UJI STABILITAS IgG ANTI Escherichia coli K99 ASAL
KOLOSTRUM SAPI DALAM KEMASAN
MIKROKAPSUL
DINI NURWAHYUNI
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Uji Stabilitas IgG Anti
Escherichia coli K99 Asal Kolostrum Sapi dalam Kemasan Mikrokapsul adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2015
Dini Nurwahyuni
NIM B04100047
ABSTRAK
DINI NURWAHYUNI. Uji Stabilitas IgG Anti Escherichia coli K99 Asal
Kolostrum Sapi dalam Kemasan Mikrokapsul. Dibimbing oleh SRI MURTINI
dan ANITA ESFANDIARI.
Teknik mikroenkapsulasi berfungsi untuk melindungi IgG anti Escherichia
coli (E. coli) K99 asal kolostrum sapi terhadap pengaruh pH di saluran pencernaan
sehingga IgG anti E. coli dapat bekerja secara efektif. Tujuan penelitian ini adalah
untuk mengevaluasi stabilitas IgG anti E. coli K99 asal kolostrum sapi dalam
mikrokapsul menggunakan teknik agar gel presipitation test (AGPT) dan enzyme
linked immunosorbent assay (ELISA). Imunoglobulin G (IgG) murni asal
kolostrum dikemas dalam mikrokapsul dengan waktu penyalutan selama 30 dan
60 menit. Keberadaan dan spesifisitas IgG anti E. coli diamati dalam mikrokapsul
yang dilarutkan dengan larutan penyangga 0.2 M NaHCO3 dan 0.06 M
Na3C6H5O7.2H2O pH 8. Pelarutan kemudian diatur dalam kondisi asam dan basa
(8, 4, dan 9). Keberadaan IgG dideteksi dengan teknik ELISA tidak langsung,
sedangkan spesifisitasnya dideteksi dengan teknik AGPT dan ELISA tidak
langsung. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa konsentrasi IgG total dari
mikrokapsul dengan waktu penyalutan 30 dan 60 menit berkisar antara 0.971–
1.012 μg/ 100 μl. Hasil uji ELISA dan AGPT menunjukkan reaksi negatif antara
IgG anti E . coli dari pelarutan mikrokapsul terhadap antigen E. coli K99,
sedangkan reaksi positif ditunjukkan oleh IgG anti E. coli tanpa penyalutan. Hasil
negatif diduga akibat rusaknya IgG anti E. coli selama proses pelarutan.
Kata kunci: AGPT, E. coli K99, ELISA, IgG, mikrokapsul
ABSTRACT
DINI NURWAHYUNI. Stability Test of IgG Anti Escherichia coli K99 from
Bovine Colostrum in Microcapsule. Supervised by SRI MURTINI and ANITA
ESFANDIARI.
The function of microencapsulation technique is to protect the IgG anti
Escherichia coli (E. coli) K99 from bovine colostrum towards pH effect in the
digestive tract so it can work effectively. The objective of this experiment is to
evaluate the stability of IgG anti E. coli K99 from bovine colostrum in
microcapsule using agar gel presipitation test (AGPT) and enzyme linked
immunosorbent assay (ELISA) techniques. Purified IgG from colostrum were
packaged in the form of coated-microcapsules 30 and 60 minutes. The occurrence
and spesificity of IgG anti E. coli in was observed in microcapsules diluted with
0.2 M NaHCO3 and 0.06 M Na3C6H5O7.2H2O buffer pH 8. The dilution was
subsequently subjected to acid and alkali condition (8, 4, and 9). The IgG anti E.
coli occurrence was detected with indirect ELISA technique, while it specificity
were detected by AGPT and indirect ELISA techniques. The result show that total
IgG concentration from coated microcapsules of 30 and 60 minutes were 0.971–
1.012 μg/ 100 μl. ELISA and AGPT showed negative reaction between
microcapsule diluted IgG anti E. coli againts E. coli K99 antigens, in contras with
positive reaction in IgG anti E. coli uncoated. The negative result suspected due
to the destruction of IgG anti E. coli during the dilution process.
Keywords: AGPT, E. coli K99, ELISA, IgG, microcapsule.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
UJI STABILITAS IgG ANTI Escherichia coli K99 ASAL
KOLOSTRUM SAPI DALAM KEMASAN
MIKROKAPSUL
DINI NURWAHYUNI
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberi
kekuatan dan hidayah sehingga penulis dapat menyusun skripsi ini. Tema yang
dipilih dalam penelitian adalah ”Uji Stabilitas IgG Anti Escherichia coli K99 Asal
Kolostrum Sapi dalam Kemasan Mikrokapsul”. Penyusunan skripsi ini dilakukan
sebagai salah satu syarat memeperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada
Fakultas Kedokteran Hewan.
Penulis menyampaikan terima kasih kepada Dr Drh Sri Murtini, MSi selaku
pembimbing I dan Dr Drh Anita Esfandiari, MSi selaku pembimbing II yang telah
memberikan bimbingan dan pengarahan selama penyusuna skripsi ini. Ucapan
terima kasih juga disampaikan kepada Papa (Wahyudin, MSi), Mama (Tini
Maryani), adik (Dina Nurwahyuni dan Arif Muhammad Nurdin) dan seluruh
keluarga atas doa dan kasih sayangnya. Teman-tema Acromion 47 khususnya
Shine, Shovia, Intan, Abid, Donny, Nafisatul, Riena, serta keluarga Ginastri atas
dukungan dan semangat yang tak henti-hentinya sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Penulis juga mengucapkan terima kasih
kepada teman satu tim penelitian (Amanda), serta semua pihak di Laboratorium
Reproduksi Balai Penelitian Ternak (Balitnak) Ciawi, Bogor atas bantuan dan
kerja samanya.
Semoga penulis dapat menghasilkan laporan yang bermanfaat khususnya
bagi penulis, umumnya bagi pembaca.
Bogor, Januari 2015
Dini Nurwahyuni
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ix
DAFTAR GAMBAR ix
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
METODE PENELITIAN 2
Waktu dan Tempat 2
Bahan 3
Alat 3
Metode 3
Purifikasi IgG Anti E. coli K99 3
Pembuatan Mikrokapsul 4
Pengujian Keberadaan IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul 4
Pengukuran konsentrasi IgG total dalam Mikrokapsul dengan ELISA 4
Deteksi IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul dengan Teknik AGPT 5
Deteksi IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul dengan Teknik ELISA 5
Analisis Data 6
HASIL DAN PEMBAHASAN 6
Pengukuran Konsentrasi IgG total dalam Mikrokapsul dengan ELISA 6
Deteksi IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul dengan Teknik AGPT 8
Deteksi IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul dengan Teknik ELISA 9
KESIMPULAN 10
SARAN 10
DAFTAR PUSTAKA 10
RIWAYAT HIDUP 13
DAFTAR TABEL
1 Rataan absorbansi standar dan persamaan regresi linear 7 2 Rata-rata konsentrasi IgG total (μg/ 100 μl) dalam mikrokapsul 7 3 Nilai absorbansi IgG anti E. coli K99 9
DAFTAR GAMBAR
1 Hasil uji ELISA 7 2 Hasil AGPT kontrol 8 3 Hasil AGPT perlakuan 8
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Diare merupakan gejala adanya gangguan pencernaan yang ditandai dengan
pengeluaran feses dalam jumlah dan frekuensi melebihi normal dengan
konsistensi cair. Feses dikeluarkan oleh penderita tanpa kesulitan karena terjadi
peningkatan peristaltik usus (Ganong 2002). Diare dapat disebabkan oleh
beberapa macam mikroorganisme, salah satunya Escherichia coli (E. coli).
Escherichia coli tersebar di seluruh dunia dan dapat ditularkan melalui air atau
pakan yang terkontaminasi oleh tinja. E. coli merupakan salah satu bakteri
penyebab kolibasilosis pada anak sapi, terutama pada periode neonatal. E. coli
juga merupakan suatu agen penyakit pada hewan peka yaitu hewan menyusui dan
hewan muda terutama hewan yang berumur kurang dari satu minggu (Carter dan
John 1990). Agen infeksius ini memiliki banyak serotipe dan serotipe yang
banyak terdapat di lapangan adalah E. coli enterotoxigenic (ETEC) K99, F41 atau
K99F41 (Supar 1996).
Escherichia coli K99 merupakan bakteri penting karena menyebabkan diare
yang mematikan pada anak sapi (Supar et al. 1998). Prevalensi diare pada anak
sapi perah akibat kolibasilosis berkisar antara 20–31% dengan tingkat mortalitas
65–85% (Supar 2001). Tingginya tingkat mortalitas pada anak sapi penderita
kolibasilosis sangat merugikan peternak. Kerugian yang timbul tidak hanya
berupa kematian, namun juga meningkatnya biaya pengobatan dan perawatan,
penurunan berat badan, serta terganggunya pertumbuhan.
Pengobatan diare menggunakan antibiotik dinilai ampuh untuk membunuh
bakteri. Penggunaan antibiotik secara berlebihan untuk pengobatan kolibasilosis
menyebabkan terjadinya resistensi terhadap antibiotik. Penelitian Supar (2001)
menunjukkan adanya resistensi bakteri E. coli K99 terhadap 9-15 macam
antibiotika yang sering dipakai di lapangan. Hal ini mengindikasikan bahwa
antibiotik tidak efektif untuk pengobatan dan pengendalian kolibasilosis.
Pendekatan melalui imunisasi pasif melalui pemberian kolostrum dapat dijadikan
alternatif untuk penanggulangan kasus diare akibat infeksi oleh ETEC K99
(Esfandiari et al. 2009).
Kolostrum merupakan sekresi yang dihasilkan oleh kelenjar ambing
mamalia pada tahap akhir kebuntingan sampai tiga hari setelah melahirkan
(Tizard 2004). Kolostrum mengandung dua komponen utama yaitu faktor
pertumbuhan dan faktor imunitas (Thapa 2005). Salah satu faktor imun yang
penting dalam kolostrum adalah antibodi (IgG) untuk kepentingan imunisasi pasif
dari induk kepada anaknya yang baru lahir (Selk 2006). Hal ini penting karena
anak sapi yang baru lahir tidak mendapatkan antibodi dari induk melalui plasenta
sehingga antibodi mutlak didapatkan dari kolostrum sebagai pasokan IgG (Tizard
2000).
Imunoglobulin G kolostrum menunjukan efektifitasnya melawan sejumlah
patogen saluran pencernaan, diantaranya Enterotoxigenic Escherichia coli
(ETEC) (Esfandiari et al. 2011). Stabilitas molekul IgG sangat dipengaruhi oleh
lingkungan saluran pencernaan. Aktivitas biologis dari IgG akan menurun dan
rusak oleh kondisi lingkungan saluran pencernaan, terutama rendahnya pH
2
(keasaman lambung) dan digesti enzim pepsin (Esfandiari et al. 2008). Stabilitas
IgG menjadi sangat penting apabila akan digunakan untuk terapi imunisasi pasif
yang diberikan secara oral.
Teknik mikroenkapsulasi pada penelitian ini bertujuan melindungi IgG anti
E. coli K99 asal kolostrum terhadap pengaruh pH di saluran pencernaan sehingga
IgG dapat bekerja secara efektif. Efektifitas IgG anti E. coli yang telah disalut
oleh kitosan-alginat menjadi mikrokapsul perlu diuji stabilitasnya. Uji stabilitas
dapat dilakukan dengan uji serologis seperti agar gel precipitation test (AGPT)
dan enzyme linked immunosorbant assay (ELISA). Agar gel presipitation test
merupakan salah satu teknik untuk menganalisa atau mendeteksi keberadaan
antibodi spesifik terhadap antigen tertentu pada media agar. Antigen dan antibodi
yang diuji harus mampu terlarut dalam agar, sehingga dapat berdifusi dan
membentuk garis presipitasi apabila antigen dengan antibodi tersebut homolog.
Enzyme linked immunosorbant assay merupakan salah satu uji primer untuk
mengukur interaksi antara antibodi dan antigen. Reaksi ikatan antigen dan atibodi
dideteksi dengan antibodi yang dikonjugasikan dengan enzim. Uji ini lebih
sensitif dan tidak berbahaya karena tidak menggunakan bahan radioaktif
(Suwarno 2003).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi stabilitas IgG anti Escherichia
coli K99 asal kolostrum sapi dalam kemasan mikrokapsul menggunakan teknik
agar gel presipitation test (AGPT) dan enzyme linked immunosorbant assay
(ELISA).
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang
keberadaan dan stabilitas IgG anti Escherichia coli K99 asal kolostrum sapi dalam
kemasan mikrokapsul tersalut kitosan-alginat.
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan selama sembilan bulan yang dimulai pada bulan
Maret sampai dengan November 2014. Penelitian dilakukan di Laboratorium
Reproduksi Balai Penelitian Ternak (Balitnak) Ciawi, Laboratorium Bakteriologi
Balai Besar Penelitian Veteriner (Bbalitvet) Bogor, Laboratorium Patologi Klinik
Divisi Penyakit Dalam, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi,
Laboratorium Terpadu Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat
Veteriner, dan Laboratorium Terpadu, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
3
Bahan
Bahan yang digunakan meliputi sampel kolostrum, amonium sulfat,
akuabides steril, phosphate buffer saline (PBS), larutan Brad Fort, sodium alginat,
kitosan, CaCl2, NaOH, akuades, 0.2 M NaHCO3, 0.06 M Na3C6H5O7.2H2O,
Agarose (0.9%-1%), NaCl 0.85%, antigen E. coli K99, larutan buffer karbonat
bikarbonat pH 9.6, larutan Phosphate Buffer Saline Tween-20 (PBST), larutan
PBS skim 5%, konjugat anti bovine IgG peroxidase (Cat. No. A-5295, Sigma
Chemical Co), substrat TMB.
Alat
Alat yang digunakan meliputi refrigerator, freezer, tabung mikrosentrifus,
alat sentrifus, kantong dialisis membran nitroselulosa, benang nilon, vorteks,
Encapsulator BUCHI B–390(R)
, pH meter, mikroskop cahaya, gelas obyek,
beakerglass, stirrer, magnet pengaduk, batang pengaduk kaca, gelas ukur 100 mL,
pipet ukur 10 mL, mikro pipet, timbangan, kertas perkamen, sudip, tabung
erlenmeyer, alat penyaring, alumunium foil, gelas arloji, timer, kamera, gelas
obyek, puncher, pipet pasteur, kertas saring, tabung mikro, cawan polysterene 96
sumuran (Nunc(R)
), inkubator, dan alat pembaca mikro-ELISA.
Metode
Kolostrum yang mengandung IgG anti E. coli K99 diperoleh dari induk sapi
yang divaksin dengan vaksin E. coli polivalen pada saat bunting trimester akhir.
Purifikasi IgG anti E. coli K99
Teknik purifikasi yang digunakan pada penelitian ini yaitu presipitasi garam
(presipitasi dengan 40% amonium sulfat jenuh). Kolostrum kontrol (tidak
mengandung anti E. coli) dan kolostrum yang mengandung anti E. coli masing-
masing sebanyak 300 ml dihomogenkan dengan stirrer, kemudian ditambahkan
amonium sulfat sebanyak 73 gram sedikit demi sedikit sampai mengental dan
homogen. Kolostrum yang telah ditambah amonium sulfat disentrifus dengan
kecepatan 5000 rpm pada suhu 4 ˚C selama 30 menit sampai terjadi pemisahan
antara supernatan dan pelet. Supernatan dan pelet dimasukkan ke dalam tabung
yang berbeda dan diberi label. Sebanyak 25 gram pelet dari kolostrum kontrol dan
perlakuan dilarutkan dalam 50 ml larutan PBS dan dihomogenkan menggunakan
vorteks. Setelah itu, supernatan dan pelet disimpan dalam refrigerator untuk
selanjutnya dilakukan proses dialisis.
Proses dialisis dilakukan dengan memasukkan 25 ml pelet kolostrum hasil
pengendapan amonium sulfat ke dalam kantong dialisis (berupa membran
netroselulosa). Selanjutnya kantong dialisis di masukkan dalam 1 liter PBS dan
diaduk menggunakan stirrer selama 24 jam pada suhu 40 ˚C dengan melakukan
pergantian pelarut dialisis setiap 6 jam sekali. Hasil proses dialisis ini berupa IgG
murni berasal dari kolostrum yang akan digunakan pada proses pembuatan
mikrokapsul.
.
4
Pembuatan Mikrokapsul
Mikrokapsul kolostrum yang mengandung IgG anti E. coli dibuat
berdasarkan modifikasi metode Li et al. (2007) dengan penyalut kitosan-alginat
menggunakan mesin Microencapsulator BUCHI B–390(R)
. Pembuatan
mikrokapsul dilakukan dengan metode ekstruksi yaitu mencampurkan larutan
hidrokoloid seperti alginat dengan suspensi IgG kemudian diekstruksi melalui
jarum (nozzle) dalam bentuk butiran ke dalam larutan pengeras seperti kalsium
klorida (Krasaekoopt et al. 2003). Mikrokapsul dibuat melalui beberapa tahap,
yaitu pembuatan mikrokapsul kitosan-alginat blanko dan dilanjutkan dengan
pembuatan mikrokapsul kitosan-alginat yang berisi sampel IgG murni.
Pembuatan mikrokapsul kitosan-alginat blanko dan mikrokapsul berisi IgG
anti E. coli murni dimulai dengan membuat larutan alginat 3% yang ditambahkan
akuades dengan perbandingan 1:1 (10 ml : 10 ml) kemudian dihomogenkan
menggunakan stirrer. Setelah larutan homogen, dilakukan proses pembuatan
mikrokapsul menggunakan alat Microencapsulator BUCHI B–390(R)
, dengan
ukuran nozzle 300, frekuensi 1000, elektroda 650, pressure 209–210 untuk
mikrokapsul blanko dan pressure 432 untuk mikrokapsul berisi sampel. Butiran
mikrokapsul yang dihasilkan kemudian ditampung dengan larutan CaCl2 yang
diaduk menggunakan stirrer agar butiran mikrokapsul tidak saling menempel satu
sama lain. Butiran mikrokapsul tersebut dicuci dengan akuades sebanyak tiga kali
pengulangan kemudian direndam dalam larutan kitosan 1% pH 4.0 dengan lama
perendaman 30 menit dan 60 menit. Mikrokapsul yang telah tersalut kitosan
dicuci dengan akuades sebanyak lima kali, lalu disimpan di refrigerator dalam
keadaan terendam akuades. Penyalutan dengan CaCl2 dan kitosan tersebut
menggunakan metode Areekul et al. (2006) sebagai two step method.
Pengujian Keberadaan IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul
Sebelum dilakukan pengujian IgG anti E. coli dalam mikrokapsul, sampel
mikrokapsul blanko maupun mikrokapsul berisi IgG anti E. coli dilarutkan
menurut metode Xue et al. (2004) ke dalam 5 ml larutan campuran 0.2 M
NaHCO3 dan 0.06 M Na3C6H5O7.2H2O pada pH 8. Imunoglobulin G yang telah
terlepas dari mikrokapsul kemudian diuji kandungan IgG anti E. coli dengan uji
AGPT dan ELISA. Sampel yang digunakan untuk uji ELISA diatur pH dalam
kondisi asam dan basa (normal, 4, dan 9). Sampel yang digunakan berupa IgG anti
E. coli dari mikrokapsul dengan waktu penyalutan 30 dan 60 menit, IgG kontrol
dan IgG anti E. coli non enkapsulasi hasil pemurnian dari kolostrum.
A. Pengukuran konsentrasi IgG total dalam mikrokapsul dengan ELISA
Anti-bovine IgG diencerkan dalam larutan buffer karbonat bikarbonat pH 9.6
dengan konsentrasi 3.5 µg/ml. Anti-bovine IgG kemudian dimasukkan ke dalam
semua sumuran cawan ELISA sebanyak 100 μl/ sumur (coating). Cawan ditutup
dan diinkubasi semalam pada suhu 4 ˚C. Setelah itu cawan ELISA dicuci dengan
PBS Tween–20 sebanyak lima kali.
Sebagai larutan blocking digunakan PBS Skim 5%. Larutan tersebut
kemudian dimasukkan ke dalam semua sumuran cawan ELISA sebanyak 100 μL/
sumur. Cawan diinkubasi selama satu jam pada suhu 37 ˚C selanjutnya dicuci
kembali lima kali dengan PBS Tween–20.
5
Sebanyak 100 μl larutan standar (IgG sapi) konsentrasi 0.5, 1, 2, 4, dan 8
dimasukkan masing–masing ke dalam dua sumuran cawan yang berbeda.
Sedangkan sampel yang akan diuji dimasukkan ke dalam sumuran cawan yang
lain sebanyak 100 μl/ sumur sesuai dengan pola yang telah ditentukan. Cawan
ELISA kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37 ˚C selama 1 jam lalu
dilakukan pencucian seperti prosedur di atas.
Sebanyak 100 μL konjugat anti-bovine IgG peroxidase yang diencerkan
1:10000 dimasukkan ke dalam semua sumur lalu diinkubasi pada suhu 37 ˚C
selama satu jam. Cawan ELISA dicuci kembali lima kali dengan PBS Tween–20
dan sebanyak 100 μL substrat TMB dimasukkan ke dalam setiap sumur. Cawan
ELISA kemudian diinkubasi pada suhu 37 ˚C selama 15 menit sampai ada
perubahan warna. Hasil reaksi diukur dengan alat pembaca ELISA pada panjang
gelombang 655 nm. Berdasarkan nilai absorbansi standar dihitung konsentrasi
IgG total dalam mikrokapsul menggunakan persamaan regresi linear dengan nilai
absorbansi sebagai Y dan X sebagai konsentrasi.
B. Deteksi IgG anti E. coli K99 dalam mikrokapsul dengan teknik AGPT
Sebanyak 0.1 gram agarose ditambahkan ke dalam 10 ml NaCl 8.5%
kemudian dimasukkan ke dalam autoclave dengan tekanan 15 lb selama 15 menit.
Agarose dipertahankan dengan menambahkan 0.1% sodium azide. Gelas objek
dibersihkan kemudian pada permukaan yang datar dituangkan sebanyak 3.5 ml
agarose hangat lalu dibiarkan sampai dingin dan mengeras. Sumur-sumur pada
gel dibuat dengan menggunakan puncher. Pola yang digunakan yaitu satu sumur
tengah yang dikelilingi oleh enam sumur perifer.
Antigen E. coli yang digunakan merupakan isolat bakteri E. coli yang
dibiakkan pada media nutrient agar (NA) lalu dicuci dengan larutan PBS. Antigen
E. coli kemudian disentrifus dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Setelah
itu, antigen E. coli dapat dipecah menggunakan sonikasi pada suhu 4 ˚C selama 20
menit.
Antigen E. coli dimasukkan pada sumur tengah, sedangkan sampel IgG anti
E. coli yang akan diuji dimasukkan ke dalam masing-masing sumur perifer
dengan menggunakan pipet pasteur. Gelas obyek diletakkan di atas kertas saring
basah agar kelembaban dapat terjaga dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24–
48 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya garis presipitasi (garis buram
putih) di antara sumur antigen dan sumur IgG anti E. coli. Hasil ini menandakan
bahwa antigen dan antibodi tersebut homolog.
C. Deteksi IgG anti E. coli K99 dalam mikrokapsul dengan teknik ELISA
Antigen K99 diencerkan dalam larutan buffer karbonat bikarbonat pH 9.6
sehingga konsentrasinya 5 µg/ml. Antigen kemudian dimasukkan ke dalam semua
sumuran cawan ELISA sebanyak 100 μL/ sumur (coating). Cawan ditutup dan
diinkubasi semalam pada suhu 4 ˚C. Keesokan harinya cawan ELISA dicuci
dengan PBS Tween–20 sebanyak lima kali.
Sebagai larutan blocking digunakan PBS Skim 5%. Larutan tersebut
kemudian dimasukkan ke dalam semua sumuran cawan ELISA sebanyak 100 μL/
sumur (blocking). Cawan diinkubasi selama satu jam pada suhu 37 ˚C, dan
selanjutnya dicuci kembali lima kali dengan PBS Tween–20.
6
Sampel yang akan diuji kemudian dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran
cawan ELISA sesuai dengan pola yang telah ditentukan. Setiap sumuran cawan
berisi sebanyak 100 μL sampel. Cawan ELISA kemudian diinkubasi kembali
pada suhu 37 ˚C selama 1 jam lalu dilakukan pencucian seperti prosedur di atas.
Sebanyak 100 μL konjugat anti-bovine IgG peroxidase yang diencerkan
1:10000 dimasukkan ke dalam setiap sumur lalu diinkubasi pada suhu 37 ˚C
selama satu jam. Cawan ELISA dicuci kembali lima kali dengan PBS Tween–20
dan sebanyak 100 μL substrat TMB dimasukkan ke dalam setiap sumur. Cawan
ELISA kemudian diinkubasi pada suhu 37 ˚C selama 15 menit sampai ada
perubahan warna. Hasil reaksi diukur dengan alat pembaca ELISA pada panjang
gelombang 655 nm. Hasil pengujian dianggap positif bila absorbansinya lebih
besar sama dengan nilai rataan absorbansi IgG kontrol negatif ditambah standart
deviasinya.
Analisis Data
Data yang diperoleh pada penelitian ini diolah dengan Microsoft excel 2007
dan dianalisis secara deskriptif.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini menggunakan sampel pelet dan supernatan IgG anti E. coli
hasil purifikasi. Purifikasi dilakukan untuk mendapatkan IgG anti E. coli murni
dari kolostrum. Pelet dan supernatan IgG anti E. coli dimasukkan ke dalam
mikrokapsul dengan lama penyalutan 30 dan 60 menit. Pengujian stabilitas IgG
anti E. coli dalam mikrokapsul dilakukan dengan dua metode yaitu AGPT dan
ELISA.
Pengukuran Konsentrasi IgG Total dalam Mikrokapsul dengan ELISA
Metode ELISA yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan IgG anti E.
coli K99 dalam mikrokapsul dan IgG non-enkapsulasi yaitu metode ELISA tidak
langsung. Hasil dari uji ini diekspresikan dalam nilai absorbansi. Semakin tinggi
nilai absorbansi maka semakin tinggi konsentrasi antibodinya. Nilai absorbansi ini
menunjukkan konsentrasi antibodi yang dideteksi. Hasil ELISA tidak langsung
dari sampel IgG anti E. coli pada pH 8, 4, dan 9 dari mikrokapsul dengan waktu
penyalutan 30 dan 60 menit ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi
lebih pekat. Semakin pekat warna yang terbentuk, maka nilai absorbansinya
semakin besar (Gambar 5). Banyaknya substrat yang terurai oleh enzim dalam
larutan akan mempengaruhi kekuatan warna yang terbentuk. Kekuatan warna
mununjukkan jumlah ikatan antigen-antibodi primer (Indardi 2005).
7
Gambar 3 Hasil Uji ELISA
Hasil perhitungan kensentrasi IgG kontrol (standar IgG) pada Tabel 1
dengan menggunakan persamaan regresi linear (y=a+bx) diperoleh persamaan
regresi liner y= 0.06+1.05x. Berdasarkan persamaan yang telah diperoleh maka
dapat diketahui nilai konsentrasi IgG total pada masing-masing sampel (Tabel 2).
Tabe l Rataan absorbasi standar dan persamaan regresi linear
Sampel uji
Kontrol
Rataan absorbansi
(y)
X
PBS* 0.095 0
1 1.071 0.5
2 1.268 1
3 1.486 2
4 1.163 4
5 1.565 8
Persamaan regresi linear → y = a+bx
y = 0.06 + 1.05x
Keterangan :* Phosphate buffer saline (sebagai kontrol negatif)
y = nilai absorbansi standar
x = konsentrasi standar IgG
a = 0.06
b = 1.05
Tabel 2 Rata–rata konsentrasi IgG total (μg/ 100 μl) dalam mikrokapsul
Sampel Konsentrasi IgG total
IgG anti E. coli penyalutan 30 menit pH 8 0.971 ± 0.062
IgG anti E. coli penyalutan 30 menit pH 4 1.068 ± 0.060
IgG anti E. coli penyalutan 30 menit pH 9 0.978 ± 0.157
IgG anti E. coli penyalutan 60 menit pH 8 1.059 ± 0.019
IgG anti E. coli penyalutan 60 menit pH 4 1.218 ± 0.092
IgG anti E. coli penyalutan 60 menit pH 9 1.012 ± 0.129
IgG anti E. coli non enkapsulasi pH 7 1.027 ± 0.000
IgG anti E. coli non enkapsulasi pH 4 0.291 ± 0.097
IgG anti E. coli non enkapsulasi pH 9 1.239 ± 0.000
8
Berdasarkan hasil rata-rata konsentrasi IgG total pada Tabel 1 menunjukkan
bahwa teknik mikroenkapsulasi dapat mempertahankan kandungan IgG-nya. Hal
ini tampak pada besarnya konsentrasi antara IgG yang disalut maupun yang tidak
disalut. Konsentrasi IgG total sampel IgG anti E. coli pada pH 4 dari mikrokapsul
dengan waktu penyalutan 30 dan 60 menit lebih tinggi dibandingkan dengan
konsentrasi IgG total pada pH 8 dan pH 9. Konsentrasi IgG total pada pH 4 yang
tidak disalut mengalami penurunan sehingga konsentrasinya lebih rendah
dibandingkan dengan IgG yang tidak mengalami perubahan pH asam (IgG
normal).
Suartini et al. (2007) menyatakan bahwa IgG lebih tahan terhadap pengaruh
pH dibandingkan dengan IgY. Stabilitas IgG pada pH rendah (2–3) lebih tinggi
dibandingkan IgY (Shimizu et al. 1993). Berbanding terbalik dengan IgG, IgY
akan lebih cepat rusak pada pH asam dibandingkan dengan pH basa, hal ini
berkaitan dengan struktur protein IgY yang lebih sensitif terhadap pH asam
dibandingkan pH basa ( Shimizu et al. 1992).
Deteksi IgG anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul dengan Teknik AGPT
Agar gel presipitation test (AGPT) dilakukan untuk mengetahui keberadaan
antibodi spesifik (IgG anti E. coli) dalam mikrokapsul dengan waktu penyalutan
30 dan 60 menit terhadap antigen E. coli K99. Sampel yang diujikan baik kontrol
maupun perlakuan menunjukan hasil negatif pada uji AGPT. Hasil AGPT
ditunjukkan pada Gambar 3 dan 4.
Gambar 1 Hasil AGPT kontrol Keterangan: Ag= Antigen E. coli K99; 1, 2= supernatan IgG anti E. coli non
enkapsulasi; 3, 4= Pelet IgG anti E. coli non enkapsulasi; 5= Supernatan
IgG kontrol; 6= Pelet IgG kontrol.
Gambar 2 Hasil AGPT perlakuan Keterangan:
9
(A). Ag= Antigen Escherichia coli K99; 1, 2= supernatan IgG anti E. coli
penyalutan 30 menit; 3, 4= Mikrokapsul berisi pelet IgG anti E. coli
penyalutan 30 menit; 6, 7= Mikrokapsul blanko.
(B). Ag= Antigen; 1,2= Mikrokapsul berisi supernatan IgG anti E. coli penyalutan
60 menit; 3,4= Mikrokapsul berisi pelet IgG anti E. coli penyalutan 60 menit;
6,7= Mikrokapsul blanko.
Reaksi negatif dari uji AGPT menunjukkan bahwa antibodi terhadap E. coli
K99 tidak terdeteksi dalam mikrokapsul. Reaksi negatif ini ditandai dengan tidak
terbentuknya garis presipitasi di antara sumur antigen dan sumur antibodi. Hal ini
disebabkan karena kurangnya konsentrasi IgG anti E. coli yang diperoleh dari
hasil pelarutan mikrokapsul sehingga proporsi antara antigen dan IgG spesifik
(IgG anti E. coli) tidak mencapai proporsi yang optimal. Pembentukan garis
presipitasi terjadi apabila konsentrasi antigen dan antibodi seimbang (Kresno
1996). Menurut Tizard (1996), pada uji AGPT apabila konsentrasi antibodi lebih
sedikit dibandingkan dengan antigen, maka akan terbentuk kompleks antigen-
antibodi yang berukuran kecil sehingga larut dan tidak akan terbentuk garis
presipitasi.
Deteksi IgG Anti E. coli K99 dalam Mikrokapsul dengan Teknik ELISA
Nilai cut off merupakan batas nilai positif dan negatif adanya antibodi anti E.
coli K99 dalam sampel. Nilai cut off diperoleh dari rata-rata absorbansi sampel
IgG kontrol non enkapsulasi pH 7 (1.097) ditambahkan dengan standar deviasinya
(0.55). Berdasarkan nilai absorbansi IgG kontrol non enkapsulasi, sampel IgG anti
E. coli dikatakan bernilai positif jika nilai absorbansi lebih besar atau sama
dengan nilai cut off (≥ 1.647) dan bernilai negatif jika nilai absorbansi kurang dari
atau sama dengan nilai cut off (≤ 1.647).
Nilai absorbansi yang menggambarkan pengaruh pH terhadap keberadaan
IgG anti E. coli K99 pada IgG anti E. coli dalam mikrokapsul dengan waktu
penyalutan 30 dan 60 menit serta IgG anti E. coli non enkapsulasi disajikan pada
Tabel 3. Hasil pengujian memperlihatkan rataan nilai absorbansi dan interpretasi
berdasarkan nilai cut off. Absorbansi bernilai positif tampak pada IgG anti E. coli
non-enkapsulasi pH 7, sedangkan absorbansi IgG anti E. coli pH 8, 4 dan 9 dari
mikrokapsul dengan waktu penyalutan 30 dan 60 menit bernilai negatif. Hasil ini
menunjukkan bahwa IgG anti E. coli K99 yang disalut dan dilarutkan pada buffer
0.2 M NaHCO3 dan 0.06 M Na3C6H5O7.2H2O dengan pH 8, serta perlakuan asam
dan basa pada pH 4 dan 9 tidak dapat terdeteksi.
Tabel 3 Nilai absorbansi IgG anti E.coli
Sampel uji ke- Rataan absorbasi Interpretasi
PBS 0.357 -
IgG anti E. coli penyalutan 30 menit pH 8 0.012 -
IgG anti E. coli penyalutan 30 menit pH 4 0.118 -
IgG anti E. coli penyalutan 30 menit pH 9 -0.041 -
IgG anti E. coli penyalutan 60 menit pH 8 0.027 -
IgG anti E. coli penyalutan 60 menit pH 4 1.104 -
IgG anti E. coli penyalutan 60 menit pH 9 0.086 -
IgG non-enkapsulasi pH 4 -0.077 -
10
IgG non-enkapsulasi pH 9 1.527 -
IgG anti E. coli non enkapsulasi pH 7 1.887 +
IgG anti E. coli non enkapsulasi pH 4 0.037 -
IgG anti E. coli non enkapsulasi pH 9 1.178 -
Interpretasi : (+) jika rata-rata nilai absorbansi ≥ 1.647
(-) jika rata-rata nilai absorbansi ≤ 1.647
Tidak terdeteksinya IgG anti E. coli K99 dari mikrokapsul dengan waktu
penyalutan 30 dan 60 menit diduga disebabkan karena rusaknya IgG anti E. coli
pada saat pelarutan oleh larutan campuran natrium karbonat dan trisodium sitrat
pada pH 8. Larutan campuran pH 8 ini akan mengganggu membran interphasic
dan melarutkan semua fragmen dari mikrokapsul dalam waktu singkat (Xue et al.
2004) sehingga IgG anti E. coli dapat dikeluarkan. Menurut Davalos et al. (2000)
stabilitas dan densitas permukaan IgG pada pH 8 lebih rendah dibandingkan
dengan IgY. Stabilitas IgY yang lebih tinggi pada pH 8 akan menyebabkan
densitas permukaan pada molekul antibodi IgY juga lebih tinggi, sehingga
imunoreaktifitasnya kemungkinan lebih baik dibandingkan dengan IgG. Selain itu,
IgY juga merupakan molekul yang lebih hidrofobik dibandingkan dengan IgG.
KESIMPULAN
Teknik mikroenkapsulasi IgG anti E. coli berhasil menyalut IgG dengan
konsentrasi berkisar antara 0.971–1.012 μg/ 100 μl. Namun demikian keberadaan
antibodi spesifik (IgG anti E. coli) dalam mikrokapsul tidak dapat terdeteksi
(negatif) berdasarkan uji stabilitas IgG anti E. coli dari mikrokapsul yang terlarut
menggunakan teknik ELISA dan AGPT. Hal ini diduga akibat dari kerusakan
struktur IgG anti E. coli pada proses pelarutan mikrokapsul.
SARAN
Kajian lebih lanjut mengenai teknik pelarutan mikrokapsul yang
mengandung IgG dan diperlukan teknik penyalutan mikrokapsul dengan variasi
waktu yang berbeda-beda untuk melihat keberhasilan penyalutan mikrokapsul.
DAFTAR PUSTAKA
Areekul W, Kruenate J, Prahsarn C. 2006. Preparation and in vitro of
mucoadhesive properties of alginate/ chitosan microparticles containing
prednisolone. Int J Pharm. 312 (1–2): 113–118.
Carter GR, John RC Jr. 1990. Diagnostic Procedurs in Veterinary Bacteriology
and Mycology. 5th
Ed. San Diego (USA): Academic Pr.
11
Davalos-Pantoja L, Ortega-Vinuesa JL, Bastos-Gonzalez D, Hidalgo-Alvarez R.
2000. A comparative study beetwen the adsorption of IgY and IgG on latex
particles. J Biomater Sci Polym Ed. 11: 657–673.
Esfandiari A, Wibawan IWT, Murtini S, Widhyari SD, Febram B. 2008. Produksi
kolostrum antivirus avian influenza dalam rangka pengendalian infeksi virus
flu burung. JIPI. 13(2): 69–79.
Esfandiari A, Wibawan IWT, Wulansari R, Murtini S. 2009. Produksi kolostrum
anti enteropatogen spesifik dalam rangka imunoterapi pasif guna mencegah
Kematian Neonatal Akibat Diare. Laporan Penelitian Hibah Bersaing XIV/
2. Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat, Institut Pertanian
Bogor.
Esfandiari A, Whidhyari SD, Hujarat A. 2011. Diare pada sapi neonatus yang
ditantang Escherichia coli K-99. JIPI. 16(3): 191–197.
Ganong WF. 2002. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Ed ke-20. Widjajakusumah
D, editor. Jakarta (ID): EGC. Terjemahan dari: Review of Medical
Physiology.
Indardi. 2005. Efek sistemik pemberian imunoglobulin y (IgY) anti
enteripathogenic Escherichia coli (EPEC) peroral pada mencit. [skripsi].
Bogor (ID): Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Krasaekoopt W, Bhandari B, Deeth H. 2003. Evaluation of encapsulation
techniques of probiotics for yoghurt. Int Dairy J. 13(1): 3–13.
Kresno SB. 1996. Imunologi: Diagnosa dan Prosedur Laboratorium. Edisi
Keempat. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta (ID): Balai
penerbit FKUI.
Li XY, Jin LJ, Mcallister, Stanford K, Xu JY, Lu YN, Zhen YH, Sun YX, Xu YP.
2007. Chitosan-alginate microcapsules for oral delivery of Yolk
Immunoglobulun (IgY). J Agric food Chem. 55: 2911–2917.
Selk G. 2006. Passive Immunity in The Newborn Calf Affects Lifetime
Performance. Cow/Calf Corner Oklahoma Cooperative Extension Service.
Shimizu M, Nagashima H, Sano K, Hashimoto K, Ozeki M, Tsuda K, Hatta H.
1992. Molecular stability of chichken and rabbit immunoglobulin G. Biosci
Biotech Biochem. 56(2): 270–274.
Shimizu M, Nagashima H, Hashimoto K. 1993. Comparative studies in molecular
stability of immunology G from different spesies. Comp Biochem Physiol B.
106(2): 255–261.
Suartini IGT, Wibawan IWT, Suhartono MT, Supar, Suarta IN. 2007. Aktivitas
IgY dab IgG antitetanus setelah perlakuan pada berbagai pH, suhu, dan
enzim proteolitik. J Vet. 8(4): 160–166. Supar. 1996. Kolibasilosis pada anak sapi perah di Indonesia. Wartazoa. 5(1): 26–
32.
Supar, Kusmiyati, Poerwadikarta MB. 1998. Aplikasi toksin enterotoksigenik
escherichia coli (etec) k99, f41 polivalen pada induk sapi perah bunting
dalam upaya pengendalian kolibasilosis dan kematian pedet neonatal. JITV
3(1): 27–33.
Supar. 2001. Pemberdayaan plasma nutfah mikroba veteriner dalam
pengembangan peternakan: harapan vaksin escherichia coli
enterotoksigenik, enteropatogenik dan verotoksigenik isolat lokal untuk
12
pengendalian kolibasilosis neonatal pada anak babi dan sapi. Wartazoa.
11(1): 36–43.
Suwarno. 2003. Prinsip Dasar, Optimalisasi dan Interpreasi Hasil Uji ELISA.
Surabaya (ID): Lab Virologi dan Immunologi FKH Unair.
Thapa BR. 2005. Therapeutic potentials of bovine colostrums. Ind J Pediatr.
72(10): 849–852.
Tizard. 1996. Veterinary Immunology An introduction. Edisi ke-5. Texas (USA):
WB Saunders Company.
Tizard IR. 2000. Veteriner Immunology an Introduction. Canada (CA): WB
Saunders.
Tizard IR. 2004. Veterinary Immunology an Introduction. Ed ke-7. USA (USA):
Saunders.
Xue WM, Yu WT, Liu XD, He X, Wang W, Ma XJ. 2004. Chemical method of
breaking the cell-loaded sodium alginate/chitosan microcapsules. Chem J
Chin Univ. 25: 1342–1346.
13
RIWAYAT HIDUP
Penulis lahir di Tasikmalaya pada tanggal 9 Juli 1991 dari Ayah yang
bernama Wahyudin dan Ibu bernama Tini Maryani. Penulis merupakan putri
pertama dari tiga bersaudara. Penulis pernah bersekolah di SDN 1 Cikatomas,
SMPN 1 Cikatomas, lulus dari SMAN 1 Cikatomas tahun 2010 dan pada tahun
yang sama lulus seleksi masuk IPB jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) di
Institut Pertanian Bogor.
Selama mengikuti perkuliahan penulis bergabung dalam beberapa
organisasi. Adapun organisasi yang diikuti yaitu Badan Eksekutif Mahasiswa
Fakultas Kedokteran Hewan (BEM FKH) Kabinet Veternity sebagai anggota
Divisi Sosial dan Lingkungan (2011–2012), Himpunan Minat Profesi Satwa Liar
sebagai anggota divisi internal (2012–2013) dan mengikuti magang profesi serta
beberapa kepanitiaan kegiatan kampus FKH IPB.