk

Immunoglobulun (IgY). J Agric food Chem. 55: 2911–2917.

Selk G. 2006. Passive Immunity in The Newborn Calf Affects Lifetime

Performance. Cow/Calf Corner Oklahoma Cooperative Extension Service.

Shimizu M, Nagashima H, Sano K, Hashimoto K, Ozeki M, Tsuda K, Hatta H.

1992. Molecular stability of chichken and rabbit immunoglobulin G. Biosci

Biotech Biochem. 56(2): 270–274.

Shimizu M, Nagashima H, Hashimoto K. 1993. Comparative studies in molecular

stability of immunology G from different spesies. Comp Biochem Physiol B.

106(2): 255–261.

Suartini IGT, Wibawan IWT, Suhartono MT, Supar, Suarta IN. 2007. Aktivitas

IgY dab IgG antitetanus setelah perlakuan pada berbagai pH, suhu, dan

enzim proteolitik. J Vet. 8(4): 160–166. Supar. 1996. Kolibasilosis pada anak sapi perah di Indonesia. Wartazoa. 5(1): 26–

32.

Supar, Kusmiyati, Poerwadikarta MB. 1998. Aplikasi toksin enterotoksigenik

escherichia coli (etec) k99, f41 polivalen pada induk sapi perah bunting

dalam upaya pengendalian kolibasilosis dan kematian pedet neonatal. JITV

3(1): 27–33.

Supar. 2001. Pemberdayaan plasma nutfah mikroba veteriner dalam

pengembangan peternakan: harapan vaksin escherichia coli

enterotoksigenik, enteropatogenik dan verotoksigenik isolat lokal untuk

12

pengendalian kolibasilosis neonatal pada anak babi dan sapi. Wartazoa.

11(1): 36–43.

Suwarno. 2003. Prinsip Dasar, Optimalisasi dan Interpreasi Hasil Uji ELISA.

Surabaya (ID): Lab Virologi dan Immunologi FKH Unair.

Thapa BR. 2005. Therapeutic potentials of bovine colostrums. Ind J Pediatr.

72(10): 849–852.

Tizard. 1996. Veterinary Immunology An introduction. Edisi ke-5. Texas (USA):

WB Saunders Company.

Tizard IR. 2000. Veteriner Immunology an Introduction. Canada (CA): WB

Saunders.

Tizard IR. 2004. Veterinary Immunology an Introduction. Ed ke-7. USA (USA):

Saunders.

Xue WM, Yu WT, Liu XD, He X, Wang W, Ma XJ. 2004. Chemical method of

breaking the cell-loaded sodium alginate/chitosan microcapsules. Chem J

Chin Univ. 25: 1342–1346.

13

RIWAYAT HIDUP

Penulis lahir di Tasikmalaya pada tanggal 9 Juli 1991 dari Ayah yang

bernama Wahyudin dan Ibu bernama Tini Maryani. Penulis merupakan putri

pertama dari tiga bersaudara. Penulis pernah bersekolah di SDN 1 Cikatomas,

SMPN 1 Cikatomas, lulus dari SMAN 1 Cikatomas tahun 2010 dan pada tahun

yang sama lulus seleksi masuk IPB jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) di

Institut Pertanian Bogor.

Selama mengikuti perkuliahan penulis bergabung dalam beberapa

organisasi. Adapun organisasi yang diikuti yaitu Badan Eksekutif Mahasiswa

Fakultas Kedokteran Hewan (BEM FKH) Kabinet Veternity sebagai anggota

Divisi Sosial dan Lingkungan (2011–2012), Himpunan Minat Profesi Satwa Liar

sebagai anggota divisi internal (2012–2013) dan mengikuti magang profesi serta

beberapa kepanitiaan kegiatan kampus FKH IPB.

uji stabilitas igg anti escherichia coli k99 asal ... · work effectively. the objective of this...

Documents