International Research Conference on Food,Nutrition, and Cancer

Jay Whelan3 dan Michael F. McEntee * Departemen Gizi dan Stasiun Percobaan Pertanian Tennessee dan * Departemen Pathobiology, College of Veterinary Medicine, University of Tenness

ABSTRAK

Kanker adalah penyebab kedua kematian di Amerika Serikat, dan kematian akibat kolorektal Kanker hanya dilampaui oleh kanker paru-paru. Studi epidemiologis menunjukkan bahwa lemak tak jenuh ganda diet dapat memiliki efek mendalam pada risiko kanker kolorektal. Data percobaan menunjukkan bahwa modulasi seluler (n-6) Metabolisme PUFA dapat mempengaruhi perkembangan penyakit. Makalah ini membahas peran (n-6) PUFA bermain di mempromosikan tumorigenesis usus dan bagaimana diet PUFA dari keluarga yang berbeda berinteraksi untuk memodifikasi neoplastik yang Proses. Diet PUFA yang menipiskan metabolisme asam arakidonat [seperti (n-3) PUFA] memiliki antineoplastik properti, sedangkan mereka yang meningkatkan metabolisme asam arakidonat, seperti linoleat, -linolenic, dan arakhidonat asam tidak muncul untuk meningkatkan tumorigenesis ketika ditambahkan ke diet Barat tapi mungkin mengurangi menguntungkan Efek dari diet lemak lainnya. Ini adalah kontribusi relatif dari PUFA makanan yang berbeda yang dapat menentukan keseluruhan risiko dan perkembangan penyakit. J. Nutr. 134: 3421S-3426S 2004.

Kanker kolorektal adalah penyebab utama kedua kanker kematian di Amerika Serikat ( 1 ) . Risiko kanker kolorektal bervariasi dari satu negara ke negara , dan faktor lingkungan seperti asupan lemak makanan berkaitan dengan statistik kematian ( 2,3 ) . Studi sebelumnya difokuskan pada hubungan antara risiko dan jumlah lemak dan asam lemak jenuh dalam makanan , tetapi baru-baru ini asam lemak tak jenuh tinggi diet ( HUFA , khususnya, yang berasal dari minyak ikan ) 4 telah mendapat perhatian ( 4 ) . Namun, sedikit perhatian telah difokuskan pada HUFAs dari ( n - 6 ) keluarga . Secara khusus , tulisan ini mengeksplorasi ( n - 6 ) HUFA asam arakidonat baik sebagai konstituen diet dan sebagai perantara metabolisme dalam tumorigenesis usus . PUFA adalah istilah yang luas untuk asam lemak dengan dua atau lebih ikatan ganda , dan HUFAs adalah bagian dari PUFA dengan empat atau ikatan yang lebih ganda . Ada dua keluarga utama diet PUFA , (n - 6 ) dan ( n - 3 ) keluarga . (N - 6 ) PUFA adalah berasal dari induk senyawa asam linoleat [ LA ; 18 : 2 ( n- 6 ) ] . Mereka asam lemak yang mengandung setidaknya dua ikatan rangkap di mana ikatan ganda pertama adalah 6 karbon dari ujung metil molekul . Setelah konsumsi , LA dapat teroksidasi, disimpan dalam triacylglycerides , dimasukkan ke dalam membran fosfolipid , atau memanjang dan desaturated lebih tak jenuh asam lemak ( Gambar . 1 ) . Selama proses terakhir ini , LA pertama diubah menjadi asam -linolenic [ GLA ; 18 : 3 ( n - 6 ) ] melalui -6 desaturase , enzim tingkat - pembatas dalam jalur metabolisme ini , dan kemudian dengan cepat memanjang untuk dihomo- asam –linolenic [ DGLA ; 20 : 3 ( n - 6 ) ] dengan penambahan 2 karbon . DGLA adalah selanjutnya desaturated asam arakidonat [ AA

; 20 : 4 ( n - 6 ) ] melalui -5 desaturase . AA ini bisa dibilang yang paling penting sel – sinyal PUFA terkait dengan membran fosfolipid . Telah dilaporkan bahwa LA asupan 2,5 % energy melakukan tidak mengakibatkan peningkatan yang cukup dari AA di neutrofil manusia fosfolipid ( 5 ) ; dengan demikian , di bawah intake khas ( 5-6 % dari energi ) , konversi lebih lanjut dari LA ke AA tampaknya menjadi minimal . LA adalah PUFA yang paling melimpah dalam diet Barat, dengan intake median dari 12 dan 17 g / d bagi perempuan dan laki-laki , masing-masing ( 6 ) . Sumber makanan utama termasuk sayuran ; sayuran minyak ; dan produk hewani , khususnya , telur dan daging . itu Tingkat GLA dalam diet rendah dan ditemukan terutama di khusus minyak seperti minyak borage dan minyak evening primrose . AA ditemukan secara eksklusif di produk hewani , yaitu daging dan telur , dengan asupan harian 170 mg / d ; Namun , akurasi ini Jumlah dipertanyakan karena tidak dapat diandalkan makanan database komposisi untuk HUFAs ( mereka PUFA yang mengandung 4 atau lebih ikatan ganda ) ( 7 ) . (N - 3 ) PUFA memiliki setidaknya tiga ikatan ganda , di mana ikatan ganda pertama adalah 3 karbon dari ujung metil dari molekul ; Asam -linolenic [ ALA ; 18 : 3 ( n - 3 ) ] adalah orang tua senyawa untuk ( n - 3 ) keluarga PUFA . ALA diubah menjadi Asam stearidonic [ SDA ; 18 : 4 ( n - 3 ) ] melalui -6 desaturase dan selanjutnya memanjang dan desaturated untuk eicosapentaenoic asam [ EPA ; 20 : 5 ( n - 3 ) ] . Ketika SDA dikonsumsi , maka dengan cepat dikonversi ke EPA , karena memasuki jalur metabolism setelah langkah tingkat-membatasi dikendalikan oleh -6 desaturase ( 8,9 ) . Melalui serangkaian elongases , tindakan -6 desaturase , dan -oxidation peroxisomal , EPA dikonversi menjadi docosahexaenoic asam [ DHA ; 22 : 6 ( n - 3 ) ] . Asupan harian rata-rata untuk ALA diperkirakan 1.1 dan , 1,6 g / d bagi perempuan dan laki-laki masing-masing ( 6 ) , dan besar sumber makanan adalah minyak nabati , yaitu , canola dan minyak kedelai . Model ini memiliki mutasi germ -line di supresor tumor gen APC ( 15 ) . Hewan-hewan yang heterozigot untuk mutasi , dan hilangnya spontan hasil heterozigositas dalam formasi tumor di seluruh usus besar dan kecil . paling kanker kolorektal manusia terjadi secara spontan ( yaitu , sporadic kanker ) , dan , di sebagian besar , mutasi pada APC adalah salah satu sebelumnya peristiwa terkait dengan proses. Sebuah jumlah yang relatif kecil individu cenderung untuk penyakit sebagai akibat dari germ -line mutasi pada satu alel . Orang-orang ini , keluarga pasien poliposis adenomatosa , mengembangkan ratusan hingga ribuan tumor di seluruh saluran usus setelah hilangnya alel wild type . Tikus Min rekapitulasi kondisi manusia ini dan dianggap sebagai model yang baik untuk mempelajari efek diet pada neoplasia usus . Semua studi yang dibahas dalam makalah ini dilakukan dengan diet yang mengandung LA pada dosis – manusia yang setara berdasarkan persentase energi untuk lebih meniru pola asupan manusia . Ketika asam lemak individu diperkenalkan ke dalam eksperimental diet , mereka melakukannya dengan mengorbankan asam oleat , karena asam oleat adalah netral untuk semua titik akhir yang menarik ; Oleh karena itu jika ada perubahan terjadi , mereka hanya bisa dikaitkan asam lemak yang diganti . Selain itu, substitusi langsung keseimbangan energi dipertahankan dalam semua diet . Hubungan antara metabolisme AA dan kanker kolorektal Pada tahun 1991 , Thun ( 16 ) melaporkan bahwa risiko kolorektal kanker berkurang sebanyak 50 % pada orang yang mengambil yang nonsteroidal obat anti -inflamasi ( NSAID ) aspirin secara teratur . Penelitian selanjutnya menunjukkan efek yang sama dengan berbagai NSAID . Link umum di antara penelitian ini adalah fakta bahwa NSAID menghambat metabolisme AA dan prostaglandin ( PG ) formasi . Setelah merilis AA dari membran fosfolipid oleh berbagai phospholipases , dapat enzimatis teroksidasi menjadi PGG2 dan PGH2 , senyawa induk dari prostaglandin , oleh siklooksigenase ( COX ) . Pembentukan PGH2 adalah langkah berkomitmen dalam jalur biosintesis . Ada dua isoform COX , COX - 1 dan COX - 2 . COX -1 konstitutif diekspresikan

pada rendah Tingkat SDA dalam diet rendah , dan SDA ditemukan terutama dalam minyak ikan dan beberapa minyak khusus seperti echium ( 10 ) dan hitam saat ini ( 11,12 ) minyak . EPA dan DHA umumnya disebut sebagai minyak ikan ( n - 3 ) PUFA . Asupan khas untuk Kombinasi asam lemak ini diperkirakan 200 mg / d , tapi sekali lagi , ada ketidakpastian di nomor ini , dan itu tidak memperhitungkan jumlah asam docosapentaenoic [ 22 : 5 ( n - 3 ) ] dalam diet ( 7 ) . Seperti yang diamati dengan konversi LA untuk AA , ALA tampaknya kurang dikonversi ke DHA saat ALA intake meningkat di atas level saat ini ( 13,14 ) . (N - 3 ) dan ( n - 6 ) asam lemak tidak metabolik interconvertable tetapi berbagi enzim yang sama ketika memanjang dan desaturated . Dengan demikian , konsumsi satu keluarga Asam lemak dapat melemahkan metabolisme lainnya . Sehubungan Dengan Itu, persaingan antara dua keluarga asam lemak membantu untuk mendefinisikan hubungan mereka dengan kanker , termasuk kolorektal kanker . Model murine untuk tumorigenesis usus Untuk menyelidiki tumorigenesis usus , kami melakukan Sejumlah penelitian menggunakan / ( Min ) model tikus ApcMin .

KOMPOSISI

tingkat di sebagian besar jaringan dan diduga memiliki rumah tangga seluler fungsi. COX-2 tidak biasanya dinyatakan dalam kebanyakan jaringan-jaringan (dengan beberapa pengecualian) dan dianggap sebagai Bentuk diinduksi enzim. Ekspresi diregulasi di leukosit, fibroblas, dan sel sel epitel dalam menanggapi sitokin, faktor pertumbuhan, mitogens, dan promotor tumor. COX-2 telah terdeteksi di hampir semua kanker, dan yang Ekspresi adalah variabel dan tergantung pada tahap neoplasia (17). Induksi COX-2 tampaknya penting dalam menjaga integritas tumor, mempromosikan angiogenesis, dan berkontribusi terhadap proses metastatik (18 -22). AA adalah substrat preferensial untuk PG biosintesis. dua PG khususnya telah dikaitkan dengan kanker kolorektal, PGE2 dan PGI2. Ekspresi COX-2 di nonneoplastic stroma (makrofag dan fibroblas) adenoma jinak dan ganas epitel karsinoma dikaitkan dengan mengemudi produksi kelebihan PG. Ketika PG diproduksi, mereka bertindak lokal pada reseptor permukaan sel dalam parakrin atau autokrin cara untuk menengahi efek patologis mereka (19). menengahi PGE2 tumorigenesis melalui 4 G-protein coupled receptors (EP 1-4) yang memodifikasi kalsium intraseluler atau cAMP (23). Sitoplasma fluks baik cAMP atau kalsium dapat memiliki luas hilir efek pada neoplasia kolorektal; Namun, tepat molekul Mekanisme belum diklarifikasi. PGI2 muncul untuk menengahi Efek protumorigenic nya melalui aktivasi peroxisomal proliferator-diaktifkan reseptor (24), yang diregulasi di tumor kolorektal, mempromosikan tumorigenesis dan menghambat apoptosis (24 -26). Oleh karena itu, proses neoplastik melibatkan COX-2 metabolit dan terintegrasi sinyal antara stroma, tumor sel epitel, dan endotelium pembuluh darah (18,22). Tingkat AA di jaringan dan konversi kepada prostaglandin adalah dipengaruhi oleh jenis dan tingkat lemak makanan; namun demikian, membangun definitif hubungan antara diet teleologis, AA kaskade, dan kanker kolorektal telah samar-samar in vivo. Hal ini penting karena diet PUFA,

seperti yang dari minyak ikan, dapat menurunkan jalur ini mirip dengan NSAID (misalnya, penghambatan biosintesis PG), tapi tidak seperti NSAID, beberapa diet PUFA (yaitu, AA) dapat juga meningkatkan (n-6) metabolisme dan pembentukan PG. Oleh karena itu, berdasarkan studi epidemiologi pada manusia dan pekerjaan kami sebelumnya dengan NSAID di Min tikus (27 29), kami menjelajahi hubungan AA dengan usus tumorigenesis sebagai konstituen makanan dan metabolisme menengah dalam proses penyakit.

(n-6) PUFA dan tumorigenesis usus

Serangkaian studi dirancang dimana kaskade AA terhambat dan ditingkatkan di beberapa titik untuk membangun hubungan langsung dengan jalur metabolisme ini dan usus neoplasia (Gbr. 2). The biosintesis jalur AA dikendalikan by -6 desaturase. Penghambatan selektif -6 Desaturase dengan SC26196 berkurangnya jumlah tumor dengan 40%, tetapi ini Hasil terbalik ketika penghambatan itu dilewati dengan penambahan seiring AA makanan (30). hasil ini menunjukkan bahwa jalur biosintesis untuk AA dari prekursor yang penting dalam mendukung tumorigenesis. Demikian pula, menghambat konversi AA ke PG dengan berbagai NSAID mengurangi jumlah tumor sebanyak 95% (27,29), dan melewati hambatan dengan analog stabil PGE2 dilemahkan tanggapan ini (23). Selain itu, ada pengurangan 35% jumlah tumor pada tikus Min (dengan yang sudah ada sebelumnya tumor) setelah 4 d pengobatan dengan monoklonal yang antibodi terhadap PGE2 (23). Secara kolektif, data ini menunjukkan yang menghambat setiap langkah dalam metabolisme AA, dari LA melalui prostaglandin, memiliki efek merusak pada tumorigenesis- usus

melewati hambatan ini menyelamatkan tumor. Itu Efek dari AA tampaknya menampakkan diri, setidaknya sebagian, melalui biosintesis PG. Menambah (n-6) PUFA metabolisme di atas tingkat kontrol tidak memiliki efek tambahan pada proses neoplastik. ketika Min tikus ditempatkan pada diet yang mengandung GLA atau AA, diet gagal untuk secara signifikan mengubah nomor tumor, meskipun meningkatkan AA dan PG tingkat di atas nilai-nilai kontrol (Gambar. 3) (8,30,31). Data ini menunjukkan bahwa AA dan metabolismenya yang positif terkait dengan neoplasia usus, tetapi meningkatkan jalur ini memiliki ada efek tambahan di luar yang diamati dengan diet yang mengandung hanya LA. Oleh karena itu, LA pada dosis manusia setara tampaknya akan cukup diubah menjadi AA untuk memperoleh biologis maksimum respon.

Diet PUFA, metabolisme AA, dan neoplasia usus

Penelitian dengan inhibitor selektif (n-6) PUFA metabolisme, ditambah dengan percobaan bypass, memiliki penting implikasi diet. Sebagai contoh, studi kami sebelumnya menunjukkan bahwa pelemahan (n-6) metabolisme PUFA berkurang tumorigenesis, namun menambah (n-6) PUFA metabolisme dengan GLA dan AA gagal mengubah nomor tumor di atas kontrol tingkat, meskipun metabolisme AA ditingkatkan. Akan Tetapi, Adapun studi inhibitor, (n-6) PUFA metabolisme dapat dilemahkan dengan diet (n-3) HUFAs. Ketika tikus Min adalah makan diet yang mengandung (n-3) HUFAs (yaitu, EPA), nomor tumor dan tingkat jaringan AA dan PG berkurang sebanyak 50% (8); ketika AA itu bersamaan ditambahkan ke EPAcontaining diet, jumlah tumor tidak berubah dari kontrol tingkat, meskipun kehadiran EPA. Hasil ini mungkin karena fakta bahwa penambahan AA untuk diet EPA mengandung normalisasi konten AA jaringan dan tingkat PG (Gbr. 4) (31). Data ini menunjukkan bahwa diet (n-3) HUFAs memiliki menguntungkan Efek selama AA tidak hadir dalam makanan, Kondisi yang hanya ada dalam diet vegan ketat (individu yang tidak mengkonsumsi daging, ikan, atau telur). Apakah semua makanan (n-6) PUFA yang sama? AA dan metabolismenya penting dalam tumorigenic Proses pada manusia, namun masih belum jelas apakah diet LA, pada intake saat ini, merupakan faktor penting karena berikut Data. Diet AS sudah berisi LA pada 15 g / d (atau 5% energi). LA ditemukan di hampir semua makanan pokok dari diet yang mengandung lemak: daging, susu, telur, ikan, sayuran, makanan minyak, dll Dengan demikian, itu adalah nutrisi penting penting dalam semua kelompok-vegan biasanya sehat diet, vegetarian lacto-ovo, dan omnivora. Dengan demikian, akan sulit untuk menghindari atau secara dramatis mengurangi asupan LA. Meski begitu, konversi LA AA pada manusia tidak boleh mengubah tingkat AA jaringan pada diet tingkat di atas 2,5% dari energi (5); Oleh karena itu perubahan moderat ditingkat saat LA konsumsi tidak akan diharapkan untuk memodifikasi

tingkat AA atau metabolismenya (5). AA diet dan (n-3) HUFAs, bagaimanapun, memiliki mendalam efek pada AA jaringan dan metabolismenya (32,33), di mana menambahkan (n-3) HUFAs untuk diet akan memiliki efek lebih besar pada AA metabolisme daripada yang mengurangi LA intake. semua omnivora diet mengandung AA dan (n-3) HUFAs, karena mereka ditemukan, ke berbagai derajat, dalam semua daging (termasuk ikan) dan telur (Tabel 1). Meskipun asupan harian rata-rata AA dan (n-3) HUFAs kira-kira sama, sebuah ketimpangan masih ini karena, tidak seperti LA, meningkatkan tingkat diet AA memiliki efek mendalam pada konten AA jaringan, dan (n-3) HUFAs tidak sangat efektif dalam mencegah penggabungan. Untuk Misalnya, ketika individu diberikan diet yang mengandung kedua AA dan (n-3) HUFAs, jaringan yang diperkaya dengan AA, meskipun kehadiran (n-3) HUFAs (Tabel 2), dan perubahan ini disertai dengan pembesaran metabolisme AA (33). Selain itu, rasio AA ke (n-3) HUFAs diperlukan untuk Efek netral tidak diketahui. Namun demikian, dalam isolasi, meningkatkan konsumsi (n-3) HUFAs akan hasil yang lebih mungkin pengurangan lebih besar AA dan metabolisme dari akan mencoba untuk mengurangi asupan LA (34). Menetapkan tingkat diet (n-3) HUFAs yang memiliki hasil predicable mungkin harus hati-hati seimbang terhadap tingkat AA dalam makanan.

Ringkasan dan kesimpulan

Singkatnya, AA diet poten memperkaya fosfolipid Konten AA di hampir setiap jaringan (35), dan tingkat ini berkorelasi positif dengan jumlah tumor (P 0.025). jaringan Tingkat AA juga berkorelasi positif dengan tingkat PG, dan Tingkat PG berkorelasi positif dengan jumlah tumor (Tabel 3) (8,31). Jika AA penting dalam proses tumorigenic di manusia, masih belum jelas apakah memodifikasi tingkat LA diet memiliki efek pada titik akhir AA-driven. Dalam model kami, menambahkan GLA dan AA untuk diet sudah cukup disediakan dengan LA tidak memiliki efek tambahan pada tumorigenesis (4), menunjukkan bahwa ambang ada untuk efek tumorigenic AA. Hal ini dapat terlihat bila konten AA fosfolipid usus berkorelasi dengan jumlah rata-rata tumor di Min tikus yang diberi diet yang mengandung PUFA yang berbeda (Gambar. 5). Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menggambarkan perbedaan antara makanan (n-6) PUFA (yaitu, AA vs LA) sehubungan potensi tumorigenic mereka dan kemampuan mereka untuk memusuhi menguntungkan PUFA, seperti dari minyak ikan.

LITERATURE cited

1. Hoyert, DL, Arias, E., Smith, BL, Murphy, SL & Kochanek, KD (2001) Deaths: Final Data for 1999. Natl. Vital Stat. Rep. 49: 1-113.2. Parkin, DM & Muir, CS (1992) Cancer incidence in five continents. Comparability and quality of the data. IARC Sci. Publ. 120: 45-173.3. Carroll, K. K. (1991) Nutrition and Cancer. In: Nutrition, Toxicity and Cancer (Roland, I. R., ed.), Pp. 439-453. CRC Press, Boca Raton, FL.4. Larsson, SC, Kumlin, M., Ingelman-Sundberg, M. & Wolk, A. (2004) Dietary long-chain n-3 fatty acids for the prevention of cancer: a review of potential mechanisms. Am. J. Clin. Nutr. 79: 935-945.5. James, MJ, Gibson, RA, D'Angelo, M., Neumann, MA & Cleland, LG (1993) Simple

relationships exist between dietary linoleate and the n-6 fatty acids of human neutrophils and plasma. Am. J. Clin. Nutr. 58: 497-500.6. Food and Nutrition Board, Institute of Medicine (2002) Dietary Reference Intakes: Energy, Carbohydrate, Fiber, Fat, Fatty Acids, Cholesterol, Protein, and Amino Acids, Parts 1 and 2. The National Academies Press, Washington, DC.7. Taber, L., Chiu, CH & Whelan, J. (1998) Assessment of the arachidonic acid content in foods commonly consumed in the American diet. Lipids 33: 1151-1157.8. Petrik, MB, McEntee, MF, Johnson, BT, Obukowicz, MG & Whelan, J. (2000) Highly unsaturated (n-3) fatty acids, but not alpha-linolenic acid, conjugated linoleic or gamma-linolenic acids, reduce tumorigenesis in Apc- (Min /) Mice. J. Nutr. 130: 2434-2443.9. James, MJ, Ursin, VM & Cleland, LG (2003) Metabolism of stearidonic acid in human subjects: comparison with the metabolism of other n-3 fatty acids. Am. J. Clin. Nutr. 77: 1140-1145.10. Guil-Guerrero, JL, Gomez-Mercado, F., Rodriguez-Garcia, I., Campra- Madrid, P. & Garcia-Maroto, F. (2001) Occurrence and characterization of oils rich in gamma-linolenic acid (III): the taxonomical value of the fatty acids in Echium (Boraginaceae). Phytochemistry 58: 117-120.11. Del Castillo, ML, Dobson, G., Brennan, R. & Gordon, S. (2004) Fatty acid content and fruit characteristics in black currant (Ribes nigrum L.) genotypes. J. Agric. Food Chem. 52: 948-952.12. Ruiz del Castillo, ML, Dobson, G., Brennan, R. & Gordon, S. (2002) Genotypic variation in fatty acid content of blackcurrant seeds. J. Agric. Food Chem. 50: 332-335.13. Brenna, JT (2002) Efficiency of conversion of alpha-linolenic acid to long chain n-3 fatty acids in man. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 5: 127-132.14. Pawlosky, RJ, Hibbeln, JR, Lin, Y., Goodson, S., Riggs, P., Sebring, N., Brown, G. L. & Salem, N., Jr. (2003) Effects of beef- and fish-based diets on the kinetics of n-3 fatty acid metabolism in human subjects. Am. J. Clin. Nutr. 77: 565-572.15. Moser, AR, Pitot, HC & Dove, WF (1990) A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science 247: 322-324.16. Thun, MJ, Namboodiri, MM & Heath, CW, Jr. (1991) Aspirin use and reduced risk of fatal colon cancer. N. Engl. J. Med. 325: 1593-1596.17. Dannenberg, AJ & Subbaramaiah, K. (2003) Targeting cyclooxygenase- 2 in human neoplasia: rationale and promise. Cancer Cell 4: 431-436.18. Prescott, SM & Fitzpatrick, FA (2000) Cyclooxygenase-2 and carcinogenesis. Biochim. Biophys. Acta 1470: M69-M78.19. Cao, Y. & Prescott, SM (2002) Many actions of cyclooxygenase-2 in cellular dynamics and in cancer. J. Cell. Physiol. 190: 279-286.20. Tsujii, M., Kawano, S., Tsuji, S., Sawaoka, H., Hori, M. & DuBois, RN