IMUNOHISTOKIMIA

Imunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur kadar antibodi

atau antigen dalam sediaan jaringan. Nama imunohistokimia diambil dari nama immune yang

menunjukkan bahwa prinsip dasar dalam proses ini adalah penggunaan antibodi dan histo

menunjukkan jaringan secara mikroskopis. Dengan kata lain, imunohistokimia adalah metode

untuk mendeteksi keberadaan antigen spesifik di dalam sel suatu jaringan dengan

menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi (Ab) dan antigen (Ag) pada jaringan hidup.

Pemeriksaan ini membutuhkan jaringan dengan jumlah dan ketebalan yang bervariasi

tergantung dari tujuan pemeriksaan.

Terdapat dua metode dasar imunohistokimia, yaitu:

1. Metode langsung (direct method) merupakan metode pengecatan satu langkah karena

hanya melibatkan satu jenis antibodi, yaitu antibodi yang terlabel, contohnya

antiserum terkonjugasi fluorescein isothiocyanate (FITC) atau rodhamin.

Kelebihan : Sederhana, hasil cepat

Kekurangan : Tidak tampak morfologi latar, perlu antibodi terkonjugasi setiap antigen

yang berbeda. Jarang digunakan di banding metode tidak langsung

Rekomendasi:

Identifikasi immunoglobulin, komplemen, komplek imun pada biopsy ginjal

dan kulit.

Melokalisasi antigen Viral, bakterial, protozoal, dalam smear atau cairan

tubuh.

2. Metode tidak langsung (indirect method) menggunakan dua macam antibodi, yaitu

antibodi primer (tidak berlabel) dan antibodi sekunder (berlabel). Antibodi primer

bertugas mengenali antigen yang diidentifikasi pada jaringan (first layer), sedangkan

antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer (second layer). Antibodi

kedua merupakan anti-antibodi primer. Pelabelan antibodi sekunder diikuti dengan

penambahan substrat berupa kromogen. Kromogen merupakan suatu gugus fungsi

senyawa kimiawi yang dapat membentuk senyawa berwarna bila bereaksi dengan

senyawa tertentu.

Kelebihan: Versatility, dan lebih sensitive dari pada metode langsung.

Kekurangan : Latar tidak tampak, dan harus dengan frozen section

Rekomendasi : Antibodi pada dalam serum (dipakai sebagai antibodi primer: penyakit

auto imun, infeksi bakteri dan parasit).

Interpretasi : Sampel yang telah di proses dengan metode langsung atau tidak

langsung di amati dibawak mikroskop. Jenis mikroskop tergantung perwanaan. Untuk

pewarnaan dengan fluoresen menggunakan mikroskop Fluoresensi

Metode lain dalam imunohistokimia adalah

Metode Peroxidase Anti Peroxidase (PAP) adalah analisis imunohistokimia

menggunakan tiga molekul peroksidase dan dua antibodi yang membentuk

seperti roti sandwich. Teknik ini memanfaatkan afinitas antibodi terhadap

antigen (enzim) untuk membentuk kompleks imun stabil sebagai perlawanan

terhadap proses kimia terkonjugasi. Fitur unik dari prosedur ini adalah larutan

enzim-antibodi dan kompleks imun PAP. Enzim Horseradish Peroksidase,

protein imunogenik, digunakan untuk menyuntik spesies tertentu dan

merespon imun poliklonal yang dihasilkan terhadap enzim.

Metode Avidin-Biotin-Complex (ABC) adalah metode analisis

imunohistokimia menggunakan afinitas terhadap molekul avidin- biotin oleh

tiga enzim peroksidase. Situs pengikatan beberapa biotin dalam molekul

avidin tetravalen bertujuan untuk amplifikasi dan merespon sinyal yang

disampaikan oleh antigen target.

Penggunaan Antibodi

- Antibodi Raising : penyuntikan Ag pada suatu hewan untuk menghasilkan Ab. Sel B

akan menghasilkan Ab spesifik yang bereaksi dengan Ag yang disuntikkan terus

menerus pada hewan tertentu.

Antibodi Polyclonal: antibodi yang sering digunakan untuk deteksi hingga

saat ini. Pada larutan antibodi ini terdapat bermacam-macam molekul antibodi.

Satu molekul antibodi biasanya mengenali satu macam epitope, sehingga

antibodi poliklonal dapat mengenali lebih dari satu macam epitope. Antibodi

poliklonal kurang spesifik apabila digunakan sebagai alat deteksi.

Antibodi Monoclonal: jenis antibodi pengembangan dari antibodi poliklonal.

Larutan antibodi ini hanya mempunyai satu macam molekul antibodi sehingga

hanya dapat mengenali satu macam antigen. Antibodi monoklonal lebih

spesifik apabila digunakan sebagai alat deteksi. Namun terdapat beberapa

kendala teknis dalam penyiapan monoklonal antibodi ini. Laboratorium kultur

sel mamalia untuk pembuatan hibridoma penghasil monoklonal antibodi,

memerlukan peralatan yang rumit dan keterampilan tinggi. Namun masalah

utama pada penyiapan monoklonal antibodi adalah pada saat seleksi sel

hibridoma. Sel hibridoma disiapkan dengan melakukan fusi sel B dari bagian

limpa hewan yang diimunisasi dengan sel kanker. Sementara itu hewan yang

diimunisasi dengan satu macam antigen mampu menghasilkan 6x106 sel B

yang berbeda. Satu macam sel B akan menghasilkan satu macam antinodi.

Pada saat dilakukan fusi sel B, akan didapatkan 6x106 sel hibridoma yang

berbeda. Pada pembuatan monoklonal antibodi, harus diseleksi satu macam

hibridoma dari sejumlah hibridoma tersebut. Hal ini merupakan pekerjaan

yang sullit dan memakan waktu lama. Kesulitan pembuatan monoklonal

antibodi di atas, menimbulan usaha-usaha kembali untuk mendapatkan jenis

antibodi baru yang spesifik dengan cara yang lebih mudah. Harapan

didapatkanya antibodi seperti ini muncul ketika keseluruhan struktur antibodi

(khususnya IgG) telah selesai dipelajari dan ditemukanya teknik PCR.

Antibodi baru yang didapat seringkali sisebut antibodi rekombinan.

- Labeling Antibodi dapat menggunakan:

Flourochromes

Enzime (peroxidase, alkaline phospat) + substrat

Electron scatering

- Aplikasi teknik ini digunakan untuk deteksi:

Deteksi kanker

Diferensial diagnosa

Treatment kanker

Penelitian

Teknik Pembuatan Preparat Histopatologi:

- Pengambilan sampel

Harus segar, jaringan diambil secepat mungkin dari hewan mati

Ukuran jaringan berkisar 1 cm3. Harus segera difiksasi dan harus terfiksasi

sempurna. Apabila jaringan terlalu tebal, jaringan bagian dalam membusuk

karena tidak terfiksasi.

- Merendam jaringan dengan buffered neutral formalin (BNF) 10%

Perendaman ini bertujuan untuk mengawetkan jaringan agar terhindar dari pencernaan

jaringan oleh enzim/otolitis atau bakteri dan untuk melindungi struktur fisik sel.

Bahan yang digunakan adalah larutan buffered neutral formalin (BNF) 10% dengan

pH 6,5-7,5. pH ideal adalah 7,0. Agar terfiksasi sempurna, perbandingan antara

jaringan dan larutan adalah 1:10 dan lama fiksasinya yaitu 2 hari.

- Proses pembuatan preparat:

Memotong jaringan organ: organ diambil dari larutan fiksatif kemudian

ditiriskan pada saringan. Kemudian dilakukan pemotongan dengan scapel

dengan ketebalan 0,3-0,5 mm dan disusun kedalam tissu cassette, kemudian

sejumlah tissu cassette dimasukkan kedalam keranjang khusus.

Proses dehidrasi: keranjang dimasukkan kedalam mesin processor otomatis.

Tahapan waktu dehidrasi adalah:

etanol 70% selama 2 jam

ethanol 80% selama 2 jam

ethanol 90% selama 2 jam

ethanol absolute selama 2 jam

ethanol absolute selama 2 jam

xylol selama 2 jam

xylol selama 2 jam

parafin cair selama 2 jam

parafin cair selama 2 jam

Vakum: penghilanagn udara dari jaringan dengan menggunakan mesin vakum

yang mempunyai tabung untuk menyimpan keranjang yang diisi parafin cair

dengan suhu 59-600C dan divakum selama 30 menit. Keranjang diangkat dan

kemudian tissue cassette dikeluarkan dan disimpan pada temperatur 600C

untuk sementara waktu.

Mencetak blok parafin: cetakan dari bahan stainles steel dipanaskan diatas

bunsen, lalu kedalam setiap cetakan dimasukkan jaringan sambil diatur dan

sedikit ditekan. Tuangkan parafin cair kedalam tempat yang berisi jaringan

sampai jaringan terendam semua. Parafin dibiarkan membeku diatas mesin

pendingin dan blok parafin dilepas dari cetakan dan disimpan di freezer

dengan suhu -200C.

Memotong blok jaringan: Blok parafn yang mengandung jaringan, kemudian

dipotong dengan menggunakan mesin mikrotom (Gambar 3) dengan ketebalan

berkisar 3 – 4 mikrometer. Potongan tersebut diletakkan secara hati-hati di

atas permukaan air dalam waterbath bersuhu 46° C . Pada kesempatan ini

bentuk irisan dirapikan, kemudian diletakkan di atas kaca obyek yang telah

diolesi ewith, yang berfungsi sebagai bahan perekat . Kaca obyek dengan

jaringan di atasnya disusun di dalam rak khusus dan dimasukkan ke dalam

inkubator bersuhu 60°C sampai preparat siap untuk diwamai .

- Pewarnaan preparat: dilakukan dengan metode H & E staining. Pewarnaan metode

ini adalah sebagai berikut.

Hematocilin: Timbang serbuk hematoksilin I gram, potasium aluminium

sulfat sebanyak 50 gram dan sodium iodate ( Na 103 ) sebanyak 0,2 gram

dilarutkan dalam 1 liter akuades menggunakan alat pengaduk (stirer) dengan

sedikit dipanaskan, kemudian disimpan satu malam dalam temperatur ruangan.

Keesokkan harinya larutan tersebut ditambahkan asam sitrat (C6H807)

sebanyak 50 gram dan chloral hydrate (CZH3CL30Z) sebanyak 50 gram.

Larutan dipanaskan dan diaduk selama 5 menit, kemudian didinginkan dan

disaring. Larutan akan stabil selama 1- 2 tahun dalam botol berwama gelap

pada temperatur ruangan.

Eosin: Timbang serbuk eosin Y sebanyak 7,5 gram, erythrosin sebanyak 7,5

gram dan calcium chlorida sebanyak 2,5 gram dilarutkan dalam akuades 1 liter

kemudian disaring . Larutan akan stabil selama 6 - 12 bulan dalam botol gelap

pada temperatur ruangan.

- PROSES PEWARNAAN HEMATOKSILIN DAN EOSIN

Preparat yang akan diwarnai diletakkan pada rak khusus dan dicelupkan secara

berurutan ke dalam larutan dengan waktu sebagai berikut

Xylol 3 menit

Xylol 3 menit

Ethanol absolute 3 menit

Ethanol absolute 3 menit

Ethanol 90% 3 menit

Ethanol 80% 3 menit

Bilas dengan air keran 1 menit

Larutan hematoksilin 6-7 menit

Bilas dengan air keran 1 menit

Larutan pembiru 1 menit

Air keran 1 menit

Larutan eosin 1 - 5 menit

Bilas dengan air keran 1 menit

Ethanol 80 % 10 celupan

Ethanol 90 % 10 celupan

Ethanol absolute 10 celupan

Ethanol absolute 1 menit

Xylol 3 menit

Xylol 3 menit

Xylol 3 menit

Preparat diangkat satu persatu dari larutan xylol dalam keadaan basah, diberi satu

tetes cairan perekat ( DPX ) dan selanjutnya ditutup dengan kaca penutup. Hasil

pewarnaan dapat dilihat di bawah mikroskop.

PROSES PREPARAT HISTOPATOLOGI (referensi lain)

Pengambilan sampel

Pembuatan sediaan dari suatu jaringan dimulai dengan operasi, biopsi, atau autopsi.

Selain itu, Jaringan juga dapat diperoleh dengan jalan usapan atau smear. Jaringan

yang diambil kemudian diproses.

Fiksasi

Merupakan suatu usaha untuk mempertahankan elemen-elemen sel / jaringan agar

tetap pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk dan ukuran. Zat yang

digunakan : fiksatif.

Dehidrasi

Adalah penarikan molekul air dari dalam jaringan. Dilakukan setelah proses fiksasi,

kegagalan / ketidaksempurnaan pada proses ini menyebabkan kegagalan pada langkah

selanjutnya. Sel pada jaringan hidup mengandung air ± 85% , air tidak tercampur

dengan paraffin / seloidin sehingga perlu dehidrasi. Kemikalia yang digunakan:

ethanol, Dioxane, Acetone dsb. Dehidrasi menggunakan alkohol bertingkat mulai

konsentrasi rendah sampai absolut. Proses Dehidrasi digunakan untuk memudahkan

proses infiltrasi parafin ke dalam jaringan menggunakan alkohol dari konsentrasi

rendah-tinggi.

Penjernihan / clearing

Penjernihan / Kemikalia berfungsi membuat jaringan menjadi jernih dan

transparan.

Merupakan perantara antara proses dehidrasi dengan proses penanaman.

Bila memakai alkohol pada dehidrasi perlu dilakukan dealkoholisasi.

Waktu yang dipergunakan tergantung dari: tebal jaringan/besar kecilnya

jaringan, konsentrasi jaringan, macam zat fiksasi yang dipakai, sifat clearing

agent yang dipakai

Embedding

Embedding adalah Proses memasukkan jaringan ke dalam parafin cair untuk dibuat

blok yang padat.

Sectioning / cutting

Sectioning adalah proses pemotongan jaringan dengan mikrotom-ukuran sangat tipis

4-10 µ-tembus cahaya saat diperiksa dengan mikroskop

Mounting : Menempelkan potongan jaringan yg baik ke obyek glass

Staining

Staining merupakan proses Pewarnaan preparat. Macam pewarnaan berdasarkan asal

zat warna :

Natural Dyes.

Acid Carmine : ekstrak serangga betina yang hidup di pohon kaktus di daerah

tropis.

Hematoxyline : getah pohon Haematoxylinecampechianum

Syntetic Dyes

Benzene, Quinone, Anilline.

Prinsip Kerja Pewarnaan adalah secara umum zat warna yang bersifat asam akan

mewarnai bagian sel yang bersifat basa dan sebaliknya cat netral (gugus asam dan

gugus basa keduanya berwarna) Misal :Romanowsky, (Camp methylen Blue & Eosin)

Berdasarkan waktu, proses pewarnaan dibagi menjadi:

Direct Staining, molekul zat warna langsung ditangkap oleh jaringan,

misalnya Eosin

Indirect Staining, molekul zat warna baru bisa ditangkap oleh jaringan jika

menggunakan zat perantara yang disebut Mordant, misalnya Haematoxyline

menggunakan Potasium Alum sebagai mordantnya.

Pemeriksaan mikroskopik

Preparat yang telah melalui serangkaian proses kemudian diamati di bawah

mikroskop dengan pembesaran objektif kecil.

CONTOH ANALISIS SEL DENGAN IHK

Adapun marker untuk diagnosa IHK adalah sebagai berikut:

Carcinoembryonic antigen (CEA): digunakan untuk identifikasi adenocarcinoma.

Cytokeratins: digunakan untuk identifikasi carcinoma tetapi juga dapat terekspresi

dalam beberapa sarkoma.

CD15 and CD30 : digunakan untuk identifikasi Hodgkin's disease

Alpha fetoprotein: untuk tumor yolk sac dan karsinoma hepatoselluler

CD117 (KIT): untuk gastrointestinal stromal tumors (GIST)

CD10 (CALLA): untuk renal cell carcinoma dan acute lymphoblastic leukemia

Prostate specific antigen (PSA): untuk prostate cancer estrogens dan progesterone

staining untuk identifikasi tumor

Identifikasi sel B limfa menggunakan CD20

Identifikasi sel T limfa menggunakan CD  3

Langkah-langkah dalam melakukan imunohistokimia dibagi menjadi dua, yaitu preparasi

sampel dan sampe labelling.

Preparasi sampel adalah persiapan untuk membentuk preparat jaringan dari jaringan

yang masih segar.

Preparasi sample terdiri dari :

pengambilan jaringan yang masih segar,

fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid,

embedding jaringan dengan parafin atau dibekukan pada nitrogen cair,

pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom,

deparafinisasi dan antigen retrieval untuk membebaskan epitop jaringan,

bloking dari protein tidak spesifik lain.

Sampel labeling adalah pemberian bahan-bahan untuk dapat mewarnai preparat.

Sampel labeling terdiri dari :

imunodeteksi menggunakan antibodi primer dan sekunder,

pemberian substrat,

counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya.

Pewarnaan IHK dapat memakai:

Fluorucent 488 dan Fluorucent 594. Biasa dipakai dalam pewarnaan IHK indirect &

direct method.

Multiple inflourocent, dengan menggunakan flourocent untuk menghasilkan

warna yang berbeda pada 2 kutub yang berbeda.

Enzime (Streptavidin Horse Radish Peroksidase/SAHRP) + Fluorucent 488 sebagai

substrat untuk menghasilkan warna.

PAP (Peroksidase Anti-Peroksidase) method menggunakan pewarna dengan

enzim. Prosesnya adalah Ag+Ab1+Ab2+enzim SAHRP.

ABC (Add Avidin/Biotinilated Enzim Complex) method. Prosesnya adalah

Ag+Ab1+Ab2 biotinilasi+avidin.

Rodamin, untuk memberikan waena merah, hijau, dsb.

Pewarna DAB (Di Amino Benzen) untuk mewarna IL-2, IL-6 dsb. Menghasilkan

warna merah.