MODUL 3

Isolasi DNA Kromosom

3.1 Tujuan

Memahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa

bakteri Gram negatifmenggunakan GeneJETrM Genomic DNA Purification Kit.

3.2 Prinsip

Sel bakteri Gram negatif dipecahkan menggunakan Proteinase K dan

Digestion Solution atau Lysis Solution RNA a@bggkg" dengan penambatran

buaihvo glr\mno ) - trnF-FrJ drhrlongKen 2

KNase A. Lisat dicampurkan dengan 9919!, lalu dituangkan.ke $alam kolom

iG[elonol 1 tel Pult{lko iipurifikasi, sehingga molekul DNA terikat pada membran silika. Kolom dicuci

dengan W"tl, wffuyrA+membuang kontaminan. DNA kromosom dielusi dari-----.-leqdur dr opo ). bu11er NYa opq ?,

membran silika pada kondisi kekuatan ionik yang rendah menggunakan Elution

Btffer.

33 Teori

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perke,lnbangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

DNA terdapat pada ryLbs, T{glgdttq dan kloroplas. Perbedaan diantara

ketiganya' adatatr: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat

dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk

sirkular dan tidak berasosiasi derigan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria

dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanva mewariskan sifat-sifu

dari garis ibg. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola

pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA

prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki

protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear

dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994:. 31!316; Raven &

Johnson 2002:94).

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan

komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan

pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin

dan pirimidin. 'Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki

struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin

(T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan

Sitosin, **1 akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin

berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu

komponen penrbangun (building block) DNA terdiri atas satu rylaJentelgr. satu

ryglrr 3:3, dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (kwis 2003: 176-

178).

Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat

herediter pada seltruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap m-ateri

genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi

kromosom. (Human Genome Project 2005: 1). DNA kromosom dari sel eukariotik

berukuran sangat panjang sehingga akan memiliki viskositas yang tinggr hila

berada pada larutan air. Karena sifat kromosom DNA yang rentan, maka selama

proses ekstraksi perlu dihindari penggunaan pipet tip berukuran sangat kecil serta

pengocokan (Wink, 20ll).

DNA dapat diisolasi dari jaringan hidup, sel, partikel virus, atau sampel

lain. DNA adalah suafu asam nukleat yang larut dalam air, terpresipitasi sebagai

makromolekul dalam campuran alkohol dan air. Isolasi DNA dibagi menjadi 2

tahap yaitu desintegrasi sel dari dinding sel, serta ekstraksi fasa air menggunakan

fenol/kloroform atau agen ekstraksi hidrofobik lainnya (Wink, 2Ol1). Isolasi

DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat

dilakukan baik dengan cara mekanis seperti ynikasi, tekanan tinggr, beku-leleh@?

maupun den$an cag@R f7n"rti pemberian lisozim. langkah berikutnya

adalah lisis sel. Batran-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah

diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang

lebih kasar perlu diperlalarkan dengan deterjen yang kuat seperti riton X-100 atau

dengan sodium dodesil sulfat (SDS).

Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan penrsakan membran

nukleus. Setelah sel mengalami lisis, rernukan-remukan sel harus dibuang.

Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang

tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform

untuk "-ra*;,'3.*tugasi

dan u,n"l"Llff r** eirzimatis dengair

proteinase.'DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih

tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan

DNA dari RNA. Molekul . DNA yang telah diisolasi tersebut kernucliarr

t0

dimumikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan

sentrifugasi kerapatan menggunakan CaClz.

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA

senomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara

kedua macilm molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua

pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang

sangat kuat atau dikatakan mernpunyai bentuk covalently closed. circular (CCC),

sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya elan

mempunyai:Eishh-atkg'ra, yang sangat tinggr. Perbedaan tersebut menyebabkan

DNA plasmid jauh feUitr tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan

DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat

memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.

Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid,

zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa

molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit

daripada jumlah yang diserap oteh DNA kromosom per satuan panjangtya.

Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan

kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid

sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan-

Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan

dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi,

dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin

digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding" {an

t1

membran sel dengan larutan pelisis sel. Pada isolasi dari genom DNA ini semua

sel mempunyaii membrane plasma, lapisan lipoprotein ganda yang

membentuk penghalang mernisahkan isi sel dari lingkungan ekstraseluler. DNA

terdapat didalam suatu sel sehingga untuk mengisolasi suatu DNA, harus

dilakukan pernecahan sel secara fisik yurg diantaranya yaitu seperti

mechanical destruption, liquid homozigation, sonifikasi, freeze dan

marual grinding.

Disintegration ofbacterlal or eukaryotlc washing

celts (ethanol' salt)

,""-#Q #

o zol I wilsvcr, wqmcmwink - lir'oLiuLr SiotrchnoloEfISBN:978-l-527-326!7-2 Fit.09{3

Gambar l. Skema Purifikasi DNA dari prokariot atau

afinitas (Wink,eukariot menggunakan kolom

20tr).

tz-,6 JoM -)

{olQ Pertuub' nrcV

3.4 Bahan

1. Biakan bakteri E. coli Top 10 vans b€nmur 18'24 jam.@lupTrohrothon. 7 klonrg l<rn tlh dttvtut<''.tr

2. Medium Luria Bertani (LB) cair (Bt"sd. tTt Til;ffi # Jiilqil"vq beror ' ulsol Plq(l

3. tcloramfenikol 100 pglml. dalam medium LB cair.' ' -'

4. GeneJETrM Genomic DNA Purification Kit (Fermentas Life Science) :

Proteinase K Solution, RNase A Solution, Digestion Solution, .Lysis

elution(Hzo)

tr1/-S

r-C{v

t2

ffir-I

Solution, Wash Buffer I, Wash Bu/fer II, Elution Buffer (10 mM TrisCl,

pH 9,0, 0,5 mM EDTA), GeneJETY Genomic DNA Purification

Column dan tabuogkolektor 2mL-

' 5. Etanol50%

3.5 Alat

.r 1 . Tabung Eppendorf 1,5 rnl-. QO

t 2. Mikrosentin g" Ol 3. Mikropipet 10G1000pL, 50-200pldan 10-l00pl. (D

, Q,. Tip mikropipet biru dan kuning. @

'{ 5. Irmari es I buahdan freezer -25"C.

6. Waterbaith. @

JM' 8. Inkubator. @

J g. Sanurg tangan. O I .5Pr ntu !v 10. Bealcer glass. A.r 11. Pengocok otbitat. (9

,,r-+2l}ursg€

{ 13. Vortex. @

3.6 Periiapan

l. PenyiaPan Pereaksi :

13

o Etanol (96-100%) ditambahkan ke dalam Wash Buffer I dan Wash

Buffer II denganPerbandingan 3 : 1'

. Sebelum digunakan, Digest Solution, Lysis solution dati

Neutralization solution diperiksa untuk mengetahui adanya

pengendapangaram.Endapanyangterbentukdapatdilarutkan

kembali dengan memanaskan larutan pada suhu 37oc, lalu

didinginkan Pada suhu 25oC'

o Penangan an Lysis solution dan wash Buffer,I harus menggunakan

sanrng tangan, karena keduanya mengandung zat pengiritasi'

2. Penyiapan SusPensi Bakteri :

o sebanyak 1 koloni bakteri E. coliTop 1O diambil dari plate biakan

berumur l8-24jam, lalu diinokulasikan ke dalam 5 mL medium

LB yang telah ditambahkan antibiotik kloramfenikol 100 pdmL@

(untuk 2 kelompok). Biakan diinkubasi selama 12-16 jam pada

suhu 37"C dengan pengookan 2oo-25} rpm. untuk hasil

maksimal, volume labu Erlenmeyer yang digunakan minimal 4 kali

volume biakan.

.Sebanyak 1,5 mL biakan bakteri dimasukkan'dalam tabung

Eppendorfl,5mL,disentrifugasipadakecepatan6.000rpm(5.000

xg)selama5menit,lalusupematannyadibuang.Sebanyakl,0mL

biakan bakteri ditambahkan ke dalam pelet bakteri, disentrifugasi

pada kecepatan 6.000 qpm (5'000 x g) selama 5 menit' lalu

suPernatannYa dibuang.

t4

3.7

o Pelet bakteri ditambahkan 1,0 mL aquabidest, disentrifugasi pada

kecepatan 8.000 rpm (5.000 x g) selama 5 menit, lalu

supernatannya dibuang. Tahap pencucian ini dilakukan sebanyak 2

kali.

Prosedur

l. Pelet sel bakteri diresuspensi dalam 90 pL Digestion Solution, laht

ditarnbahkan 10 pL Proteinase K. Campuran dikocok menggunakan

vortex atau melalui pernipetan berulang untuk menglrasilkan

suspe,nsi yang homogen.

Suspensi diinkubasi pada suhu 56"C sambil sesekali divortex atau

dimasukkan dalam shaking water bath sarryai sel lisis secara

sempuma (kira-kira 30 menit).

Sebanyak 10 pL KNaseA Solution ditambahkan ke dalam suspensi,

lalu dikocok menggunakan vortex. Campuran diinkubasi selama 10

menitpada suhuruang.

Sebanyak 100 pL Lysis Solution dTtambahkan ke dalam campuran,

lalu dikocok menggunakan vortex selama 15 detik hingga diperoleh

campuran yang homogen.

Sebanyak 2OA pL etanol 50% ditambatrkan ke dalam campuran, laiu

dikocok menggunakan vortex atau melalui pemipetan berulang.

Lisat dituangkan ke GeneJETrM Genomic DNA Purification Colunn

dalam tabung kolektor (2 kelompok). Kolom disentrifugasi selama 1

menit pada kecepatan 7.000 rpm (6.000 x g)' Supernatan dalam

2.

3.

4.

5.

6.

l5

7.

tabung kolektor dibuang. Kolom dimasukkan kembali ke dalam

tabung kolektor yang sama.

Sebanyak 500 pl wash Buffer I ditambahkan ke dalam kolom, lalu

disentrifugasi selama I menit pada kecepatan 9.400 rpm (8000 x g)'

Supernatan dalam tabung kolektor dibuang lalu kolom purifikasi

ditempatkan kembali dalam tabung kolektor yang sama.

Sebanyak 500 pl Wash Buffer II (dengan penambahan etanol)

ditambahkan ke dalam kolom, lalu disentrifugasi selama 3 menit

pada kecepatan 14.000 rpm (12.000 x g). Jika larutan residu masih

terlihat dalam kolom purifikasi, maka tabung kolektor dikosongkan

dan disentrifugasi kembali pada kecepatan yang sama selama I

menit. Supernatan pada tabung kolektor dibuang dan kolom

dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 mL baru-

Sebanyak 200 pL Elution Buffer ditarlbahkan ke bagian tengah

membran kolom plasmid (tip mikropipet tidak boleh menyentuh

membran kolom). untuk mengelusi DNA kromosom- Kolom

diinkubasi selama 2 menit pada suhu frffi8, lalu disentrifugasi pada

kecepatan 9.400 rpn (8000 x g) selama I menit. Tahap ini dilalorkan

sebanyak 2kali.

Catatan:

Jika diperlukan konsenhasi DNA yang lebih pekat atau DNA

diisolasi dari sampel yang jumlahnya sedikit, maka volume Elution

9.

16

l

Buffer dapat'dihnangi menjadi 50-100 pL. Semakin sedikit volume

Elution Buffer,semakin sedikit pula kadar DNA yang terelusi.

10. Kolom putifitasi dilepaskan dari tabung Eppendorf. DNA mumi

dapat langsurydigunakan atau disimpan pada suhu -20"C-

17