MAKALAH SINTESIS ENZIMATIS

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKALAH

“ PRODUKSI BIOETANOL DARI ECENG GONDOK (Eichhorniacrassipes) dengan Zymomonas mobilis dan Saccharomyces cerevisiae “

DISUSUN OLEH :

KUSBANDIA N111 11 266

MAKASSAR

2013

BAB I

PENDAHULUAN

Eceng gondok (Eichhornia crassipes) telah dikenal sebagai gulma air. Hal ini

disebabkan karena eutrofikasi yang terjadi di badan air. Eutrofikasi merupakan peristiwa

meningkatnya bahan organik dan nutrien (terutama unsur Nitrogen dan Phospor) yang

terakumulasi di badan air. Peningkatan bahan organik dan nutrien ini berasal dari

limbah domestik, limbah pertanian, dan lain-lain. Bioetanol dapat diproduksi dari

berbagai bahan baku yaitu saccharine material, starchy material dan lignocellulose

material. Saccharine material dapat langsung difermentasi untuk menghasilkan etanol.

Starchy material perlu dilakukan hidrolisis terlebih dahulu sebelum difermentasi.

Lignocellulose material perlu dilakukan pretreatment untuk mendegradasi strukturnya

yang kompleks. Produksi bioetanol terdiri dari beberapa proses, yaitu pretreatment,

hidrolisis dan fermentasi. Eceng gondok mengandung hemiselulosa 48,70 ± 0,027%

dan selulosa 18,20 ± 0,012% berat basah (Nigam, 2002) dan 4,1% pati pada daun

eceng gondok. Beberapa penelitian mengenai produksi bioetanol dengan bahan baku

eceng gondok telah dilakukan sebelumnya. Pada tahap pretreatment digunakan

campuran NaOH dan H2O2 (Mishima dkk., 2008) dan H2SO4 . Pada penelitian ini

dilakukan pretreatment dengan pemanasan. Proses hidrolisis terdiri dari tahap likuifikasi

dan sakarifikasi. Tahap likuifikasi digunakan jamur Aspergillus niger yang menghasilkan

enzim α-amilase untuk mendegradasi pati. Tahap sakarifikasi digunakan ragi

Saccharomyces cerevisiae yang menghasilkan enzim glukoamilase untuk mengubah

polisakarida menjadi gula yang dapat difermentasi (glukosa, galaktosa, manosa dan

sebagainya). A. niger juga menghasilkan enzim selulase untuk mendegradasi selulosa.

Beberapa mikroorganisme dapat melakukan fermentasi etanol dari substrat hasil

degradasi eceng gondok, diantaranya Pichia stipitis NRLL Y-7124, ragi yang diisolasi

dari bermacam-macam hidrosfer (Masami, dkk., 2008). Pada penelitian ini digunakan

bakteri Zymomonas mobilis dan Saccharomyces cerevisiae.

BAB II

PEMBAHASAN

1. Tipe-tipe Fermentasi

Fermentasi  adalah proses produksi energi dalam sel dalam

keadaan anaerobik (tanpa oksigen). Secara umum, fermentasi adalah salah satu

bentuk respirasi anaerobik, akan tetapi, terdapat definisi yang lebih jelas yang

mendefinisikan fermentasi sebagai respirasi dalam lingkungan anaerobik dengan tanpa

akseptor elektron eksternal.

Gula adalah bahan yang umum dalam fermentasi. Beberapa contoh hasil

fermentasi adalah etanol, asam laktat, dan hidrogen. Akan tetapi beberapa komponen

lain dapat juga dihasilkan dari fermentasi seperti asam butirat dan aseton. Ragi dikenal

sebagai bahan yang umum digunakan dalam fermentasi untuk

menghasilkan etanol dalam bir, anggur dan minuman beralkohol lainnya. Respirasi

anaerobik dalam otot mamalia selama kerja yang keras (yang tidak memiliki akseptor

elektron eksternal), dapat dikategorikan sebagai bentuk fermentasi yang menghasilkan

asam laktat sebagai produk sampingannya. Akumulasi asam laktat inilah yang berperan

dalam menyebabkan rasa kelelahan pada otot.

Adapun tipe-tipe fermentasi dan reaksinya adalah sebagai berikut:

1. Fermentasi Alkohol

Beberapa jasad renik seperti ragi, glukosa dioksidasi menghasilkan etanol dan CO2

dalam proses yang disebut fermentasi alkohol. Jalur metabolisme proses ini sama

dengan glikolisis sampai dengan terbentuknya piruvat. Dua tahap reaksi enzim

berikutnya adalah reaksi perubahan asam piruvat menjadi asetaldehida, dan reaksi

reduksi asetaldehida menjadi alkohol. Dalam reaksi pertama piruvat didekarboksilasi

diubah menjadi asetaldehida dan CO2 oleh piruvat dekarboksilase, suatu enzim yang

tidak terdapat dalam hewan. Reaksi dekarboksilase ini merupakan reaksi yang tak

reversible, membutuhkan ion Mg2+ dan koenzim tiamin pirofosfat. Reksi berlangsung

melalui beberapa senyawa antara yang terikat secara kovalen pada koenzim. Dalam

reaksi terakhir, asetaldehida direduksi oleh NADH dengan enzim alkohol

dehidrogenase, menghasilkan etanol. Dengan demikian etanol dan CO2 merupakan

hasil akhir fermentasi alkohol, dan jumlah energi yang dihasilkan sama dengan glikolisis

anaerob, yaitu 2 ATP.

2. Fermentasi Asam Laktat

Fermentasi asam laktat banyak dilakukan oleh fungi dan bakteri tertentu digunakan

dalam industri susu untuk membuat keju dan yoghurt. Aseton dan methanol merupakan

beberapa produk samping fermentasi mikroba jenis lain yang penting secara komersil.

Dalam fermentasi asam laktat, piruvat direduksi langsung oleh NADH untuk membentuk

laktat sebagai produk limbahnya, tanpa melepaskan CO2. Pada sel otot manusia,

fermentasi asam laktat dilakukan apabila suplay oksigen tubuh kurang. Laktat yang

terakumulasi sebagai produk limbah dapat menyebabkan otot letih dan nyeri, namun

secara perlahan diangkut oleh darah ke hati untuk diubah kembali menjadi piruvat.

Bakteri asam laktat mampu mengebah glukosa menjadi asam laktat. Bakeri tersebut

adalah Laktobbacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus  dan Bifidobacterium.

Ada 2 kelompok fermentasi asam laktat, yaitu homofermentatif dan heterofermentatif.

Homofermentatif menggunakan glikolisis melalui jalur EMP dan heterofermentatif

menggunakan glikolisis melalui jalur HMP.

3. Fermentasi Asam Campuran

Enterobacteriaceae (Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Klebsiella, dan Shigella)

memfermentasikan glukosa menjadi campuran asam asetat, format, suksinat, etanol,

CO2, dan H2. Semua produk diperoleh dari fosfoenol piruvat (PEP) atau lebih tepatnya

suksinat dari PEP, sedang yang lainnya dari piruvat (piruvat diperoleh dari PEP).

Suksinat diperoleh dari karboksilasi PEP melalui jalur reduktif-asam sitrat (jalur

suksinat). PEP diubah menjadi oksaloasetat oleh PEP karboksilase. Perubahan

oksaloasetat menjadi suksinat melalui rute dan melibatkan enzim yang sama seperti

pada perubahan oksaloasetat menjadi pada fermentasi propionat untuk bakteri

Propionibacterium. Laktat diperoleh langsung dari reduksi piruvat oleh laktat

dehidrogenase. Format diperoleh dari pemecahan piruvat (hasil lain adalah asetil KoA),

kemudian dapat diubah menjadi CO2 dan H2. Asetil KoA dapat diubah menjadi etanol

maupun asetat.

Lactobacillus helveticus memfermentasi sitrat dan laktosa menjadi laktat. Akan tetapi,

jika laktosa ditiadakan, terjadi perubahan produk fermentasi, yaitu menghasilkan asetat

dan suksinat, bukan laktat. Asetoin dan diasetil tidak terdektesi pada produk fermentasi

Lactobacillus helveticus.  Produksi asetat dari piruvat (hasil konversi sitrat) diperantai

oleh NADH oksidase, bukan asetat kinase.

4. Fermentasi Anaerob

Dalam keadaan normal, respirasi seluler organisme dilakukan melalui proses fosforilasi

oksidatif yang memerlukan oksigen bebas. Sehingga hasil ATP respirasi sangat

tergantung pada pasokan oksigen yang cukup bagi selnya. Tanpa oksigen

elektronegatif untuk menarik elektron pada rantai transport elektron, fosforilasi oksidatif

akan terhenti. Akan tetapi, fermentasi memberikan suatu mekanisme sehingga

sebagian sel dapat mengoksidasi makanan dan menghasilkan ATP tanpa bantuan

oksigen. Misalnya, pada tumbuhan darat yang tanahnya tergenang air sehingga akar

tidak dapat melakukan respirasi aerob karena kadar oksigen dalam rongga tanah

sangat rendah.

Secara prosedural, fermentasi merupakan suatu perluasan glikolisis yang dapat

menghasilkan ATP hanya dengan  fosforilasi tingkat substrat sepanjang terdapat

pasokan NAD+ yang cukup untuk menerima elektron selama langkah oksidasi dalam

glikolisis. Mekanisme fermentasi tidak dapat mendaur ulang NAD+  dari NADH karena

tidak mempunyai agen pengoksidasi (kondisi anaerob). Sehingga yang terjadi adalah

NADH melakukan transfer elektron ke piruvat atau turunan piruvat. Berikut bahasan

terhadap dua macam fermentasi yang umum yaitu fermentasi alkohol dan fermentasi

asam laktat.

a. Fermentasi alkohol

Fermentasi alkohol biasanya dilakukan oleh ragi dan bakteri yang banyak digunakan

dalam pembuatan bir dan anggur. Pada Fermentasi alkohol, piruvat diubah menjadi

etanol dalam dua langkah. Langkah pertama menghidrolisis piruvat dengan molekul air

sehingga melepaskan karbondioksida dari piruvat dan mengubahnya menjadi

asetaldehida berkarbon dua. Dalam langkah kedua, asetaldehida direduksi oleh NADH

menjadi etanol sehingga meregenerasi pasokan NAD+ yang dibutuhkan untuk glikolisis.

b. Fermentasi asam laktat

Fermentasi asam laktat banyak dilakukan oleh fungi dan bakteri tertentu digunakan

dalam industri susu untuk membuat keju dan yogurt. Aseton dan methanol merupakan

beberapa produk samping fermentasi mikroba jenis lain yang penting secara komersil.

Dalam fermentasi asam laktat, piruvat direduksi langsung oleh NADH untuk membentuk

laktat sebagai produk limbahnya, tanpa melepaskan CO2. Pada sel otot manusia,

fermentasi asam laktat dilakukan apabila suplay oksigen tubuh kurang. Laktat yang

terakumulasi sebagai produk limbah dapat menyebabkan otot letih dan nyeri, namun

secara perlahan diangkut oleh darah ke hati untuk diubah kembali menjadi piruvat.

2. Penerapan Fermentasi Dalam Bidang Bioteknologi

2.1 Penerapan Fermentasi Dalam Bidang Pangan

Fermentasi merupakan proses perubahan-perubahan kimia dalam suatu substrat

organik yang berlangsung karena aksi katalisator biokimiawi yaitu enzim yang

dihasilkan oleh mikroba-mikroba hidup tertentu (Tjokroadikoesoemo,

1993).  Fermentasi sering diganti dengan peragian. Ragi-ragi tersebut mempunyai

persamaan yaitu manghasilkan fermen atau enzim yang dapat mengubah substrat

menjadi bahan lain dengan mendapat keuntungan berupa energi. Proses fermentasi

dapat dimanfaatkan dalam bidang industri pangan, baik yang dibuat melalui proses

produksi yang sangat sederhana (tradisional/konvensional) maupun yang modern.

Pemanfaatan mikroba dalam bidang bioteknologi  telah memberikan dapak yang positif

bagi kelangsungan  hidup manusia, salah satunya untuk pengolahan  makanan.

Namun, tidak semua mikroba tersebut dapat digunakan untuk pengolahan makanan.

Adapun beberapa jenis mikroba yang bermanfaat untuk pengolahan makanan, yaitu: 

jenis bakteri dan jenis jamur. Mikroba jenis bakteri yang digunakan dalam pemanfaatan

berbagai macam produk adalah: Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus cerevisiae,

Acetobacter. Pada mikroba jenis fungi yang digunakan dalam  pemanfaatan berbagai

macam  produk adalah jamur Rhyzopus oryzae, Neurospora sitophila, Aspergillus

wentii dan Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae.

Adapun contoh yang konvensional misalnya bisa dilihat dalam proses pembuatan tape,

tempe, dan tuak. Contoh yang modern misalnya pembuatan yougurt, keju, wine. Semua

proses pembuatan pangan ini memerlukan bantuan mikroorganisme. Berikut

merupakan beberapa produk olahan yang menggunakan bantuan mikroba tersebut.

3. Metode-metode yang dilakukan dalam Produksi Bioetanol dari Eceng Gondok

crassipes) dengan Zymomonas mobilis dan Saccharomyces cerevisiae yaitu :

a. Pretreatment

Ada dua macam proses pretreatment yang dilakukan pada penelitian ini, yaitu

pretreatment asam dan pemanasan. Asam yang digunakan adalah asam sulfat 2%

(v/v). Sedangkan pemanasan menggunakan autoclave pada suhu 121 0C selama 30

menit. Proses pretreatment asam dilakukan dengan menambahkan 420 mL asam sulfat

2% (v/v) ke dalam 25 gram tepung eceng gondok, kemudian distirer selama 7 jam.

Selanjutnya suspensi eceng gondok dinetralkan dengan 30 mL NaOH 6 M dan

ditambah 50 mL buffer asetat 0,1 M (pH 5). Proses pretreatment pemanasan dilakukan

dengan memanaskan 25 gram tepung eceng gondok pada suhu 121 0C selama 30

menit. Selanjutnya ditambah 450 mL akuades dan 50 mL buffer asetat 0,1 M (pH 5).

b. Hidrolisis

Proses hidrolisis meliputi dua tahap, yaitu tahap likuifikasi dan sakarifikasi. Tahap

likuifikasi dilakukan variasi seeding ratio jamur A. niger sebagai starter. Variasi seeding

ratio sebesar 4/40 (v/v) dan 8/40 (v/v) dengan waktu inkubasi dalam tahap likuifikasi

selama dua hari. Selanjutnya dipanaskan pada suhu 90 0C selama 60 menit. Tahap

sakarifikasi dengan ragi S. cerevisiae dengan waktu inkubasi selama satu hari.

Selanjutnya dipanaskan pada suhu 60 0C selama 50 menit. Setelah dilakukan proses

sakarifikasi, kadar glukosa diukur dengan metode Nelson-Somogyi. Pembuatan starter

jamur A. niger dilakukan dengan menginokulasikan A. niger dalam media PDB (Potato

Dextrose Broth) kemudian dishaker pada suhu ruang selama 24 jam. Volume masing

masing seeding ratio 4/40 (v/v) dan 8/40 (v/v) berturut-turut adalah 50 mL dan 100 mL.

Starter untuk S. cerevisiae dibuat dari S. cerevisiae yang diinokulasikan dalam media

PDB sebanyak 100 mL dan dishaker pada suhu ruang selama 8 jam.

Fermentasi

Tahap fermentasi dilakukan selama lima hari. Substrat hasil hidrolisis disaring,

kemudian masing-masing 100 mL substrat ditambah starter Z. mobilis dan S. cerevisiae

sebanyak 20% (v/v). Starter untuk Z. mobilis dibuat dari media NB (Nutrient Broth) yang

diinokulasikan Z. mobilis dan dishaker selama selama 6 jam. Starter untuk S. cerevisiae

dibuat dari media PDB yang diinokulasikan S. cerevisiae kemudian dishaker selama 8

jam. Cairan hasil fermentasi disampling untuk dianalisis kadar etanol. Sampling

dilakukan mulai hari kedua hingga hari kelima.

4. HASIL DAN DISKUSI

a. Pretreatment

Biomassa eceng gondok tersusun dari lignoselulosa. Proses Pretreatment dibutuhkan

untuk mengubah struktur lignoselulosa agar lebih mudah diakses oleh enzim yang

mengubah polimer karbohidrat (selulosa dan hemiselulosa) menjadi gula yang dapat

difermentasi (fermentable sugar). Lignoselulosa sebagai penyusun dinding sel tanaman

eceng gondok terdiri dari polimer selulosa dan hemiselulosa yang dilindungi oleh lignin.

Lignoselulosa memiliki bagian kristalin dan amorf. Struktur kristalin lignoselulosa adalah

selulosa yang tersusun dari rantai glukosa yang saling terikat dengan ikatan 1-4 β

glikosida dan adanya ikatan hidrogen antara gugus hidroksil pada rantai yang

berdekatan, sehingga strukturnya menjadi kokoh. Struktur amorf lignoselulosa adalah

hemiselulosa yang tersusun dari glukosa, manosa, galaktosa, xylosa, arabinosa,

sejumlah kecil ramnosa dan asam galaktonik. Struktur amorf ini tidak sekuat struktur

kristalin sehingga lebih mudah diuraikan melalui proses pretreatment. Tahap

pretreatment dengan asam termasuk proses pretreatment secara kimia. Bahan kimia

yang umum digunakan adalah H2SO4, H3PO4, HCl. Selain pretreatment dengan asam,

proses pretreatment secara kimia lainnya adalah dengan alkali (NaOH, NH3), gas (Cl2,

NO2, SO2), agen pengoksidasi (H2O2, ozon) (Pandey, 2009). Tanaman eceng gondok

yang mempunyai struktur lignoselulosa (Nigam, 2002) membutuhkan proses

pretreatment untuk memecah struktur lignoselulosanya, sehingga dapat dihidrolisis

menjadi monosakarida. Proses pretreatment pemanasan pada suhu tinggi termasuk

proses fisika. Selain pemanasan pada suhu tinggi, proses fisika lainnya adalah

pengubahan ukuran partikel biomassa (bahan baku) menjadi sekecil mungkin (Pandey,

2009). Untuk itu, tanaman eceng gondok dikeringkan dan dihaluskan menjadi tepung

eceng gondok, sehingga ukuran partikelnya semakin luas. Tepung eceng gondok yang

dipaparkan pada suhu tinggi diharapkan dapat memutus ikatan-ikatan dalam

polisakarida tepung eceng gondok. Ukuran partikel yang semakin kecil dapat

memaksimalkan interaksi partikel tepung eceng gondok dengan enzim-enzim yang

dihasilkan dari jamur Aspergillus niger untuk memutus ikatan polisakarida.

b. Hidrolisis

Penelitian ini menggunakan proses hidrolisis secara biologi. Proses hidrolisis ini terdiri

dari dua langkah, yaitu likuifikasi dan sakarifikasi. Mikroba yang digunakan adalah

jamur Aspergillus niger dan Saccharomyces cerevisiae. Jamur A.niger digunakan pada

tahap likuifikasi dan S.cerevisiae digunakan pada tahap sakarifikasi. Jamur A. niger

menghasilkan enzim α-amilase dan glukoamilase yang mampu menghidrolisis pati.

Enzim α-amilase mampu memutus ikatan α-1,4 glikosida secara acak di bagian dalam

pati. Akibat dari aktivitas tersebut, rantai pati terputus-putus menjadi maltosa,

maltotriosa, glukosa dan dekstrin. Sedangkan enzim glukoamilase akan memecah

ikatan α-1,4 maupun α-1,6 glikosida pada molekul pati menjadi gula reduksi (Purwantari

dkk., Ragi S. cerevisiae juga menghasilkan enzim glukoamilase, agar dihasilkan gula

reduksi yang lebih banyak. Selain menghasilkan enzim α-amilase dan glukoamilase, A.

niger juga menghasilkan enzim selulase. Enzim ini menghidrolisis acak dari ikatan β-1,4

glikosida dari selulosa. Proses hidrolisis merupakan langkah selanjutnya untuk

memecah struktur polisakarida menjadi monosakarida. Selulosa merupakan komponen

terbesar kedua dari tanaman eceng gondok setelah hemiselulosa. Rantai selulosa yang

terhidrolisis akan menghasilkan disakarida selobiosa. Selanjutnya selobiosa yang

terhidrolisis lebih lanjut akan menghasilkan glukosa. Selobiosa merupakan disakarida

yang tersusun dari dua unit monomer glukosa. Selobiosa diperoleh dari hidrolisis parsial

selulosa. Hemiselulosa merupakan heteropolimer yang tersusun dari monomer

karbohidrat yang bermacam-macam. Hemiselulosa tersusun dari galaktosa, glukosa,

arabinosa, sedikit rhamnosa, asam glukoronik, asam metil glukoronik dan asam

galakturonik. Hemiselulosa mempunyai struktur acak dan amorf sehingga lebih mudah

dihidrolisis.

c. Fermentasi

Fermentasi merupakan proses produksi energi dari mikroorganisme dalam kondisi

anaerobik (tanpa udara). Mikroorganisme yang melakukan fermentasi etanol harus

dapat memfermentasi semua monosakarida yang terkandung dalam media. Penelitian

ini menggunakan dua mikroorganisme, yaitu Saccharomyces cerevisiae dan

Zymomonas mobilis. Ragi S. cerevisiae dapat memfermentasi substrat glukosa,

fruktosa, galaktosa, sukrosa dan pati. Sedangkan bakteri Z. mobilis dapat

memfermentasi substrat glukosa, fruktosa dan sukrosa (Sen, 1989). Sebelumnya,

S.cerevisiae maupun Z. mobilis dipre-culture selama 24 jam berturut-turut dalam media

PDB (Potato Dextrose Broth) dan Nutrient Broth (terdiri dari lactose, pepton dan yeast

extract). Pre-culture dimaksudkan untuk memperbanyak sel, sehingga media atau

substrat dapat langsung dimanfaatkan oleh mikroba untuk melakukan proses

fermentasi. Proses fermentasi dilakukan selama lima hari untuk melihat tren etanol

yang dihasilkan. Sampling dilakukan mulai hari kedua hingga hari kelima. Sampling

dilakukan mulai hari kedua karena diasumsikan pada hari pertama mikroba dalam fasa

adaptasi dengan media atau substratnya. menghasilkan glukosa secara optimum.

Selain itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai mikroorganisme yang efektif

melakukan fermentasi dengan substrat yang berasal dari degradasi lignoselulosa eceng

gondok.

BAB III

PENUTUP

III.1 Kesimpulan

Kesimpulan dari penelitian ini adalah:

1. Kadar glukosa yang tertinggi pada sampel B4. Sampel ini dihasilkan dari proses

pretreatment asam yang dilanjutkan dengan likuifikasi dengan A. niger dengan

seeding ratio 8/40 (v/v) dan tanpa proses sakarifikasi. Kadar glukosa yang terukur

sebesar 8414,7287 mg/L.

2. Kadar etanol tertinggi yang terukur pada kromatografi gas diperoleh pada sampel C3.

Tepung eceng gondok yang dipretreatment pemanasan, kemudian dilikuifikasi

dengan A. niger dengan seeding ratio 8/40 (v/v) dan dilanjutkan dengan sakarifikasi

kemudian difermentasi dengan S. cerevisiae. Kadar etanol tertinggi sebesar 0,27%

dari fermentasi selama 3 hari.

DAFTAR PUSTAKA

1. http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/16966/4/Chapter%20II.pdf

Diakses pada tanggal 23 Februari 2013. Makassar

2. http://sejarah.kompasiana.com/2011/07/19/sejarah-tuak-nira

Diakses pada tanggal 23 Februari 2013. Makassar