modul 3 biotek

Download Modul 3 Biotek

Post on 04-Dec-2015

216 views

Category:

Documents

2 download

Embed Size (px)

DESCRIPTION

biotek

TRANSCRIPT

  • MODUL 3

    Isolasi DNA Kromosom

    3.1 TujuanMemahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa

    bakteri Gram negatifmenggunakan GeneJETrM Genomic DNA Purification Kit.

    3.2 PrinsipSel bakteri Gram negatif dipecahkan menggunakan Proteinase K dan

    Digestion Solution atau Lysis Solution RNA a@bggkg" dengan penambatranbuaihvo glr\mno ) - trnF-FrJ drhrlongKen 2

    KNase A. Lisat dicampurkan dengan 9919!, lalu dituangkan.ke $alam kolomiG[elonol 1 tel Pult{lko ii

    purifikasi, sehingga molekul DNA terikat pada membran silika. Kolom dicuci

    dengan W"tl, wffuyrA+membuang kontaminan. DNA kromosom dielusi dari-----.-leqdur dr opo ). bu11er NYa opq ?,

    membran silika pada kondisi kekuatan ionik yang rendah menggunakan Elution

    Btffer.

    33 TeoriDNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

    untuk mengatur perke,lnbangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

    DNA terdapat pada ryLbs, T{glgdttq dan kloroplas. Perbedaan diantaraketiganya' adatatr: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat

    dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk

    sirkular dan tidak berasosiasi derigan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria

  • dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanva mewariskan sifat-sifu

    dari garis ibg. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola

    pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA

    prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki

    protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear

    dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994:. 31!316; Raven &Johnson 2002:94).

    DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan

    komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan

    pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin

    dan pirimidin. 'Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki

    struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin

    (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan

    Sitosin, **1 akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adeninberikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu

    komponen penrbangun (building block) DNA terdiri atas satu rylaJentelgr. satu

    ryglrr 3:3, dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (kwis 2003: 176-178).

    Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat

    herediter pada seltruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap m-ateri

    genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadikromosom. (Human Genome Project 2005: 1). DNA kromosom dari sel eukariotik

    berukuran sangat panjang sehingga akan memiliki viskositas yang tinggr hila

  • berada pada larutan air. Karena sifat kromosom DNA yang rentan, maka selama

    proses ekstraksi perlu dihindari penggunaan pipet tip berukuran sangat kecil serta

    pengocokan (Wink, 20ll).DNA dapat diisolasi dari jaringan hidup, sel, partikel virus, atau sampel

    lain. DNA adalah suafu asam nukleat yang larut dalam air, terpresipitasi sebagai

    makromolekul dalam campuran alkohol dan air. Isolasi DNA dibagi menjadi 2

    tahap yaitu desintegrasi sel dari dinding sel, serta ekstraksi fasa air menggunakan

    fenol/kloroform atau agen ekstraksi hidrofobik lainnya (Wink, 2Ol1). IsolasiDNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat

    dilakukan baik dengan cara mekanis seperti ynikasi, tekanan tinggr, beku-leleh@?

    maupun den$an cag@R f7n"rti pemberian lisozim. langkah berikutnyaadalah lisis sel. Batran-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah

    diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang

    lebih kasar perlu diperlalarkan dengan deterjen yang kuat seperti riton X-100 atau

    dengan sodium dodesil sulfat (SDS).

    Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan penrsakan membran

    nukleus. Setelah sel mengalami lisis, rernukan-remukan sel harus dibuang.

    Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang

    tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform

    untuk "-ra*;,'3.*tugasi dan u,n"l"Llff r** eirzimatis dengair

    proteinase.'DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih

    tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan

    DNA dari RNA. Molekul . DNA yang telah diisolasi tersebut kernucliarr

    t0

  • dimumikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan

    sentrifugasi kerapatan menggunakan CaClz.

    Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA

    senomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara

    kedua macilm molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua

    pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang

    sangat kuat atau dikatakan mernpunyai bentuk covalently closed. circular (CCC),

    sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya elanmempunyai:Eishh-atkg'ra, yang sangat tinggr. Perbedaan tersebut menyebabkan

    DNA plasmid jauh feUitr tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan

    DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat

    memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.

    Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid,

    zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa

    molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit

    daripada jumlah yang diserap oteh DNA kromosom per satuan panjangtya.

    Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan

    kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid

    sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan-

    Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan

    dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi,

    dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin

    digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding" {an

    t1

  • membran sel dengan larutan pelisis sel. Pada isolasi dari genom DNA ini semua

    sel mempunyaii membrane plasma, lapisan lipoprotein ganda yangmembentuk penghalang mernisahkan isi sel dari lingkungan ekstraseluler. DNA

    terdapat didalam suatu sel sehingga untuk mengisolasi suatu DNA, harus

    dilakukan pernecahan sel secara fisik yurg diantaranya yaitu sepertimechanical destruption, liquid homozigation, sonifikasi, freeze danmarual grinding.

    Disintegration ofbacterlal or eukaryotlc washing

    celts (ethanol' salt)

    ,""-#Q #

    o zol I wilsvcr, wqmcmwink - lir'oLiuLr SiotrchnoloEfISBN:978-l-527-326!7-2 Fit.09{3

    Gambar l. Skema Purifikasi DNA dari prokariot atau

    afinitas (Wink,eukariot menggunakan kolom

    20tr).tz-,6 JoM

    -) {olQ Pertuub' nrcV

    3.4 Bahan

    1. Biakan bakteri E. coli Top 10 vans bnmur 18'24 jam.@lupTrohrothon. 7 klonrg l

  • ffir-I

    Solution, Wash Buffer I, Wash Bu/fer II, Elution Buffer (10 mM TrisCl,

    pH 9,0, 0,5 mM EDTA), GeneJETY Genomic DNA PurificationColumn dan tabuogkolektor 2mL-

    ' 5. Etanol50%

    3.5 Alat.r 1 . Tabung Eppendorf 1,5 rnl-. QOt 2. Mikrosentin g" Ol 3. Mikropipet 10G1000pL, 50-200pldan 10-l00pl. (D, Q,. Tip mikropipet biru dan kuning. @

    '{ 5. Irmari es I buahdan freezer -25"C.6. Waterbaith. @

    JM' 8. Inkubator. @J g. Sanurg tangan. O I .5Pr ntu !v 10. Bealcer glass. A.r 11. Pengocok otbitat. (9

    ,,r-+2l}ursg{ 13. Vortex. @

    3.6 Periiapanl. PenyiaPan Pereaksi :

    13

  • o Etanol (96-100%) ditambahkan ke dalam Wash Buffer I dan Wash

    Buffer II denganPerbandingan 3 : 1'

    . Sebelum digunakan, Digest Solution, Lysis solution dati

    Neutralization solution diperiksa untuk mengetahui adanya

    pengendapangaram.Endapanyangterbentukdapatdilarutkan

    kembali dengan memanaskan larutan pada suhu 37oc, lalu

    didinginkan Pada suhu 25oC'

    o Penangan an Lysis solution dan wash Buffer,I harus menggunakan

    sanrng tangan, karena keduanya mengandung zat pengiritasi'

    2. Penyiapan SusPensi Bakteri :

    o sebanyak 1 koloni bakteri E. coliTop 1O diambil dari plate biakan

    berumur l8-24jam, lalu diinokulasikan ke dalam 5 mL medium

    LB yang telah ditambahkan antibiotik kloramfenikol 100 pdmL@(untuk 2 kelompok). Biakan diinkubasi selama 12-16 jam pada

    suhu 37"C dengan pengookan 2oo-25} rpm. untuk hasil

    maksimal, volume labu Erlenmeyer yang digunakan minimal 4 kali

    volume biakan.

    .Sebanyak 1,5 mL biakan bakteri dimasukkan'dalam tabung

    Eppendorfl,5mL,disentrifugasipadakecepatan6.000rpm(5.000xg)selama5menit,lalusupematannyadibuang.Sebanyakl,0mLbiakan bakteri ditambahkan ke dalam pelet bakteri, disentrifugasi

    pada kecepatan 6.000 qpm (5'000 x g) selama 5 menit' lalusuPernatannYa dibuang.

    t4

  • 3.7

    o Pelet bakteri ditambahkan 1,0 mL aquabidest, disentrifugasi pada

    kecepatan 8.000 rpm (5.000 x g) selama 5 menit, lalusupernatannya dibuang. Tahap pencucian ini dilakukan sebanyak 2

    kali.

    Prosedur

    l. Pelet sel bakteri diresuspensi dalam 90 pL Digestion Solution, laht

    ditarnbahkan 10 pL Proteinase K. Campuran dikocok menggunakan

    vortex atau melalui pernipetan berulang untuk menglrasilkan

    suspe,nsi yang homogen.

    Suspensi diinkubasi pada suhu 56"C sambil sesekali divortex atau

    dimasukkan dalam shaking water bath sarryai se