Nama : Asbar Hamzah

Nim : 60300110006

Kelas : A

1. Perbedaan vektor kloning dan vektor ekspresi

a. Vektor kloning adalah agen pembawa fragmen DNA masuk ke dalam sel

makhluk hidup yang berfungsi untuk memperbanyak fragmen DNA. Beberapa

vektor kloning yang umum digunakan adalah plasmid, vektor lamda, virus,

kromosom bakteri buatan, kromosom khamir buatan, dan cosmid. Suatu vektor

kloning harus dapat disambungkan atau menyatu dengan fragmen DNA yang

ingin ditransfer kemudian dapat dimasukkan ke dalam sel. Di dalam sel

tersebut, fragmen DNA akan diperbanyak jumlahnya. Untuk memilih vektor

kloning yang cocok dalam penelitian, beberapa hal yang harus

dipertimbangkan adalah ukuran fragmen DNA yang akan ditransfer, jumlah

salinan, inkompatibilitas (ketidaksesuaian), marka pemilihan (selectable

marker) untuk seleksi, situs kloning, dan fungsi khusus dari suatu vektor.

b. Vektor ekspresi, adalah salah satu teknik yang digunakan untuk mempelajari

fungsi protein. Pada teknik ini, potongan DNA penyandi protein yang

diinginkan ditransplantasikan ke suatu plasmid (DNA sirkular yang biasanya

ditemukan pada bakteri; dalam teknik ini, plasmid disebut sebagai vektor

ekspresi). Plasmid yang telah mengandung potongan DNA yang diinginkan

tersebut kemudian dapat disisipkan ke dalam sel bakteri atau sel hewan.

Penyisipan DNA ke dalam sel bakteri disebut transformasi, dan dapat

dilakukan dengan berbagai metode, termasuk elektroporasi, mikroinjeksi dan

secara kimia. Penyisipan DNA ke dalam sel eukaryota, misalnya sel hewan,

disebut sebagai transfeksi, dan teknik transfeksi yang dapat dilakukan

termasuk transfeksi kalsium fosfat, transfeksi liposom, dan dengan reagen

komersial. DNA dapat pula dimasukkan ke dalam sel dengan menggunakan

virus (disebut transduksi viral). Setelah penyisipan ke dalam sel, protein yang

disandi oleh potongan DNA tadi dapat diekspresikan oleh sel bersangkutan.

2. Enzim retriksi sticky end dan blunt end

a. Enzim retriksi sticky end adalah Enzim yang memotong pada kedua utas DNA

tidak berhadapan langsung, tetapi selisih 2-4 basa menghasilkan potongan

dengan ujung lengket (lancip.) Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan

semacam ini akan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5’ yang

runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang.

Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu

sama lain. Sedangkan enzim retriksi blunt end adalah enzim yang memotong

DNA pada tempat yang berhadapan sehingga menghasilkan ujung, karena

masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. Fragmen-fragmen DNA

dengan ujung tumpul (blunt end) akan sulit untuk disambungkan. Biasanya

diperlukan perlakuan tambahan untuk menyatukan dua fragmen DNA dengan

ujung tumpul, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau

penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai

tunggal homopolimerik 3’.

b. Contoh enzim retriksi blunt end dan sticky end dan hasilnya

Blunt end (Ujung Tumpul)

Sticky end (Ujung Lancip)

3. Metode transformasi

a. Heat shock adalah metode transformasi DNA ke dalam sel inang dengan

metode kejut panas. Perlakuan ini dimaksudkan untuk membuka pori membran

sel dan mengaktifkan protein Hsp (heat shock protein). Suhu yang digunakan

untuk proses kejut panas adalah 420 C. Perlakuan heatshock tidak dilakukan

terlalu lama yaitu maksimal 90 detik agar sel yang sudah terbuka tidak

membuka terus sehingga sel tidak menjadi lisis. Sebelum diberi suhu 420 C sel

tersebut diinkubasi dalam es selama 20 menit. Selanjutnya untuk mengetahui

DNA insert yang digunakan telah masuk ke dalam sel, maka sel ditumbuhkan

dalam media LB padat yang mengandung ampisilin, LA, xgaL, dan IPTG,

selanjutnya diinkubasi pada suhu 370 C.

b. Elektroforasi adalah transformasi DNA ke dalam sel inang dengan

menggunakan arus listrik. Permeabilitas dinding sel bakteri dapat ditingkatkan

dengan cara menempatkan sel bakteri kedalam medan listrik yang kuat. DNA

dan sel bakteri dimasukkan bersama-sama dalam kuvet khusus yang kemudian

ditempatkan dibawah medan listrik (1,8 kv), dalam waktu yang sangat singkat

sekitar 4-5 detik. Dibawah medan listrik ini dinding sel bakteri dipaksa terbuka

dengan sendirinya, sehingga DNA dapat masuk kedalam sel bakteri kedalam

lubang yang terbentuk tersebut. Teknik ini dapat menyebabkan sebagian besar

sel bakteri mati, namun sel yang bertahan hidup akan menerima DNA. Dewasa

ini elektroporasi sering digunakan untuk transfer DNA karena prosesnya lebih

cepat.

4. Perbedaan E.coli dan A. Tumefaciens sebagai sel inang

a. E. Coli sebagai sel inang

Pemain utama dalam pengembangan teknik dan rekayasa genetika.

Hampir seluruh rekayasa genetika dikembangkan melalui bantuan E.

coli yang berperan sebagai inang plasmid/fage rekombinan.

Hingga saat ini hampir seluruh tahapan kloning, karakterisasi dan

modifikasi fragmen DNA spesifik dilakukan dengan menggunakan

sistem E coli.

Pengembangan vektor bolak balik (shuttel vektor) yang diaplikasikan

untuk mikrorganisme lain dikerjakan dalam sistem E coli.

E. coli masih berperan penting dalam industri bioteknologi untuk

menghasilkan berbagai macam protein

E. coli digunakan sebagai sel inang pada rekayasa genetika hewan.

b. A. tumefaciens sebagai sel inang

A. tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak

digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk

menghasilkan suatu tanaman transgenik.

Di era transformasi genetik sekarang ini, peran agrobacterium sangat

besar dalam menghasilkan tanaman yang dimodifikasi untuk mendapatkan

sifat yang diinginkan.

A. tumafaciens digunakan sebagai sel inang pada sel tanaman

Riany_sains@yahoo.co.id