kultur sekunder.pptx

7/22/2019 KULTUR SEKUNDER.pptx

1/17

SUBKULTUR


2/17

PENDAHULUAN

Setelah melakukan kultur primer, apabila sel telahmencapai confluency(tumbuh dan menyebar memenuhipermukaan substrat), maka harus dilakukan sub-kulturdan menghasilkan kultur sekunder

Bagaimana bila tidak disubkultur? Kemampuan mitotik sel menurun

Sel akan mati

Kultur sekunder dipantau pertumbuhan dan diperbaharuimedianya, apanila diperlukan dapat dilakukan subkulturkembali sehingga diperoleh kultur tersier danseterusnya.

Waktu antar subkultur bervariasi tergantung pada lajupertumbuhan dan tipe sel


3/17


4/17

SUBKULTUR SEL DARI MONOLAYER

Tahapan kerja

Pelepasan sel dari substratnya

Pembagian dan penanaman kembali

Pemeliharaan kultur

Prosedur kerja tambahan

Pembekuan sel monolayer

Thawing dan rekaveri sel Perhitungan jumlah sel

Persiapan sel untuk transportasi


5/17

Passaging atau sub-culture

Cell dissociated from flask

Split 1 in 2


6/17

Prosedur subkultur

Bahan dan alat:

Sel dari kultur primer

Medium HBSS tanpa Ca2+

dan Mg2+ ,

37C Larutan tripsin/EDTA, 37C

Medium kultur lengkap (dengan suplemen), 37C

Pipet pasteur steril

Waterbath atau baki pemanas, 37C Cawan kultur steril (dari plastik maupun kaca)


7/17

Prosedur subkultur

Cara kerja

1. Ambillah medium dari kultur primer menggunakan pipetsteril.

2. Bilaslah sel monolayer menggunakan medium HBBStanpa Ca2+ dan Mg2+ untuk menghilangkan sisa FBS yangdapat menghambat aktivitas tripsin.

3. Tambahkan larutan tripsin/EDTA 37C hingga menutupi

seluruh sel monolayer.4. Letakkan cawan kultur di atas baki pemanas selama 1-2

menit; ketukkan dasar cawan kultur ke atas meja agar sel-sel monolayer terlepas dari substrat.


8/17

Prosedur subkultur

5. Amati sel di bawah mikroskop (lebih baik menggunakaninverted microscope) untuk memastikan bahwa sel telahterlepas dari substratnya.

Apabila sel belum terlepas dari substrat, letakkan kembali cawan

kultur di atas baki pemanas6. Tambahkan 2 mL medium kultur lengkap, bilaslah sel

monolayer dengan memipet suspensi sel beberapa kali. Segera tambahkan medium kultur lengkap setelah sel terlepas

dari substrat untuk menghindari over digest oleh tripsin.

7. Pindahkan suspensi sel ke cawan kultur steril berisimedium kultur lengkap hingga kepadatan ~5x104 sel/mL;cantumkan tanggal dilakukannya subkultur dan tingkatsubkultur (subkultur ke berapa?)


9/17

Prosedur subkultur8. Inkubasi sel pada temperatur 37C, CO2 5% dan

kelembaban optimum.

9. Apabila diperlukan dapat dilakukan penggantianmedium setelah 3-4 hari.

10. Apabila kultur sekunder telah mencapai confluency,dapat dilakukan subkultur kembali dengan

mengulang langkah kerja 1-8.


10/17

SUBKULTUR SEL DARI SISTEM SUSPENSI

Tahapan subkultur dari sistem suspensi sedikit lebih mudahdari sistem monolayer; karena sel sudah berada dalamsuspensi sehingga tidak memerlukan proses enzimatik.

1. Sel harus diberi nutrisi setiap 2-3 hari sekali hingga

mencapai confluency(ditandai dengan medium yangtampak lebih turbid).

Keluarkan botol kultur dari inkubator, biarkan sel-selnya mengendap.

Ambillah 1/3 medium secara aseptis dan gantidengan medium segar yang telah diekuilibrasi.Usahakan agar kepadatan sel 106sel/mL.

Resuspensi sel dan inkubasi kembali


11/17

SUBKULTUR SEL DARI SISTEM SUSPENSI

2. Pada saat tidak dilakukan penambahan medium, periksakondisi sel dengan mengagitasi botol kultur secara halusuntuk meresuspensi sel. Amati perubahan warnamedium.

3. Apabila sel telah mencapai confluency(kepadatan ~2,5 x106sel/mL, lakukanlah sub kultur.

keluarkan botol kultur dari inkubator dan suspensikan sel.

Secara aseptis ambillah setengah dari suspensi sel dan masukkan

ke dalam botol kultur baru.

Tambahkan 7-10mL medium segar yang telah diekuilibrasikedalam masing-masing botol kultur dan masukkan botol kulturke dalam inkubator


12/17

PEMBEKUAN SEL MONOLATER (dari sampel manusia)

Bahan dan alat: Kultur monolayer (dalam petri) padafase-log

Medium kultur lengkap

Freezing mediumL medium lengkap ditambah dengan10-15% (v/v) FBS dan 5-10% (v/v) DMSO, 4C

centrifuge

Prosedur kerja

1. Lepaskan sel monolayer menggunakan tripsin2. Pindahkan suspensi sel ke dalam tabung centrifuge steril

dan tambahkan 2 mL medium kultur lengkap, centrifugasiselama 5 menit pada 300-350 xg dalam temperatur ruang


13/17


Prosedur kerja3. Ambil supernatan dan tambahkan 1 mLfreezingmedium

4C, dan resuspensi sel.

4. Tambahkan 4 mLfreezing medium 4C dan homogenkansel kemudian tempatkan di atas es.

5. Hitung jumlah sel menggunakan haemocytometer.Encerkan sel denganfreezing medium hinggakepadatannya mencapai 106-107sel/mL.

6. Masukkan 1 mL suspensi sel ke dalam cryovial dankecangkan tutupnya.

7. Letakkan cryovial dalam freezer -70C selama semalam

kemudian pindahkan ke dalam nitrogen cair


14/17


Prosedur kerja

8. Catatlah identitas sel, tanggal pembekuan dan lokasinyadalam penyimpanan sehingga memudahkan pencarianpada saat dibutuhkan.

Centrifuge

tubes

cryovial

Container nitrogen cair


15/17

Sel-sel yang disimpan beku dan akan digunakan untukpenelitian harus dibawa kembali ke temperatur ruang(thawing) dengan cepat dan dikultur dengan kepadatantinggi untuk memperbesar rekaveri sel.

Pada saat mengeluarkan sel dari nitrogen cair, gunakanakat pelindung dengan baik seperti jas lab, google, dansarung tangan insulator. Jangan sampai anda terpercilnitrogen cair karena akan berefek seperti terbakar.

Ruangan tempat menyimpan kontainer nitrogen cair harusmemiliki ventilasi yang cukup.


16/17

Bahan dan alat:

Larutan ethanol 70%

Medium kultur lengkap

Prosedur kerja:1. Keluarkan vial dari nitrogen cair dan segera letakkan dalam

waterbath 37C sambil diagitasi hingga medium mencair.

Biasanya medium akan mencair dalam waktu


17/17

Prosedur kerja

3. Pindahkan suspensi sel dari step 2 ke dalam tabung centrifuge berisi 2mL medium hangat dengan 20%FBS, centrifugasi selama 10 menitpada 150-200 x g, pada temperatur ruang, kemudian buang

supernatan.4. Bilaslah DMSO dengan medium kultur segar, dan resuspensi dalam

~1mL medium dengan 20%FBS. Tanamkan pada medium kulturlengkap.

5. Amati setelah 24 jam untuk melihat keberhasilan perlekatan sel ke

substrat kultur.

6. Gantilah medium pada hari ke 5 atan 7 dengan medium yangmengandung 20%FBS hingga kultur berhasil tumbuh.

kultur sekunder.pptx

Documents