Protokol untuk Membagi Suspensi Sel

Larutan dan peralatan yang digunakan harus dalam keadaan steril dan teknik operasi harus dilakukan pada ruang laminar flow. Subkultur sel dilakukan pada saat sel berada pada fase log sebelum seluruh permukaan medium tertutupi oleh sel sehingga tidak menyisakan ruang untuk tumbuh. Saat seluruh permukaan medium tertutupi oleh sel, suspensi sel menggumpal dan medium terlihat keruh ketika labu kultur diaduk. Massa jenis sel maksimal yang direkomendasikan sebelum membagi dengan lini sel; mengacu kepada insert produk spesifik sel atau manual detailnya.

Sel Tumbuh di Tabung Kocok

Berikut ini adalah protokol untuk membagi pertumbuhan sel mamalia di kultur suspensi menggunakan tabung kocok di inkubator kocok.

1. Ketika sel siap untuk dikembangbiakan, keluarkan labu dari inkbator dan ambil sampel dari labu kultur menggunakan pipet steril. Jika sel telah siap sebelum diambil sampelnya, aduk labu agar sel terdistribusi merata di medium.

2. Dari sampel tentukan jumlah total sel dan persen dari sel yang hidup menggunakan Countess ® Automated Cell Counter atau hemacytometer, cell counter, dan TrypanBlue exclusion

3. Hitung volume media yang dibutuhkan untuk ditambahkan untuk mengencerkan kultur sesuai dengan massa jenis pembenihan yang direkomendasikan

4. Menambahkan volume medium pertumbuhan sebelum dipanaskan secara aseptis ke dalam labu kultur. Kultur dapat dibagi ke beberapa labu jika diperlukan

5. Melonggarkan tutup dari labu agar terdapat aliran udara dan kembaliakn labu ke inkubator kocok. Kecepatan pengocokan tergantung dari lini sel.

Untuk meminimalkan akumulasi dari sel debris dan kotoran metabolisme dari produk dalam kultur, suspensi sel disentrifugasi pada 100x g selama 5 sampai 10 menit dan mensuspensi kembali pelet sel di medium baru sekali setiap tiga minggu.

Pertumbuhan Sel di Labu Pemutar (Spinner Flask)

Protokol ini menggambarkan prosedur umum untuk mengembangbiakkan sel mamalia di suspensi pertumbuhan menggunakan labu pemutar. Pastikan impeller berotasi dengan bebas dan jangan sampai dinding vessel atau base terkena kontak. Bagian atas dari dayung impeller harus sedikit di atas media untuk memastikan aerasi cukup untuk mengkultur. Sesuaikan mekanisme pemintal sehingga dayung membersihkan sisi dan bagian bawah vessel. Tabel di bawah merupakan daftar dari volume minimum media yang dibutuhkan untuk ukuran botol pemintal yang berbeda.

Tidak direkomendasikan menginisiasikan kultur putar ke dalam labu putar lebih besar dari 500 mL. Direkomendasikan untuk melakukan scale up dari pemutar kecil yang sudah disiapkan.

1. Ketika sel siap untuk dikembanbiakan keluarkan labu dari inkbator dan ambil sampel dari labu kultur menggunakan pipet steril. Jika sel telah siap sebelum diambil sampelnya, aduk labu agar sel terdistribusi merata di medium.

2. Dari sampel tentukan jumlah total sel dan persen dari sel yang hidup menggunakan Countess ® Automated Cell Counter atau hemacytometer, cell counter, dan TrypanBlue exclusion

3. Hitung volume media yang dibutuhkan untuk ditambahkan untuk mengencerkan kultur sesuai dengan massa jenis pembenihan yang direkomendasikan

4. Menambahkan volume medium pertumbuhan sebelum dipanaskan secara aseptis ke dalam labu kultur. Kultur dapat dibagi ke beberapa labu jika diperlukan.

5. Melonggarkan tutup dari labu agar terdapat aliran udara dan kembaliakn labu ke inkubator kocok. Kecepatan pengocokan tergantung dari lini sel dan tipe dari impeller. Pastikan kecepatan pemutar dijaga sesuai dengan nilai yang direkomendasikan untuk mencegah kerusakan pada sel dari shear stress.

Catatan: Untuk meminimalisasikan akumulasi sel debris dan kotoran metabolisme dari produk dalam kultur pemutar, sentrifugasi sel suspensi di 100 x g untuk 5-10 menit,dan mensuspensi kembali pelet sel di medium baru sekali setiap tiga minggu.

Catatan Dalam Mensubkultur Suspensi Sel Serangga

Meskipun prosedur umum untuk mensubkultur sel serangga mengikuti langkah-langkah yang sama dengan sel mamalia akan tetapi hal-hal yang dibutuhkan untuk sistem kultur sel ini berbeda. Berikut adalah langkah-langkah untuk mensubkultur sel serangga.

1. Subkultur reguler membutuhkan pemisahan suspensi sel dan penambahan medium yang cukup untuk mengencerkan kultur ke massa jenis yang sesuai. Menambahkan medium yang baru cukup untuk menambah nutrisi sel.

2. Pertukaran CO2 tidak direkomendasikan untuk kultur sel serangga.3. Jaga sel serangga pada suhu 27oC di lingkungan yang tidak lembab. 4. Menggunakan media yang spesifikan memformulasikan pertumbuhan sel serangga5. Menggunakan surfaktan untuk mengurangi tegangan. 0.1% Pluronic ® F-68

direkomendasikan untuk pengocok kultur serangga. Pluronic ® F-68 (BASF) adalah surfaktan yang menurunkan pemotongan membran sel karena gaya dari impeller.Catatan: Sf-900 II SFM dan Express Five ® SFM sudah mengandung surfaktan.

6. Sel lini serangga tertentu dapat membutuhkan adapatasi untuk kultur suspensi. Untuk informasi lebih lanjut, mengacu pada insert produk sel lini spesifik atau manual.