TUGAS TERSTRUKTURBIOTEKNOLOGI PERTANIAN

RESTRICTION FRAGMENT LEGTH POLYMORPHISM (RFLP)

Oleh:

Dina Fahrina A1L008077Nitta Hita Pawitra A1L008084Ahmad Alaudin A1L008088Muhammad Ainur R A1L008...

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS PERTANIANPURWOKERTO

2010

I. PENDAHULUAN

Marka molekuler RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

merupakan marka molekuler yang menggunakan enzim restriksi dalam

mengidentifikasi sekuensi-sekuensi DNA pada genom tanaman. Enzim restriksi

ini berperan memotong rangkaian DNA genom tanaman menjadi potongan-

potongan yang berbeda-beda ukurannya dan menjadi sumber informasi genetik

spesifik dalam mendeteksi variasi sekuensi DNA yang dimiliki suatu tanaman.

Analisis RFLP adalah teknik profiling DNA pertama untuk melihat aplikasi

yang luas. Selain sidik jari genetik, RFLP merupakan alat yang penting dalam

pemetaan genom, lokalisasi gen untuk gangguan genetik, penentuan risiko

penyakit, dan uji DNA. Pada prinsipnya, RFLP merupakan semua mutasi yang

menghilangkan atau menciptakan sekuen rekognisi baru bagi enzim restriksi.

Penyisipan (insersi), penghilangan (delesi), maupun subtitusi nukleotida yang terjadi

pada daerah rekognisi suatu enzim restriksi menyebabkan tidak lagi dikenalinya situs

pemotongan enzim restriksi dan terjadinya perbedaan pola pemotongan DNA (Lewin,

1994).

RFLP dapat berfungsi sebagai penduga variasi DNA. Variasi dideteksi

dalam bentuk pemotongan rangkaian panjang polimorfik (ganda) yang mana

waktu penilaian dari rangkaian variasi memungkinkan dari data fragmen itu

sendiri, rangkaian variasi yang panjang dalam suatu bagian dapat dinilai dari

subtitusi nukleotida. Berbagai keunggulan penerapan marker RFLP antara lain:

1. menduga hubungan kekerabatan dari beberapa individu yang dianalisis.

2. Menduga ada tidaknya variasi genetik dari koleksi plama nutfah.

3. Memonitor proses seleksi (melalui linkage) berbagai karakter.

4. Memisah komponen genetik dari karakter kuantitatif.

5. Menganalisis gen yang berasal dari proses transformasi genetik.

6. Bersifat kodominan sehinggan dapat mendeteksi adanya heterozigositas.

7. Memiliki kemampuan memisahkan yang tinggi pada tingkat spesies,

populasi.

Enzim Restriksi

Tahun 1960-an, telah ditemukan sekelompok enzim tertentu yang dapat

mendegradasi DNA dan menghambat (restrict) proses terjadinya infeksi dari

bakterifage penginfeksi bakteri. Kelompok enzim ini, yang kemudian dikenal

sebagai enzim restriksi (Restriction Enzyme), terbukti berperan sangat penting

dalam penerapan teknologi DNA rekombinan di abad modern ini untuk

memanipulasi DNA. Enzim restriksi ini mampu memotong DNA pada situs

pengenal dengan sekuensi DNA yang sangat spesifik (Recognition site). Dengan

demikian enzim ini mampu memproses DNA menjadi potongan-potongan yang

lebih pendek asal DNA tersebut memiliki situs pengenal untuk enzim restrisi

tertentu. Oleh enzim restriksi ini, DNA genomik tanaman yang relatif kompleks

organisasi DNA-nya dapat dipotong-dipotong menjadi populasi potongan DNA

dengan berbagai ukuran. Sampai dengan tahun 1988an, telah diketahui hampir

475 macam enzim restriksi yang berasal dari berbagai organisme.

Enzim restriksi yang biasa dipakai untuk melakukan analisis RFLP biasanya

mempunyai situs pengenal dengan sekuensi DNA 4–6 pasangan basa

(pb). dengan mengetahui situs pengenalnya, frekwensi terjadinya pemotongan

atau ada tidaknya situs pengenal akan dapat diduga. Dengan menasumsikan

bahwa sekuensi nukleotida dalam DNA tersebar acak (random) dan dalam jumlah

yang sama, maka enzim restriksi yang situs pengenalnya 6 pb kemungkinan akan

memotong DNA satu kali (frekwensi situs pengenal = 1) untuk setiap sekuensi

DNA sepanjang 46  atau 4096 pb. Dengan kata lain, untuk setiap DNA yang

panjangnya 4096 pb diduga akan terdapat satu situs pengenal untuk enzim

tersebut. Dengan demikian, enzim yang situs pengenalnya terdiri dari 4 pb

kemungkinan akan ada satu satu situs pengenal untuk setiap 256 pb (44  ) sekuensi

DNA.

Pelacak DNA (DNA Probe)

Jika DNA genome tanaman dipotong  oleh enzim restriksi, beratus-ratus

atau beribu-ribu potongan DNA akan dihasilkan dari pemotongan ini. Untuk

mempelajari pola pemotongan DNA yang berasal adri lokus tertentu dalam

kromosom, maka ratusan atau ribuan potongan tersebut harus dipisah-pisahkan

berdasarkan ukurannya dengan elektroforesis gel agarose dan, potongan DNA

tertentu yang diinginkan harus dapat dibedakan dari populasi potongan DNA

dengan ukuran yang sama dengan melakukan hibridisasi menggunakan pelacak

DNA (DNA probe).

Pelaksanaan analisis RFLP memerlukan penggunaan bahan radioaktif atau

bahan nonradioaktif tertentu untuk memberi label pada pelacak DNA. Bahan ini

harganya masih relatif mahal. Selain itu, bahan radioaktif juga merupakan polutan

yang berbahaya bagi lingkungan. Sebaliknya, bahan non-radioaktif walaupun

tidak berbahaya, tetapi kemampuan dan sensitifitasnya untuk mendeteksi sekuensi

DNA kopi tunggal masih belum efisien. pemberian label pada pelacak DNA

dilakukan dengan teknik nick translation  atau dengan teknik random

priming DNA labelling. Dengan teknik nick translation, salah satu untaian dari

DNA yang akan dilabel diputus diberbagai titik dengan menggunakan

enzim DnaseI. Untaian DNA yang baru akan disintesis kembali oleh enzim

polimerase I dari titik tempat terjadinya pemutusan tersebut. Ketika proses sintesis

DNA yang baru terjadi, nukleotida yang telah diberi label ikut bergabung dalam

untaian DNA baru yang disintesis.

Pelacak DNA yang dipakai dalam penelitian RFLP dapat berupa DNA yang

berasal dari sekerabat dengan spesies tanaman yang diteliti (pelacak homolog)

atau berasal dari tanaman yang tidak sekerabat (pelacak

heterolog). Pelacak heterolog biasanya lebih sulit dalam pemakaiannya karena

biasanya ada homologi sekuensi pelacak DNA dengan DNA tanaman relatif kecil.

Akibatnya, penggunaan pelacak DNA heterolog akan memberikan komplementasi

yang kurang stabil antara DNA tanaman dan pelacak DNA. Pelacak heterologous

dari DNA yang bersifat sangat konservatif (selalu sama untuk berbagai spesies

tanaman) misalnya bagian gen small sub unit dari RUBISCO (Ribulosa Bifosfat

Karboksilasi), gen major klorofil a/b binding protein atau gen RNA ribosomal.

 Hibridisasi DNA - Pelacak DNA

DNA genom yang telah dipotong dengan enzim restriksi harus dilakukan

hibridisasi dengan pelacak DNA yang sudah diklon terlebih dahulu. Prinsip dari

hibridisasi ini adalah setiap untaian tunggal DNA dapat berpasangan dengan

untaian DNA komplementernya. DNA genom yang telah dipotong dan dipisah-

pisahkan dengan ukuran berbeda-beda dipindahkan dari gel agarose ke membran

untuk proses blotting menggunakan pelacak DNA. Jika potongan DNA genom

telah terhibridisasi dengan pelacak DNA, maka akan mengurangi ribuan potongan

DNA genom yang tidak diperlukan atau potongan DNA yang semir pada gel

agarose tidak akan terlihat.

 PCR (Polymerase Chain Reaction)-RFLP

Seiring dengan kemajuan dalam teknologi DNA, analisis RFLP dapat

dilakukan tanpa menggunakan pelacak DNA dan proses hibridisasi DNA.

Penemuan program PCR (Polymerase Chain Reaction) dapat membantu

mendapatkan sekuensi-sekuensi DNA tertentu dari genom DNA, kemudian

dilakukan pemotongan dengan enzim restriksi, atau dengan kata lain analisis

RFLP dapat dilakukan terhadap sekuensi-sekuensi DNA spesifik yang telah

diisolasi dengan menggunakan primer spesifik dalam program PCR.

Dalam analisis PCR, harus menggunakan primer spesifik yang mampu

mengklon sekuensi DNA tertentu yang dapat digunakan sebagai pengganti

pelacak DNA dalam analisis RFLP. Selanjutnya sekuensi DNA yang sudah

diisolasi dipotong dengan berbagai enzim restriksi, guna melihat

variasi/keragaman keberadaan recognition site memberikan ukuran potongan

DNA yang berbeda-beda.Potongan DNA dengan ukuran berbeda beda ini

merupakan gambaran adanya keragaman genetik berdasarkan sekuen DNA yang

diisolasi pada berbagai jenis tanaman yang dianalisis. Sebagai ilustrasi singkat

mengenai analisis RFLP dapat dilihat pada Gambar.

Gambar 1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Markah RFLP memiliki keterbatasan jika digunakan sebagai alat bantu

seleksi. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya: pada beberapa

spesies tingkat polimorfisme DNA-nya sangat rendah, menyita banyak tenaga dan

waktu, kuantitas dan kualitas DNA yang diperlukan sangat tinggi, prosedur

hibridisasinya rumit, sehingga menyulitkan otomatisasi, dan memerlukan pustaka

probe untuk spesies tanaman yang belum pernah dieksplorasi sebelumnya.

II. METODE KERJA

Langkah-langkah kerja untuk mendeteksi RFLP di laboratorium meliputi :

1. Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis

DNA. DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel

yaitu pada mitokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA diperlukan

langkah-langkah laboratorium untuk memecah dinding sel dan membran inti,

dan dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang lain.

Proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis)

biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi

untuk mencegah DNA rusak. Pemisahan DNA dari komponen sel yang lain,

termasuk dibris sel, dilakukan dengan sentrifugasi.

2. Pemotongan dengan enzim restriksi dan elektroforesis gel

DNA hasil isolasi kemudian dipotong dengan menggunakan enzim

restriksi tertentu yang dipilh dengan hati-hati. Setiap enzim restriksi pada

kondisi yang sesuai akan mengenali dan memotong DNA sehingga dihasilkan

fragmen-fragmen DNA. Fragmen-fragmen tersebut selanjutnya di

elektroforesis pada gel agarosa. Karena fragmen-fragmen tersebut tidak akan

terlihat sebagai smear berkesinambungan bila diwarnai eteridium bromide,

maka pewarnaan saja umumnya tidak dapat mendeteksi adanya polimorfisme,

dengan demikian perlu dilakukan hibridasi dan visualisasi dilakukan dengan

Southern blotting.

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada

suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik

tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis

dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam

nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan

pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan

densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks

penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus

listrik yang digunakan.

3. Transfer DNA dengan Sothern blotting.

4. Hibridisasi DNA.

Penggunaan Marka RFLP Dalam Program Pemulian Tanaman

1. Penerapan RFLP menggunakan  pelacak DNA

Kualitas produk akhir daripada gandum (Triticum sp) sangat dipengaruhi

oleh GPC (Grain Protein Consentration) dan komposisinya. Protein biji yang

tinggi sangat diharapkan pada berbagai produk roti dan pasta. Karena sangat

penting sebagai kategori kualitas produk akhir dan nutrisi manusia, salah satu

pendekatan untuk meningkatkan protein biji dalam gandum adalah penggunaan

gen-gen protein tinggi yang berasal dari kerabat liar. Wild emmer (Triticum

turgidum L. var.dicoccoides) merupakan progenitor intermediate pada gandum

yang potensial sebagai sumber gen-gen protein tinggi.Berdasarkan penemuan tiga

galur gandum hard red spring yang diperoleh dari wild emmer mewariskan

kandungan protein biji menjadi lebih meningkat (Asfaw, et al., 1999).

Studi ini dilakukan dengan menggunakan marker RFLP bertujuan  (i) untuk

mengindentifikasi region-region genom yang berasosiasi dengan konsentrasi

protein biji yang tinggi, (ii) menguji efek background genetik dan lingkungan

pada gen-gennya, (iii) menentukan ukuran genetik segmen kromosom yang

terintrogresi ke dalam genotipe gandum hard red spring.

Analisis RFLP pada tanaman gandum ini menggunakan 96 klon DNA copy

rendah dari genom gandum, cDNA barley, DNA genom barley dan pustaka

cDNA out serta menggunakan 5 macam enzim restriksi. Empat genotipe parental

telah disurvey untuk polimorphisnya sebanyak 96 klon dengan DNA copy rendah

berlokasi pada kromosom 5 dan 6. Satu single region yang berasosiasi dengan

GPC tinggi dideteksi dengan 5 marker RFLP yang berlokasi dekat sentromer pada

kromosom 6B. Marker ini menjelaskan 21 - 35  % variasi fenotipe dalam GPC

pada 3 populasi. DNA marker dalam region mungkin digunakan untuk introgasi-

introgasi gen GPC tinggi dengan cepat ke dalam plasma nutfah gandum lainnya

(Asfaw, et al., 1999)

2. Penerapan RFLP Tanpa Menggunakan Pelacak DNA (PCR-RFLP)

Kacang Pigeon (Cajanus cajan, L. Millsp) adalah salah satu tanaman legum

biji utama tropis dan sub tropis. Secara umum tanaman ini merupakan tanaman

budidaya tahunan. Kultivar tradisionil dan landrace tanaman ini yang merupakan

tanaman berumur panjang, juga tumbuh sebagai intercrop yang berumur

pendek. Pusat origin tanaman ini yaitu india atau Afrika. Berdasarkan jumlah

kromosom dan morfologi bunga menurut Van der Maesen (1980), tanaman

kacang pigeon adalah asli India dengan Afrika sebagai pusat keragaman

kedua. Tanaman kacang pegeon mempunyai beberapa type liar sampai enam

genera (Van der Maesen,1980)

Beberapa spesies liar Cajanus dan Rhynchosia digunakan para pemulia

tanaman dalam hibridisasi interspesifik untuk transfer gen yang dimungkinkan

kedalam tanaman budidaya. Walaupun demikian, studi tentang hubungan genetik

didalam antar lima genera rumpun Cajaninae ini sangatlah terbatas. Penggunaan

teknik molekuler untuk mempelajari pilogenetik (asal usul), pola

evolusi anhubungan kekerabatan Cajanus kurang menjadi perhatian. Baru-baru ini

region gen chloroplas ditemukan mempunyai kegunaan yang luas dalam

mempelajari pilogenitik sejumlah tanaman. Tingkat evolusi yang rendah pada gen

ini sebagai pembanding gen inti, membuatnya sangat cocok dalam mempelajari

pilogenetik (asal usul) sejumlah tanaman. Tingkat evolusi yang rendah pada gen

ini sebagai pembanding gen inti,membuatnya sangat cocok dalam mempelajari

variasi pada tingkat yang lebih tinggi dari spesies (Palmer, 1988). Karena

tersedianya program PCR dan primer spesifik untuk amplifikasi region gen

kloroplas, studi ini menjadi lebih mudah dan lebih efektif dari segi

biaya, serta hasilnya dapat dipercaya dan diulang kembali.

PCR-RFLP memiliki empat region gen khloroplas yaitu rbcL, trnS-

psbC,trnL-UAA dan 16S dari 28 spesies dianalisis menggunakan primer spesifik

untuk tiap gen yang diamplifikasi dengan program PCR. Ukuran amplifikasi rbcL

yaitu 1,4 kb; trnS-psbC 1,6 kb; trnL-UAA 0,59 kb untuk semua genera kecuali

Dunbaria dengan ukuran amplifikasi 0,47 kb dan 16S yaitu 1,3 kb. Tidak ada

ukuran yang berbeda dari fragmen amplifikasi semua spesies yang dianalisis

(Mukkamala , et al., 2000).

Analisis intergenerik menunjukkan bahwa lima genera Cajanus,

Rhynchosia, Dumbaria, Paracalyx dan Flemingia memberikan profil amplifikasi

region gen rbcL yang sama dan subsekuen gen tersebut dipotong dengan enzim

restriksi yang berbeda. Pemotongan dengan PstI menunjukkan profil

yang sama pada Cajanus, Paracalyx sedangkan, Rhyncosia, Paracalyx dan

Flemingia menunjukkan profil yang sama pula (Mukkamala, et al., 2000).  

DAFTAR PUSTAKA

Asfaw,  R.C Fronhberg and  J. A Aderson., 1999. RFLP Marker Associated with High Grain Protein from Triticum turgidum L. var dicoccoides Introgressed into Hard Red Spring. J. Crop. Sci. 39 ; 508 - 513

 Grodziker T,  J. William, P. Sharp and J. sambrook. 1974. Physical Mapping of

Temperature sensitive mutation of adenovirus. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 39 : 439 - 446.

Mukkamala L, P. Senthilkumar, M. Parani, M.N. Jithesh and A. K. Parida. 2000.  PCR-RFLP Analysis of Chloroplast Gene Regions in Cajanus (Leguminose) and alliged Genera. Euphytica 116 : 243 - 250. Netherlands.

 Palmer, J.D.,  R. K. Jansen, M.W. Chase & J.R. Manhart., 1988. Chloroplast

DNA Variation and Plant Phylogeny. Annal Missou Bot Gar 75 : 1180 - 1206.

Van der Maesen, L.J.G., 1980. India is the Native Home of Pigeonpea, In;  J.C. Arends, G. Boelema, C.T. de Groot & A.J.M. Leeuwenberg (Eds), Libergratulatorius in honorem  H.C.D de wit,  pp. 256 -262. Landebouwhogeschool Miscellaneous Paper No.19, Wageningen, Netherlands ; H. Veenman and B.V.Zonen