LAPORAN PRAKTIKUM PENYAKIT INFEKSIUS

IDENTIFIKASI DAN ISOLASI BAKTERI Escherichia coli

TRINI PURNAMASARI S.O111 12 255

KELOMPOK 5

Nama Asisten : Meyby Eka Putri

Rozana Pratiwi

PROGAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2014

1

DAFTAR ISI

Halaman Judul 1

Daftar Isi 2

BAB I Pendahuluan

1.1 Latar Belakang 3

1.2 Tujuan Praktikum 3

BABII Tinjauan Pustaka

2.1 Penyakit infeksius pada hewan yang disebabkan Escherichia coli 4

2.2 Teknik isolasi bakteri E. coli: media (Broth, SMAC, EMBA)yang digunakan 4

2.3 Pewarnaan gram pada bakteri 5

2.4 Uji Biokimia untuk identifikasi E. coli: TSIA, SIM, MRVP, Citratdan Urea 5

BAB III Materi dan Metode

3.1 Alat Dan Bahan 8

3.2 Prosedur Kerja 8

BAB IV Hasil dan Pembahasan

4.1 Hasil 10

4.2 Pembahasan 10BAB V Penutup

5.1 Kesimpulan 13

5.2 Saran untuk praktikum selanjutnya 13Lampiran Foto. 14

Daftar Pustaka 15

2

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang

terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu

medium buatan. Proses pemisahan atau pemurnian dari

mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan

mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi

mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya

terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Prinsip dari

isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba

dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran

bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan

menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan

membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya

(Sutedjo, 1996).

E. coli adalah bakteri yang berbentuk batang, gram negatif merupakan

penghuni normal dalam saluran pencernaan manusia dan hewan, namun

demikian serotipe tertentu dapat menyebabkan sakit pada manusia. Salah satu

serotype itu adalah O157, : H7 yang dapat menginduksi sekresi cairan tubuh

secara berlebihan dan terus menerus sehingga terjadi diare dan dapat

menyebabkan meningitis, penularan dan penyebaran agen penyakit ini dapat

melalui tinja dari lingkungan yang tercemar. E. coli juga pernah ditemukan

pada bahan makanan asal hewan seperti daging sapi dan daging ayam segar

(Ewings, 1986).

1.2 Tujuan Praktikum

Mengetahui cara isolasi dan identifikasi bakteri Escherichia coli

sebagai penyebab penyakit infeksius .

3

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Penyakit infeksius pada hewan yang disebabkan Escherichia coli

Strain pathogen E.coli dihubungkan dengan penyakit pada intestinum

dan dengan septikemia pada hewan muda atau hewan yang baru lahir dan

dengan penyakit respirasi pada unggas. Strain non patogen juga dapat

menyebabkan infeksi tertentu pada ambing, uterus dan bagian tubuh lain.

Ada 3 manifestasi enterik kolibasilosis pada babi yaitu: enteritis E.coli

neonatal yaitu enteritis yang terjadi pada anak babi umur 1- 4 hari, babi

terlihat normal selama 12 jam pertama kehidupan dan kemudian mengalami

dehidrasi selama 18 jam. Enteritis pada babi lepas sapih yaitu yang terjadi

setelah penyapihan. Babi yang terinfeksi mengalami diare, depresi, anoreksia

dan demam yang mungkin terjadi selama 2-3 hari. Meskipun seringkali

terjadi kolaps dan kematian setelah periode singkat dari diare, mortalitas pada

hewan lepas sapih lebih rendah daripada hewan neonatal. penyakit edema

yaitu edema pada berbagai jaringan tubuh babi segera setelah disapih.

2.2 Teknik isolasi bakteri E. coli: media (NB, SMAC, EMBA) yang

digunakan

Nutrien Broth

Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang

berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Sampel feses yang telah

diencerkan terlebih dahulu dengan buffered peptone water (BPW) 0,1%,

sebelum ditumbuhkan pada medium agar atau cair (nutrient broth)

sehingga setelah inkubasi akan diperoleh jumlah bakteri yang dapat

dihitung (Suardana, dkk. 2014).

SMAC

Koloni positif E. coli dari media EMBA yang ditanam pada media

nutrien agar miring, selanjutnya diinokulasikan pada media selektif

sorbitol MacConkey agar (SMAC). Setelah diinkubasikan pada suhu 37

C selama 20-24 jam, serotipe E. coli O157 dideteksi dari terlihatnya koloni

5

jernih atau tidak berwarna dan dianggap bersifat sorbitol negative

(Suardana, dkk. 2014).

EMBA

Sebanyak 15 ml media eosin methylene blue agar (EMBA)

dimasukkan ke dalam setiap cawan petri untuk disterilisasi dengan

autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit. Setelah sterilisasi media

diambil dari strerilisator untuk selanjutnya didiamkan pada suhu kamar

agar media menjadi padat. Dari pengenceran sampel yang dikehendaki,

sebanyak 0,1 ml larutan tersebut dimasukkan ke dalam cawan petri dengan

metode sebar menggunakan gelas bengkok. Inkubasi dilakukan pada suhu

37o C selama 18-24 jam. Setelah akhir inkubasi, koloni yang tumbuh dan

berwarna hijau metalik dengan titik hitam pada bagian tengahnya dihitung

sebagai koloni E. coli. Koloni yang tumbuh dikoleksi dengan cara

diinokulasikan pada media nutrien agar miring untuk pemeriksaan

selanjutnya (Suardana, dkk. 2014).

2.3 Pewarnaan gram pada bakteri

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat

warna metil ungu atau kristal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri

gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan

alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. Pada uji pewarnaan gram,

suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metal ungu atau

crystal violet, yang membuat semua bakteri gram negative menjadi berwarna

merah atau merah muda. Pengujian tersebut berguna untuk

mengklasifikasikan  kedua tipe bakteri tersebut berdasarkan perbedaan

struktur dinding sel mereka (Karmana, 2008).

2.4 Uji Biokimia untuk identifikasi E. coli: TSIA, SIM, MRVP, Citrat dan

Urea

TSIA (Three Sugar Iron Agar)

Dengan menggunakan ose steril diambil biakan dari EMBA, lalu

ditaman pada media TSIA dengan cara ditusukkan sampai ke dasar

tabung, kemudian digores secara zig-zag pada permukaannya.

6

Diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Diamati perubahan pada

media. Prinsip TSIA, bakteri yang tergolong Enterobacteriaceae dapat

memfermentasi karbohidrat (Glukosa, Laktosa, Sukrosa). Hasil : Berwarna

kuning (bersifat asam ) pada bagian tegak dan miring sehingga bakteri

dapat memfermentasi karbohidrat, berwarna hitam dapat memproduksi

H2S (+), dan terbentuk gas didasar tabung (Murni. 2014).

SIM (Sulfide Indol Motility)

Inokulasikan 1 ose dari Plate Count Agar (PCA) miring ke dalam

tryptone Broth inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35oC +1oC.

Uji Indoldilakukan dengan menambahkan 0,2 ml – 0,3 ml

pereaksi Kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan

bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning. Prinsip

SIM adalah mengetahui motilitas organisme, adanya pembebasan H2S

(sulfide) dan mengetahui adanya pembentukan indol. Hasil : Adanya H3S

ditunjukkan dengan perubahan warna menjadi hitam pada bagian dasar.

Motilitas diketahui dari keruhnya media dan adanya penyebaran ke atas

( mirip pohon cemara terbalik ). Adanya indol terlihat berupa cincin merah

beberapa detik sampai 5 menit setelah penambahan 1 ml chloroform dan

beberapa tetes reagen Kovac (Murni, 2014).

MRVP (Metyl Red Voges Proskauer)

Inokulasikan bakteri ujipada media MRVP dan inkubasikan pada pada

suhu 37°C selama 24 jam. Setelah inkubasi media menjadi keruh lalu di

tambahkan peubah atau reagen dengan urutan sebagai berikut : Uji MR

dengan cara menambahkan 2 tetes reagen methyl red lalu kocok beberapa

kali. Reaksi positif di tandai perubahan warna menjadi merah.  Uji VP

dengan media yang sama setelah uji MR di lanjutkan dengan uji VP

dengan menambahkan 0,6 ml alpha naphtol soln dan 0,2 ml KOH 40% aq

soln, kemudian kocok sedikit reaksi di tunggu mulai 20 sampai 30 menit,

lihat perubahan warna, reaksi positif di tandai perubahan warna menjadi

merah. Prinsip MR adalah mengetahui terbentuknya asam kuat. Hasil :

Terbentuknya asam ditunjukkan dengan terjadi perubahan warna dari

orange menjadi merah setelah ditetesi ragen MR. Prinsip VP  adalah

7

mengetahui terbentuknya asetil methil karbinol. Hasil : Terbentuknya

asetil methil karbinol terlihat dengan adanya perubahan dari orange

menjadi merah setelah ditetesi  KOH dan α-naftol (Murni, 2014).

Citrat

Goreskan 1 ose dari PCA miring ke permukaan Simmon Citrat Agar.

Inkubasi selama 96 jam + 2 jam pada suhu 35oC +1oC. Reaksi positif jika

terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif

jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau. Prinsip : Mengetahui

kemampuan organisme untuk menggunakan sitrat sebagai sumber karbon

utama. Hasil : pertumbuhan bakteri dapat terlihat dengan adanya

perubahan warna dari hijau menjadi biru (Murni. 2014).

Urea

Prinsip : Sebagian bakteri menghasilkan enzim urease yang dapat

menguraikan urea sehingga bersifat alkalis atau basa (berwarna

merah). Hasil : Terjadi perubahan warna dari merah mudah ke merah

keunguan (Murni. 2014).

8

BAB III

MATERI DAN METODE

III.1 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini antara lain :

Ose

Bunsen

Rak tabung

Tabung

Korek gas

Object glass

Cover glass

Mikroskop

Pipet tetes

Bahan yang digunakan pada praktikum ini antara lain :

NaCl suspensi

Koloni bakteri E.coli

Crystal Violet

Lugol

Alkohol 90%

Safranin

Minyak emersi

III. 2 Prosedur Kerja

o Isolasi Staphylococcus

1. Isolat bakteri diinokulasikan pada media SMAC secara streak.

2. Media yang berisi isolat bakteri diinkubasi selama 20 - 24 jam pada suhu

370 celcius.

9

o Media Uji Biokimia

a. Media Triple Sugar Iron (TSI) Agar

65 g serbuk media Triple Sugar Iron Agar dilarutkan dengan 1 liter

air suling, lalu dipanaskan hingga mendidih, setelah itu dimasukkan ke

dalam tabung reaksi sebanyak 10 mL, kemudian disterilkan selama 15

menit pada 121 C tekanan 15 lbs, dibiarkan membeku pada posisi miring.⁰

b. Medium Sulfit Indol Motility (SIM) 30 g serbuk media SIM dilarutkan dengan 1 liter air suling,

dipanaskan hingga melarut, setelah itu dimasukkan ke tabung reaksi

sebanyak 10 mL, disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu

121 C tekanan 15 lbs.⁰

c. Media Metil Red-Voges Proskauer (MR-VP)

17 g serbuk media MR-VP dilarutkan dalam 1 liter air suling, lalu

dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 10 mL, kemudian

disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 C tekanan 15⁰

lbs.

o Pewarnaan Gram

1. Fikasi ose dan objek glass dengan menggunakan bunsen

2. Homogenkan satu ose biak bakteri dengan NaCl fisiologis yang telah di

teteskan pada gelas objek. Buat Apus setipis mungkin.

3. Keringkan dan fiksasi diatas bunsen

4. Preparat apus diteteskan pewarna : (a) Crystal violet selama kurang lebih 2

menit kemudian dibilas dengan menggunakan air mengalir. (b) Teteskan

lugol selama kurang lebih 20-30 detik kemudian dilunturkan dengan

menggunakan alkohol 90% selama 1 menit. (c) Setelah itu alkohol dibuang

dan dicuci dengan air mengalir. (d) Teteskan safranin kurang lebih 2 menit

kemudian dibersihkan dengan air mengalir dan dikeringkan. Lihat dibawah

mikroskop

10

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil

o Isolasi Escherichia coli

Pertumbuhan pada media SMAC diamati. Koloni bakteri Escherichia coli

O157 menunjukan tidak adanya perubahan warna pada media.

o Uji Biokimia

TSIA (Triple Sugar Iron Agar) MR-VP (methyl red-voges

proskauer)

- Glukosa : kuning (+) - MR : merah (+)

- Laktosa : kuning (+) - VP : negatif (-)

- Sukrosa : kuning (+)

SIM (Sulfide Indol Motility)

- H2S : negatif (-)

- Indol : positif (+)

- Motil : positif (+)

o Pewarnaan Gram

Pada uji pewarnaan gram yang terlihat dibawah mikroskop yaitu bakteri

Escherichia coli berwarna merah.

IV.2 Pembahasan

o Isolasi Escherichia coli

Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di

alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan.

Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis

11

mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran

bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan

menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan

membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya

(Sutedjo, 1996). SMAC merupakan media selektif untuk

mengetehui apakah Escherichia coli yang di kultur itu pathogen atau tidah.

Pertumbuhan Escherichia coli pada media SMAC yang patpgen akana memiliki

koloni bakteri Escherichia coli O157 menunjukan tidak adanya perubahan warna

pada media, karena Escherichia coli O157 tidak memfermantasikan sorbitol

sehingga tidak mengubah warna media.

o Uji Biokimia

- Triple Sugar iron Agar (TSIA)

Media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) merupakan salah satu metode yang

digunakan untuk melihat kemampuan bakteri dalam memfermentasikan gula-

gula,selain itu melihat pula kemampuan bakteri dalam menghasilkan gas dan H2S

dari proses fermentasi tersebut. Pada prinsipnya bakteri yang

tergolong Enterobacteriaceae dapat memfermentasi karbohidrat (Glukosa,

Laktosa, Sukrosa).

Pada uji fermantasi gula-gula kali ini dengan menggunakan media TSIA,

E coli memberikan hasil positif asam pada bagian lereng dan dasar (media

berwarna kuning) pada bagian tegak dan miring sehingga bakteri dapat

memfermentasi karbohidrat,. Hal tersebut bisa terjadi karena bakteri E. coli

memiliki enzim betagalaktosidase dan sukrase yang dapat memecah laktosa

menjadi glukosa dan galaktosa serta memecah sukrosa menjadi glukosa dan

fruktosa. Selain itu juga terbentuk gas namun negative H2S karena tidak mampu

mendesulfurasi asam amino dan methion yang akan menghasilkan H2S.

- Sulfide, Indol, Motility (SIM)

Pada uji SIM, terlihat bahwa bakteri E. coli H3S karena tidak adanya

perubahan warna menjadi hitam pada bagian dasar Pada uji indol memberikan

hasil positif dimana terlihat berupa cincin merah, bakteri E.coli menghasilkan

enzim triptopanase sehingga mampu mengubah asam amino triptopan menjadi

senyawa indol. Pada uji motility, bakteri E. coli menghasilkan motilitas yang

12

positif, motilitas diketahui dari keruhnya media adanya penyebaran ke atas

( mirip pohon cemara terbalik ).

- Methyl red- voges proskauer ( MR-VP)

a.       Uji MR

Hasilnya positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah

ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran

(metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung  dalam medium

MR-VP. Terbentuknya asam campuran pada media akan menurunkan pH sampai

5,0 atau kurang, oleh karena itu bila indikator metil ditambahkan pada biakan

tersebut dengan pH seredndah itu maka indikator tersebut menjkadi merah. Hal ini

menandakan bahwa bakteri ini peragi asam campuran.

b.      Uji VP

Hasilnya negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium

setelah ditambahkan α-napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini

bukan asetil metil karbinol (asetolin)

o Pewarnaan Gram

Pada pengecatan ini digunakan bakteri Escerhia coli, pengecatan ini juga

menggunakan 4 (empat) jenis larutan yaitu Kristal violet, sebagai cat utama,

larutan iodium sebagai pengintensifan, alcohol asam untuk pencucian dan safranin

sebagai cat penutup. Berdasarkan percobaan diperoleh Escerchia coli bersifat

gram negatif karena tidak dapat mengikat kuat cat utama dan dapat diwarnai oleh

cat lawan yakni merah dari pewarna safranin. Hal ini sesuai dengan pendapat

Pelczar (2006) menyatakan bahwa bakteri gram negatif akan kehilangan zat

pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat

pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan

tampak berwarna merah. Dengan demikian hasil pengamatan dengan literatur

sama hasil warnanya yaitu berwarna merah. Escherichia coli termasuk dalam

13

famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang

fermentatif.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Escherichia coli dapat diisolasi dan diidentifikasi dengan berbagai

metode seperti pengisolasian Escherichia coli pada media-media seperti

Nutrien Broth, SMAC, EMBA, pewarnaan gram, serta uji TSIA, SIM,

MRVP, citrat dan urea untuk dapat meningkatkan presentasi penemuaan

Escherichia coli, bukan bakteri jenis lainnya.

5.2 Saran Untuk Praktikum Selanjutnya

Pengadaan penuntun praktikum untuk praktikum selanjutnya baik

berupa hardcopy maupun softcopy untuk memudahkan praktikan dalam

menjalankan praktikum.

14

LAMPIRAN FOTO

Media Isolasi

Uji Biokimia Pewarnaan Gram

15

DAFTAR PUSTAKA

Ewings, W.H, 1986 . Edward and Ewing . Identification of enterobacteriacea 4' h

Ed.Elsevier, New York

Karmana, O, 2008. Biologi. Grafindo Media Pratama : Bandung

Murni, D. 2014. Isolasi dan Identifikasi Escherichia Coli pada Hewan Coba.

Pelczar, M. J. And E. C. S. Chan. 1986. Elements of Mycrobiology.

New York : Mc grow-Hill Book Company.

Suardana. IW., dkk. 2014. Identifikasi Escherichia coli O157:H7 dari Feses

Ayam dan Uji Profil Hemolisisnya pada Media Agar Darah. Jurnal

Keokteran Hewan. UGM

Sutedjo, M. 1996. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta, Jakarta.

http://elisa.ugm.ac.id/user/archive/download/

37952/555eb1eb6dcac9eeb0e9f71553107a33. Diakses pada tanggal 11

November 2014, pukul 20:30 WITA.

16

17