PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Preparasi Imunoglobulin Yolk

(IgY) Spesifik Rabies untuk Pengembangan Kit Diagnostik adalah benar karya

saya denganarahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk

apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau

dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah

disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir

tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Desember 2016

Suwarny Ruhi

NIM B253140071

RINGKASAN

SUWARNY RUHI. Preparasi Imunoglobulin Yolk (IgY) Spesifik Rabies untuk

Pengembangan Kit Diagnostik. Dibimbing oleh SRI MURTINI dan OKTI

NADIA POETRI.

Rabies adalah penyakit yang disebabkan oleh virus neurotropik genus

Lyssavirus famili Rhabdoviridae dan dapat ditularkan dari hewan ke hewan lain

maupun hewan ke manusia melalui saliva.Penyakit ini bersifat zoonosis dan

berakibat fatal pada manusia, sehingga semua material yang dicurigai terinfeksi

virus rabies harus ditangani dengan memperhatikan aspek keamanan sesuai

dengan spesifikasi World Health Organization(WHO). Diagnosis penyakit rabies

di Indonesia selama ini hanya berdasarkan gejala klinis dan pemeriksaan

histopatologis preparat otak yang berasal dari hewan tersangka.Teknik diagnosa

untuk mendeteksi virus rabies harus terus dikembangkan. Antigen dan antibodi

standar sangat diperlukan untuk diagnosa rabies. Penelitian ini bertujuan untuk

memproduksi antibodi standar terhadap virus rabies yang nantinya dapat di

gunakan sebagai antibodi standar dan membandingkan dua metode purifikasi

imunoglobulin yolk(IgY) spesifik rabies asal kuning telur.

Kegiatan penelitian yang dilakukan meliputi produksi antibodi pada ayam

petelur yang telah divaksinasi menggunakan antigen rabies terinaktivasi,

pengukuran konsentrasi IgY dalam kuning telur, pemurnian IgY dari kuning telur,

pengukuran konsentrasi total protein IgY, karakterisasi antibodi spesifik rabies,

penentuan titer IgY anti rabies menggunakan ELISA. Kuning telur yang diketahui

positif mengandung IgY spesifik rabies dimurnikan menggunakan dua metode

yaitu : 1) pengendapan dengan NaCl; 2) teknik Water Soluble Fraction (WSF),

dilanjutkan pengendapan dengan PEG 6000-amonium sulfat. Titer IgY spesifik di

tentukan dengan uji ELISA dan karakterisasi protein dengan metode SDS-PAGE.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa antibodi anti-rabies dapat dideteksi

pada kuning telur pada minggu kedua setelah vaksinasi pertama. Purifikasi IgY

dengan NaCl menghasilkan konsentrasi 331 µg/ml dan teknik WSF 184 µg/ml.

Karakterisasi protein menggunakan SDS-PAGE menghasilkan pita protein pada

teknik NaCl dengan berat molekul 164,16 kDa, 126,43 kDa, 97,36 kDa, 68,73

kDa, 40,76 kDa, 28,77 kDa dan teknik WSF dengan berat molekul 94,03 kDa,

65,61 kDa, dan 31,94 kDa. Titer antibodi spesifik menggunakan teknik NaCl

lebih besar dari 0,5 EU/ml dan teknik WSF dengan titer antibodi di bawah 0,5

EU/ml . Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa IgY spesifik

rabies dapat diproduksi pada ayam petelur dan menghasilkan antibodi yang

titernya cukup tinggi

Kata kunci:Rabies, immunoglobulin yolk (IgY), kuning telur, ayam petelur

SUMMARY

SUWARNY RUHI. Preparation of Rabies Virus-Specific Yolk Imunoglobulin

(IgY) for The Development of Diagnostic Kits. Supervised by SRI MURTINI and

OKTI NADIA POETRI.

Rabies is a disease caused by neurotropic viruses belong to the genus

Lyssavirus and family Rhabdoviridae and can be transmitted from animal to

animal or animal to human through saliva. Rabies is zoonotic and can be fatal in

humans. All material from suspected animal should be treated in accordance with

World Health Organization (WHO) safety aspect. Currently, diagnosis of rabies in

Indonesia were based on clinical symptoms and histopathological examination of

suspected animal brain. Diagnosis of rabies virus required antigen and antibody

standard. Our study aims to produce rabies specific immunoglobulin yolk (IgY)

and comparing two methods of IgY purification from egg yolks.

Laying hen were vaccinated twice using inactivated rabies antigen

emulsified with adjuvant. The interval between vaccination were four weeks.

Eggs were collected and tested using Enzyme Linked Immunosorbent Assay

(ELISA) to detect the presence of rabies specific IgY in the egg yolk. Egg yolks

known positve for rabies specific IgY was purified using methods: 1) precipitation

by NaCl, PEG 6000-ammonium sulfate; 2) Water Soluble Fraction

(WSF)techniques, followed by precipitation with ammonium sulfate and

polyethilene glycol (PEG) 6000. Rabies specific IgY titers were determined by

ELISA and IgY characterization determined using Sodium Dodecyl Sulfate-

Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE).

Our results showed that rabies specific IgY were detected in egg yolk two

weeks after the first vaccination. Immunoglobulin Y purified with NaCl

presipitation resulting concentration of 331 µg/ml and WSF techniques

resultingconcentration of 184 µg/ml. Immunoglobulin Y purified with NaCl

precipitation produces protein with molecular weight at164.16 kDa, 126.43 kDa,

97.36 kDa, 68.73 kDa, 40.76 kDa, 28.77 kDa, whilst WSF technique produces

protein molecular weight at 94.03 kDa, 65.61 kDa and 31.94 kDa.

Immunoglobulin Y purified with NaCl precipitation has titre greater than 0.5

EU/ml and IgY purified with WSF techniques has titre below 0.5 EU/ml. Our

conclusion would be that the rabies specific IgY can be produced in laying hens

and produce high antibody titers.

Keywords: Rabies, yolk immunoglobulin (IgY), egg yolk, laying hen

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan

atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,

penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau

tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan

IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini

dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains

pada

Program Studi Mikrobiologi Medik

PREPARASI IMUNOGLOBULIN YOLK (IgY) SPESIFIK

RABIES UNTUK PENGEMBANGAN KIT DIAGNOSTIK

SUWARNY RUHI

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof. Dr. Drh. Retno D. Soejoedono,MS

Judul Tesis

: Preparasi Imunoglobulin Yolk (IgY) Spesifik Rabies untuk

Pengembangan Kit Diagnostik

Nama : Suwarny Ruhi

NIM :

B253140071

DisetujuiOleh

Komisi Pembimbing

Dr Drh Sri Murtini, MSi

Ketua

Dr Drh Okti Nadia Poetri, Msi MSc

Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi

Mikrobiologi Medik

Prof Dr Drh Fachriyan H Pasaribu

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian:

(28 Oktober 2016)

Tanggal Lulus:

( )

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas

segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang

dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak Juli 2015 sampai Juni 2016 ini

ialah Preparasi Imunoglobulin Yolk (Igy) Spesifik Rabies Untuk Pengembangan

Kit Diagnostik.

Terima kasih penulis ucapkan kepada IbuDr. Drh. Sri Murtini, M.Si.dan Ibu

Dr. Drh. Okti Nadia Poetri, M.Si, M.Sc. selaku pembimbing, serta Ibu Prof. Dr.

Drh. Retno D. Soejoedono, MS. yang telah banyak memberi saran, arahan dan

semangat kepada penulis selama persiapan dan pelaksanaan penelitian hingga

penyusunan tesis ini.Penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Prof.Dr.Drh.

Fachriyan H. Pasaribudan Dr. Drh. Agustin Indrawati, M. Biomed. selaku Ketua

dan Sekretaris Program Studi Mikrobiologi Medik, Departemen Ilmu Penyakit

Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Institut

Pertanian Bogor. Kepada Prof. Dr. Ir. C. Hanny Wijaya. M.Agr. yang telah

memberikan kesempatan untuk mengikuti dan mempresentasikan karya ilmiah pada

penyelenggaraan The 3rd International Postgraduate Symposium on Food

Agriculture & Biotechnology in ASEAN (IPSFAB2016) yang diselenggarakan di

Universitas Mahasharaskham, Bangkok. Tidak lupa penulis juga mengucapkan

banyak terimakasih kepada panitia penyelenggara penerimaan bantuan beasiswa

tesis/disertasi Lembaga Pengelola Dana Pendidikan (LPDP) 2016 atas bantuan dana

penelitian sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan karya

ilmiah ini.

Kepada Ayahanda Drs. La Ode Ruhi dan Ibunda Asmawati, serta seluruh

keluarga, penulis menyampaikan terimakasih yang sedalam-dalamnya atas segala

doa, dorongan semangat dan kasih sayangnyayang tak pernah berhenti diberikan

kepada penulis. Terimakasih kepada teman-teman MKM 2014, Pondok Harum

dan Forum Wacana Sulawesi Tenggara, semoga silaturahim tetap terjalin.

Terimakasih pula kepada Doddy Ismunandar, S.P, M.P, Setya Indra Padma Putri,

S.Kel, M.Si, Retia Revany, S.Pi, M.Si, Herlina Adelina Meria Uli Sagala, S.Pi,

M.Si dan Bunga Anggraeny, S.I.K, M.Si yang selalu memberikan dorongan dan

membantu penulis dalam penelitian, sehingga penulis dapat menyelesaikan

penelitian dan tesis ini.

Penulis menyadari, bahwa karya ilmiah ini belum sempurna. Oleh karena itu,

dengan rendah hati penulis memohon maaf dan berharap semoga karya kecil ini

dapat bermanfaat.

Bogor, Desember 2016

Suwarny Ruhi

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vii

1 PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Tujuan Penelitian 2

Manfaat Penelitian 2

Ruang Lingkup Penelitian 2

2 TINJAUAN PUSTAKA 2

Penyakit Rabies 2

Imunoglobulin (Ig) 3

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 5

3 METODE 6

Waktu dan Tempat Penelitian 6

Bahan 6

Alat 6

Prosedur 6

4 HASIL DAN PEMBAHASAN 10

Produksi dan Deteksi IgYspesifik rabies dalam Kuning Telur 10

Konsentrasi dan Karakterisasi IgY spesifik rabies hasil pemurnian 12

Titrasi IgY spesifik rabies 14

5 SIMPULAN DAN SARAN 15

Simpulan 15

Saran 15

DAFTAR PUSTAKA 16

RIWAYAT HIDUP 19

DAFTAR TABEL

1 Deteksi dan pengukuran konsentrasi IgY dalam kuning telur 11 2 Berat molekul komponen-komponen protein

dan masing-masingpita penyusunnya 12 3 Titer IgY spesifik rabies 14

DAFTAR GAMBAR

1 Struktur virus rabies 3 2 Struktur imunoglobulin G 4

3 Struktur imunoglobulin Y 5 4 Uji ELISA IgY pada kuning telur 11 5 Profil pita protein IgY spesifik rabies yang telah dipurifikasi 14

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Rabies adalah penyakit yang disebabkan oleh virus neurotropik genus

Lyssavirus famili Rhabdoviridae dan dapat ditularkan dari hewan ke hewan lain

maupun hewan ke manusia melalui saliva. Virus rabies dapat menginfeksi hewan

peliharaan (anjing, kucing, dan primata/kera), hewan ternak (sapi, kambing,

domba, babi, dan kuda) hewan liar (tikus, serigala, musang dan bison) dan

manusia. Rabies merupakan salah satu penyakit zoonosis dan berakibat fatal pada

manusia, sehingga semua material yang dicurigai terinfeksi virus rabies harus

ditangani dengan memperhatikan aspek keamanan sesuai dengan spesifikasi

World Health Organization (WHO 1992). Diagnosis penyakit rabies di

Indonesia selama ini hanya berdasarkan gejala klinis dan pemeriksaan

histopatologis preparat otak yang berasal dari hewan tersangka.

Penyakit rabies bersifat enzootik di beberapa provinsi di Indonesia.

Pengendalian penyakit rabies umumnya dilakukan dengan vaksinasi, sosialisasi,

eliminasi anjing tidak berpemilik/diliarkan, pengawasan lalulintas hewan penular

rabies (HPR). Upaya pemerintah untuk mengendalikan rabies melalui vaksinasi

dan eliminasi anjing tidak berpemilik belum optimal, bahkan di beberapa daerah

tertentu kasus rabies semakin meningkat (Adjid et al, 2005). Kondisi ini

meningkatkan kewaspadaan masyarakat dalam upaya pengendalian penyakit.

Salah satu bentuk kewaspadaan adalah dengan pengembangan teknis diagnosa

laboratorium terhadap rabies yang cepat dan akurat.

Berbagai uji dapat dilakukan untuk diagnosa penyakit rabies. Pengujian

dapat berupa uji deteksi antigen maupun antibodi dengan uji serologis. Beberapa

metode uji serologis yang sering digunakan dalam mendeteksi keberadaan

antibodi terhadap rabies adalah serum netralisasi test (SNT), Rapid Fluorescent

Focus Inhibition Test (RFFIT) dan Fluorescent Antibodi Virus Neutralisation

(FAVN). Pada kedua metode uji, digunakan virus rabies hidup, sehingga dalam

pelaksanaannya memerlukan laboratorium dengan fasilitas biosekuriti level 3

serta staf yang telah terlatih dan telah divaksinasi rabies. Uji Enzym Linked

Immunosorbent Assay (ELISA) juga digunakan untuk mendeteksi antibodi

spesifik rabies. ELISA digunakan untuk mendeteksi antibodi rabies pada serum

hewan (anjing dan kucing) serta pada serum manusia (Meslin & Kaplan 1996).

Teknik diagnosa untuk mendeteksi virus rabies harus terus dikembangkan.

Pengujian untuk diagnosa virus rabies, memerlukan antigen serta antibodi standar.

Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi antibodi standar terhadap virus rabies

pada ayam petelur yang nantinya dapat digunakan dalam pengembangan kit

diagnostik rabies serta membandingkan dua metode purifikasi IgY spesifik rabies

asal kuning telur.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi imunoglobulin yolk (IgY)

spesifik rabies pada ayam petelur serta membandingkan dua metode purifikasi

IgY spesifik rabies asal kuning telur.

2

Manfaat Penelitian

Antibodi yang di peroleh pada penelitian ini, diharapkan dapat digunakan

sebagai antibodi standar dalam pengembangan kit diagnostik rabies.

Ruang Lingkup Penelitian

Pada penelitian ini dilakukan serangkaian kegiatan yaitu produksi antibodi

spesifik rabies pada ayam petelur. Imunoglobulin Ydimurnikan dari kuning

telurmenggunakan dua metode yaitu : 1) pengendapan dengan NaCl; 2) teknik

Water Soluble Fraction (WSF), dilanjutkan pengendapan dengan PEG 6000-

amonium sulfat. Titer IgY spesifik di tentukan dengan uji ELISA dan

karakterisasi protein dengan metode SDS-PAGE.

2 TINJAUAN PUSTAKA

Penyakit Rabies

Penyakit rabies disebabkan oleh virus dari genus Lyssavirus, famili

Rhabdoviridae. Struktur virus rabies berbentuk batang seperti peluru dengan

ukuran panjang rata-rata 180 nm dan lebar 75 nm dengan ukuran spike 10 nm.

Virus rabies (Gambar 1) tersusun dari Ribose Nucleid Acid (RNA) (2-3%), protein

(67-74%), lemak (20-26%) dan karbohidrat (3%) yang menyatu menjadi struktur

utamanya (Wunner 2007). Penyakit rabies atau penyakit anjing gila dikenal juga

dengan nama Lyssa (Inggris), Rage (Perancis), Tolwut (Jerman) dan Hydrophobia,

penyakit ini menyebabkan infeksi viral akut pada susunan saraf pusat, gejala

klinis ditandai dengan kelumpuhan yang progresif dan berakhir dengan kematian.

Penyakit ini menyerang hewan berdarah panas dan manusia. Secara umum, anjing

merupakan penular terpenting kasus rabies pada manusia yang biasanya terjadi

melalui gigitan hewan terinfeksi rabies (WHO 2002).

Gambar 1 Struktur virus rabies

Penularan virus rabies biasanya terjadi dari air liur hewan tertular ke hewan

lain. Beberapa cara penularan yang dilaporkan, meliputi kontaminasi sekresi liur

hewan terinfeksi pada membran mukosa seperti mata, hidung dan mulut, dan

cangkok kornea (Baer 1991). Alves et al. (2003) melaporkan, bahwa virus rabies

3

yang diinokulasikan per oral pada marmut dapat menyebabkan terjadinya infeksi

dan virus terisolasi di berbagai organ, seperti otak, paru-paru dan lambung, namun

tidak ditemukan adanya antibodi yang mampu terinduksi akibat infeksi peroral.

Virus hanya dapat bereplikasi dalam sel–sel hidup karena virus

menggunakan energi dan komponen sel inang untuk mensintesis protein dan asam

nukleat virus yang diperlukan. Virus akan mengalami replikasi di sel otot sampai

dapat memenuhi konsentrasi yang cukup untuk mencapai ujung saraf motoris

terdekat (Lewis et al, 2000). Protein G pada virus berikatan dengan reseptor

nikotinik asetilkolin, neural cell adhesion molecule (NCAM) reseptor, dan p75

neurotrophin reseptor pada neuromuscular junction dan menginfeksi sistem saraf

(Jackson 2007). Virus selanjutnya akan mengalami endositosis dan akan

melepaskan asam inti (RNA) dari amplop dan nukleokapsid di sitoplasma.

Masing-masing RNA ditranskripsi ke mRNA dan kemudian ditranslasi menjadi

protein (Wunner 2007)

Imunoglobulin (Ig)

Imunoglobulin (Ig) merupakan substansi pertama yang diidentifikasi

sebagai molekul dalam serum dengan kemampuan menetralkan sejumlah benda

asing atau mikroorganisme penyebab infeksi. Imunoglobulin dalam serum

manusia terdiri dari 5 bentuk yaitu IgG, IgA, IgM, IgD, dan IgE (Tizard 2004).

Klasifikasi ini berdasarkan atas perbedaan struktur kimia yang mengakibatkan

perubahan terhadap sifat biologik maupun sifat fisika imunoglobulin.

Imunoglobulin G merupakan antibodi yang paling berlimpah dalam

sirkulasi. Imunoglobulin ini dengan mudah melewati pembuluh darah dan

memasuki jaringan. Imunoglobulin G juga menembus blood placenta barrier

sehingga imunoglobulin ini ditransfer dari ibu ke janin. IgG juga berperan serta

dalam melindungi tubuh dari bakteri, virus, dan toksin yang beredar di dalam

pembuluh darah dan limfa, dan memicu kerja sistem komplemen (Campbellet al,

2004).

Berat molekul IgG sekitar 160 kDa dan memiliki dua rantai berat serta dua

rantai ringan yang identik. Dengan mikroskop elektron, ImunoglobulinG terlihat

berupa molekul berbentuk Y dan bagian lengan tersebut yang mampu mengikat

antigen (Gambar 2). Kedua fragmen lengan dari molekul uji identik dan masih

memiliki kemampuan untuk mengikat antigen. Bagian hipervariabel pada rantai

ringan dan rantai berat bersama-sama membentuk suatu tempat pengikatan

antigen tunggal. Kekhususan interaksi antara antigen dan antibodi berdasarkan

susunan asam amino pada bagian hipervariabelnya. Bentuk konformasi dari

tempat pengikatan antigen dengan immunoglobulin itulah yang menentukan

determinan antigen khusus yang akan bereaksi dengan Ig G (Tizard 2004).

Imunoglobulin Y merupakan protein antibodi yang ditemukan pada kuning

telur ayam. Keberadaan IgY pada kuning telur memiliki analogi yang sama

dengan keberadaan IgG pada susu. Pada ayam telah diketahui keberadaan tiga

kelas imunoglobulin yang analog dengan imunoglobulin mamalia yaitu IgA, IgM

dan IgY (IgG). Ayam mentransfer antibodi induk ke dalam kuning telur. Antibodi

induk ditransferkan secara pasif oleh induk kepada anaknya, berfungsi sebagai

sistem pertahanan terhadap substansi asing ketika sistem imun anak belum

sempurna (Carlender 2002).

6

3 METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Unit Pelayanan Terpadu Bagian Mikrobiologi

Medis, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner,

dan Unit Pelayanan Hewan Laboratorium Fakultas Kedokteran Hewan, Institut

Pertanian Bogor. Waktu penelitian dilakukan selama 10 bulan dimulai dari bulan

Juli 2015 sampai Juni 2016.

Bahan

Penelitian ini menggunakan 3 ekor ayam petelur yang berumur 24 minggu.

Vaksin inaktif rabies (Verorab®), phosphat buffer saline(PBS) pH 7,2 dan pH 8,

Na azide 0.1%, poly etylene glycol(PEG) 6000, agarose, amonium sulfat 40%,

akuabides, carbonat bicarbonat buffer pH 9.6, bovine serum albumin(BSA),

alkohol 70%, NaOH, HCl, asam fosfat, comassie blue(Sigma® Chemical Co),

asam asetat glacial, metanol, acrylamide, Tris-HCl pH, NaCl, sodium dodecyl

sulfate (SDS), ammonium perosulfat (APS), tetrametilen diamina (TEMED),

coating buffer, substrat tetramethylbenzidine (TMB), skim milk, horse reddish

peroxydase (HRP), PBS tween (PBST), kit platelia II (Biorad®), marker umum

protein, IgY standar (PROMEGA®).

Alat

Alat yang digunakan adalah tabung reaksi, kaca objek, gelas

ukur,mikrotube, kertas saring, spoit, tabung mikro bersumur 96 (microplate U

bottom 96 wells), pipet mikro, vortex, magnetic stirer (Luchi HSD-4P),

refrigerator (Sanyo), deep freezer -80 (Sanyo Ultralow), inkubator, sentrifus,

spektrofotometer (Hitachi U-20), vertikal elektroforesis, microwave, ELISA

reader,dan kamera digital

Prosedur

Produksi Antibodi

Produksi antibodi terhadap virus rabies menggunakan dua ekor ayam petelur

berumur 24 minggu. Vaksinasi pertama dilakukan dengan menyuntikkan 1 dosis

(0,5 ml) vaksin inaktif rabies yang telah dicampur dengan complete adjuvant

melalui rute intramuskular pada otot dada. Penyuntikan diulang kembali dua

minggu kemudian dengan dosis dan rute yang sama menggunakan vaksin rabies

inaktif yang telah dicampur dengan incomplete adjuvant. Satu ekor ayam petelur

digunakan sebagai ayam kontrol yang tidak divaksin. Telur dikoleksi setiap hari

satu minggu setelah vaksinasi pertama.

Deteksi Keberadaan IgY Spesifik Rabies pada Kuning Telur

Deteksi imunoglobulin yolk dilakukan dengan uji ELISA (Shimizu et al

1988). Preparasi antigen dilakukan dengan memecah vaksin rabies inaktif

7

menggunakan sonikator. Antigen yang telah disonikasi diukur konsentrasi

proteinnya dengan metode Braddford. Antigen kemudian diencerkan 1:50

menggunakan coating buffer (0,05 M carbonate-bicarbonate pH 9,5) sehingga

konsentrasi akhir yang digunakan adalah 5 µg/ml. Antigen yang telah diencerkan

kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing sumur dari mikroplate sebanyak

100 µl/sumur dan diinkubasi pada suhu 4 ºC selama semalam. Plate selanjutnya

dicuci lima kali menggunakan PBS-T (PBS p-H 7,4 + 0,05% Tween-20) sebanyak

300 µl tiap sumur. Masing-masing sumur pada plate uji di-blocking menggunakan

larutan skim milk 5% sebanyak 100 µl dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 2

jam. Plate kemudian dicuci seperti pada langkah sebelumnya. Sampel kuning

telur dan IgY kontrol positif diencerkan 1:1000 kemudian ditambahkan pada

masing-masing sumur sebanyak 100 µl dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 1

jam. Anti IgY yang telah dikonjugasikan dengan Horse Reddish Peroxydase

(HRP) (pengenceran 1:10.000) ditambahkan pada tiap sumur sebanyak 100 µl dan

diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 1 jam.Plate kemudian dicuci dan selanjutnya

ditambahkan substrat TMB pada tiap sumur sebanyak 100 µl dan didiamkan

selama 20-30 menit. Reaksi ELISA dihentikan dengan menambahkan 50 µl

H2SO4 3M dan dilakukan pembacaan optical density (OD) pada 655 nm. Nilai

cut of value (CV) pada uji ini diperoleh dengan persamaan :

CV = Rataan kontrol negatif + (1 × standar deviasi)

Hasil dinyatakan positif jika nilai absorbansi lebih besar atau sama dengan nilai

cut off.

Pengukuran Konsentrasi IgY dalam Kuning Telur

Anti-chicken IgY diencerkan dalam larutan buffer karbonat pH 9,6 dengan

konsentrasi 1µg/ml Anti-chicken IgY kemudian dimasukkan ke dalam semua

cawan ELISA sebanyak 100 µl/sumur (coating). Cawan ditutup dan diinkubasi

semalam pada suhu 4 ºC. Keesokan harinya cawan ELISA dicuci dengan PBS

Tween˗20 sebanyak 5 kali.

Sebagai larutan blocking digunakan susu skim 5%. Larutan tersebut

kemudian dimasukkan ke dalam semua sumuran cawan ELISA sebanyak 100

µl/sumur. Cawan diinkubasi selama satu jam pada suhu 37 ºC selanjutnya dicuci

kembali lima kali dengan PBS Tween˗20. Sebanyak 100 µl larutan standar dengan

konsentrasi 0, 0.15625, 0.1325, 0.625, 1.25, 2.5, 5, dan 10 mg/ml dimasukkan

masing-masing ke dalam sumuran cawan yang berbeda. Sedangkan sampel IgY

yang akan diuji dimasukkan ke dalam sumuran cawan yang lain sebanyak 100

µl/sumur sesuai dengan pola yang telah ditentukan. Cawan ELISA kemudian

diinkubasi kembali pada suhu 37 ºC selama 1 jam lalu dilakukan pencucian

seperti prosedur di atas.

Sebanyak 100 µl konjugat (anti IgY berlabel HRP) yang diencerkan

1:10.000 dimasukkan ke dalam semua sumur lalu diinkubasi pada suhu 37 ºC

selama satu jam. Cawan ELISA dicuci kembali dengan PBS Tween˗20 dan

sebanyak 100 µl substrat Tetramethylbenzidine (TMB) dimasukkan ke dalam

sumur. Cawan ELISA kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 15 menit

sampai ada perubahan warna. Hasil reaksi diukur dengan alat pembaca ELISA

pada panjang gelombang 655 nm. Berdasarkan nilai absorbansi standar dihitung

8

konsentrasi IgY total dalam kuning telur menggunakan persamaan regresi linear

dengan nilai absorbansi Y dan X sebagai konsentrasi.

Ekstraksi dan Pemurnian IgY dari Kuning Telur

Ekstraksi dan pemurnian IgY dilakukan dengan dua metode, yaitu

pengendapan dengan NaCl (Hodek et al., 2013) dan teknik Water Soluble

Fraction (WSF), hasil dari kedua metode masing-masing dilanjutkan

pengendapan dengan PEG 6000-amonium sulfat (Jenseniuset al, 1981 ; Akita dan

Nakai, 1992 ; Polson et al, 1980).

Pengendapan NaCl (Hodek et al., 2013) dilakukan dengan cara: kuning telur

di pisahkan dari putih telur, kemudian diencerkan dengan PBS yang mengandung

0,1 % Na azid dengan perbandingan 1:1, kemudian ditambahkan 0,5M HCl

hingga pH campuran menjadi 5.0 dan dibekukan pada suhu -20 °C. Kuning telur

kemudian dicairkan dan disentrifus pada 13.500 g selama 15 menit pada suhu 4

ºC. Supernatan yang diperoleh dikumpulkan untuk uji selanjutnya.

Supernatan ditambahkan dengan NaCl, sehingga mengandung 2M NaCl.

Selanjutnya pH campuran disesuaikan menjadi 4 sambil dihomogenkan

menggunakan magnet pengaduk selama 2 jam pada suhu ruangan. Campuran

tersebut disentrifus 3700 g selama 20 menit pada suhu 4 ºC. Supernatan dibuang

dan endapannya dilarutkan dalam PBS.

Ekstraksi IgY menggunakan teknik WSF dilakukan dengan cara

memisahkan kuning telur dari bagian putihnya, kemudian diletakkan di atas kertas

saring untuk menghilangkan putih telur yang melekat. Membran kuning telur

dilubangi dengan cara diangkat dengan pinset, cairan kuning telur ditampung pada

gelas beker dan dilarutkan secara perlahan dalam milli-Q pH 4 dengan

perbandingan 1: 4. Setelah homogen ditambahkan lagi milli-Q pH 2 hingga pH

suspensi mencapai 5.0 sampai 5.2 dan di simpan pada suhu 4 oC minimal 12 jam.

Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 3125 g pada suhu 4 oC selama 20 menit

dan supernatannya dikoleksi yang disebut dengan WSF.

Pemurnian IgY dari hasil ekstraksi menggunakan pengendapan NaCl dan

teknik WSF, dimurnikan lebih lanjut menggunakan PEG 6000 dan amonium

sulfat 40% seperti yang dilakukan oleh Polson et al. (1980). Hasil ekstraksi IgY

yang berupa pelet dilarutkan dalam PBS sampai volume 1 ml kemudian

diendapkan dengan PEG 6000 3,5% dan dilanjutkan dengan pengendapan dengan

PEG 6000 12%. Kemudian di dialisis dalam dalam PBS pH 8 selama 24 jam

dengan perbandingan 1:150.

Pengukuran Konsentrasi Total IgY yang Telah Dimurnikan

Sepuluh mg BSA dilarutkan dengan 10 ml aquabides dan dibuat

pengenceran secara seri 10-1

sampai dengan 10-10

dan digunakan sebagai standar

konsentrasi. 0,1 ml dari masing-masing pengenceran ditempatkan dalam tabung

reaksi steril lainnya dan ditambahkan dengan 5 ml larutan Bradford. Sebanyak 0,1

ml sampel IgY diisi ke dalam tabung reaksi steril dan masing-masing

ditambahkan larutan Bradford. Larutan standar dan sampel masing-masing

dimasukkan ke tabung kuvet untuk dilihat hasil absorbansinya dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm (Siles-Lucas dan Cuesta-

bandera 1996). Interpretasi hasil pembacaan dilakukan dengan regresi linier

dibuat dari hasil pembacaan standart, dengan regresi linier X sebagai absorbansi

9

dan Y adalah konsentrasi data lalu diperoleh persamaan linier Y=a+bx, nilai a dan

b dihitung dari konsentrasi protein masing-masing sampel.

Karakterisasi IgY Spesifik Rabies

Karakterisasi IgY dilakukan dengan menghitung berat molekul (BM) yang

dianalisis dengan teknik Sodium Deodecyl Sulphate-Poly Acrilamide (SDS-

PAGE) (Gordon, 1975). Gel yang digunakan terdiri atas dua bagian, yaitu gel

pengumpul (stacking gel) dan gel pemisah (running gel) (Laemmli 1970). Larutan

gel pemisah 12% dimasukkan ke dalam 2 lempeng kaca elektroforesis, yang

sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol 70% dan pada kedua sisi tepi bagian

dalam diberi spacer kemudian lempeng kaca dihimpitkan dan selanjutnya dijepit.

Gel pemisah segera dilapisi dengan penambahan air. Setelah gel pemisah

membeku, lapisan air dibuang dan gel pengumpul 4% dimasukkan hingga

mencapai permukaan lempeng kaca dan terbentuk gel elektroforesis. Sisir

kemudian segera dimasukkan dan diangkat setelah gel pengumpul membeku

sehingga tercetak sumur-sumur.

Preparasi sampel menggunakan buffer sample yaitu dengan mencampur 5 µl

buffer sample dengan 5 µl sampel IgY spesifik rabies hasil pemurnian kemudian

dipanaskanpada suhu 60 °C selama 5 menit sebelum dimasukkan ke dalam sumur

gel elektroforesis. Sebanyak 10 µl sampel dimasukkan ke dalam masing-masing

sumur gel elektroforesis, kemudian perangkat elektroforesis dijalankan dengan

arus 50 mA dengan voltase 100 V selama 3 jam. Elektroforesis berakhir apabila

pewarna sampel mencapai batas 0.5 cm dari bagian bawah gel. Setelah

elektroforesis beakhir kemudian gel diangkat dari lempeng kaca direndam di

dalam pewarnaan Commasie Blue (Sigma® Chemical Co) selama 30 menit pada

suhu ruang sambil diagitasi perlahan. Pewarna yang tidak terikat pada protein

dihilangkan dengan merendam gel pada larutan pemucat (campuran metanol dan

asam asetat glasial) sehingga gel tampak bening atau pita-pita protein yang

terbentuk terlihat jelas.

Pengukuran Titer IgY Spesifik Rabies Menggunakan ELISA

Titer IgY spesifik rabies ditentukan dengan uji ELISA menggunakan kit

Platelia II (Biorad®). Kit ini terdiri dari serum kontrol positif dan serum kontrol

negatif. Masing-masing serum kontrol diencerkan 1:100 menggunakan larutan

pengencer serum yang tersedia. Serum kontrol positif standar WHO diencerkan

menjadi 1:100 dengan pengencer serum sehingga titernya adalah 4 EU. Serum

standar tersebut selanjutnya diencerkan secara seri dua kali sehingga titernya

menjadi 2 EU, 1 EU, 0.5 EU, 0.25 EU dan 0.125 EU. IgY hasil pemurnian

menggunakan NaCl dan WSF serta serum kontrol (positif dan negatif) dan serum

standar dimasukkan ke dalam sumuran dari mikroplate sesuai pola yang

ditentukan sebelumnya. Masing-masing serum tersebut dimasukkan sebanyak 100

µl pada setiap sumur. Mikroplate ditutup dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 1

jam. Mikroplate dicuci sebanyak 3 kali, kemudian ditmbahkan 100 µl konjugat

yang telah diencerkan pada semua lubang mikroplate. Mikroplate ditutup dan

diinkubasi 1 jam pada suhu 37° C. Selanjutnya mikroplate dicuci sebanyak 5 kali

kemudian ditambah 100 µl substrat pada semua lubang dan diinkubasi pada suhu

kamar selama 30 menit dalam kondisi gelap. Mikroplate selanjutnya diisi dengan

100 µl stop solution pada semua sumur. Tiga puluh menit kemudian dilakukan

10

pembacaan optical density pada panjang gelombang 450 nm sampai 620 nm

(Biorad 2009). Penghitungan titer hasil pembacaan absorbansi masing-masing

sampel dengan menggunakan rumus yang sudah disediakan dalam KIT

interpretasi hasil dari titer ditentukan berdasarkan manual kit Platelia II(Biorad

2009, OIE 2007)

Analisis Data

Data hasil penelitian dianalisa secara deskriptif (Montgomery 2001) serta

menggunakan metode One Way Analyzed of Variance (ANOVA).

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Produksi dan Deteksi IgY Spesifik Rabies dalam Kuning Telur

Antigen rabies inaktif dengan konsentrasi 1.33 mg/ml yang digunakan

dalam penelitian ini merupakan antigen yang baik karena terbukti dapat

menggertak sistem imunitas ayam petelur untuk menghasilkan antibodi spesifik

terhadap virus rabies dalam kuning telur. Mekanisme transfer IgY dari serum ke

dalam kuning telur sama seperti proses kelangsungan transfer antibodi lintas

plasenta pada mamalia. IgY diproduksi oleh limfosit B yang mengalami

pematangan dalam bursa Fabricius ayam. IgY akan mengalir ke dalam pembuluh

darah dan beredar ke seluruh bagian tubuh termasuk ke dalam ovarium.

Imunoglobulin yolk didepositkan melalui jaringan arteri kecil ovarium˗oosit ke

dalam kuning telur sebagai bahan perlindungan bagi embrio ayam untuk

berkembang (Carlander 2002).

Penelitian Paryati (2006) menggunakan IgY yang merupakan antibodi

anti˗idiotipe (Ab2) terhadap rabies sebagai antigen dengan konsentrasi 0.940

mg/ml dapat memicu terbentuknya antibodi pada hewan coba. Liddell dan Weeks

(1995) menyatakan, bahwa pembentukan antibodi dengan afinitas tinggi dapat

diinduksi melalui imunisasi dengan dosis antigen relatif rendah. Pada penelitian

ini digunakan dosis 0.665 mg/ml/ekor ayam membuktikan bahwa dengan dosis

antigen tersebut dapat memicu pembentukan antibodi hewan yang divaksin.

Pembentukan sistem imun pada hewan tergantung pada kondisi dan spesies hewan

yang diimunisasi, pada hewan tertentu dosis imunogen umumnya berkisar antara

10˗100 μg. Namun, untuk sebagian besar antigen protein, karbohidrat dan asam

nukleat dianjurkan memakai dosis antara 50˗1000 μg (Leenaars et a,1994).

Berdasarkan pemeriksaan keberadaan IgY spesifik rabies dalam kuning telur

menggunakan uji indirect ELISA diketahui bahwa IgY spesifik rabies telah

muncul dan terdeteksi pada dua minggu setelah vaksinasi pertama. Kuning telur

yang mengandung IgY spesifik rabies masih terdeteksi sampai dengan minggu ke

6 setelah vaksinasi kedua. Hasil dari uji ini diekspresikan dalam nilai absorbansi.

Semakin tinggi nilai absorbansi yang diperoleh maka semakin tinggi pula

konsentrasi antibodi yang terdapat pada kuning telur. Hasil dari uji ELISA sampel

kuning telur ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi lebih pekat

(Gambar 4). Semakin pekat warna yang dihasilkan menunjukkan bahwa nilai

absorbansi dari sampel semakin besar. Banyaknya substrat yang terurai dalam

11

larutan akan mempengaruhi kekuatan warna yang terbentuk. Kekuatan warna

menunjukkan jumlah ikatan antigen dan antibodi primer (Indardi 2005).

Gambar 4 Uji ELISA IgY pada kuning telur; A1-H1: IgY kontrol dengan

konsentrasi bertingkat (0 s/d 10 µg/ml); A2-12 s/d H2-12 : sampel

kuning telur dari ayam yang divaksinasi antigen rabies

Berdasarkan nilai absorbansi IgY kontrol dengan konsentrasi bertingkat,

ditentukanlah nilai cut off sebesar 0.779, sehingga apabila kuning telur memiliki

nilai absorbansi di atas nilai cut off, maka kuning telur tersebut positif

mengandung antibodi terhadap virus rabies. Kuning telur positif mengandung IgY

spesifik rabies sejak minggu kedua setelah vaksinasi pertama hingga minggu ke 6

setelah vaksinasi kedua (Tabel 1 ).

Tabel 1 Deteksi dan pengukuran konsentrasi IgY dalam kuning telur

Minggu

Ke- Absorbansi (655 nm) Interpretasi

P

Konsentrasi IgY

(mg/ml)

X ± SD

I* 0.274 - 0.377 ± 0.010a

II 1.422 + 2.965 ± 0.409b

III 1.367 + 2.840± 0.784b

VI** 1.326 + 2.749± 0.341b

V 1.266 + 2.612± 0.562b

VI 1.129 + 2.304± 0.227b

VII 1.341 + 2.782± 0.509b

VIII 1.256 + 2.591 ± 0.601b

IX 1.128 + 2.302± 0.702b

X 1.082 + 2.198 ± 0.393b

* : vaksinasi pertama

**: vaksinasi kedua P(+)positif IgY spesifik rabies pada kuning telur jika rata-rata nilai absorbansi ≥ cut off (0.779); (-)

negatif IgY spesifik rabiesjika rata-rata nilai absorbansi ≤ cut off (0.779) a, b

Superscript yang tidak sama pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p >

0.05) pada tingkat kepercayaan 95%

12

Konsentrasi IgY dalam kuning telur sebelum vaksinasi adalah

0.377±0.010mg/ml. Namun konsentrasi IgY menunjukkan peningkatan yang

signifikan pada minggu ke 2 setelah vaksinasi pertama 2.965±0.409 mg/ml (Tabel

1).Berdasarkan hasil pengukuran konsentrasi IgY kuning telur setiap minggunya

menunjukkan bahwa konsentrasi IgY mengalami penurunan dari minggu

ketiga2.840± 0.784 mg/ml hingga minggu kesepuluh 2.198 ± 0.393 mg/ml,

kecuali pada minggu ketujuh IgY mengalami kenaikan 2.782 ± 0.509 mg/ml

dibandingkan minggu kelima dan keenam (2.612 ± 0.562 mg/ml dan 2.304 ±

0.227 mg/ml). Penurunan IgY setelah vaksinasi ulang mulai terlihat pada minggu

ke 8 (2.591 ± 0.601mg/ml) hingga minggu ke 10 (2.198 ± 0.393 mg/ml), dimana

penurunan ini merupakan cermin dari hilangnya populasi sel plasma penghasil

antibodi spesifik. Sekali berdiferensiasi penuh, sel plasma mati setelah tiga sampai

enam hari dan imunoglobulin yang dihasilkan ini menurun perlahan-lahan karena

terjadi proses katabolisme (Tizard 2004).

Konsentrasi dan Karakterisasi IgY Spesifik Rabies Hasil Pemurnian

Pemurnian dengan pengendapan NaCl menghasilkan konsentrasi protein

total IgY 331 µg/ml, sedangkan pemurnian dengan teknik WSF menghasilkan

konsentrasi 184 µg/ml. Berdasarkan hasil penelitian ini menunjukkan bahwa

pemurnian dengan NaCl menghasilkan konsentrasi IgY yang lebih tinggi daripada

pemurnian dengan teknik WSF. Perbedaan konsentrasi IgY hasil pemurnian

dipengaruhi oleh metode pemurnian yang digunakan, menurut Shimizu et al.

(1988) dan Sunwoo et al. (1996), perbedaan cara pemurnian IgY akan

menghasilkan perbedaan konsentrasi, kemurnian, stabilitas dan aktivitas IgY.

Konsentrasi IgY dari pemurnian kuning telur sangat dipengaruhi oleh tingkat

kelarutan kuning telur pada saat pemisahan lemak telur dan pH larutan (Akita &

Nakai 1992).

Prosedur kerja dari pemurnian menggunakan teknik WSF lebih rumit dan

membutuhkan waktu yang relatif lebih lama dibandingkan pemurnian dengan

pengendapan NaCl. Dalam pemilihan metode pemurnian sebaiknya perlu

dipikirkan juga faktor biaya dan waktu yang dibutuhkan, sehingga metode yang

kita gunakan lebih efisien.

Tabel 2 Berat molekul komponen-komponen protein dan masing-masingpita

penyusunnya

Jenis Sampel Pita yang

ditemukan

Berat molekul pita

(kDa)

Estimasi Protein

IgY Kontrol

A 181.55 IgY

B 71.78 Rantai Berat

C 41.47 Fragmen Fab

IgY anti- rabies

(NaCl)a

D 164.16 IgY

E 126.43 LDL dan a-Livetin

F 97.36 LDL dan a-Livetin

G 68.73 Rantai berat

H 40.76 Fragmen Fab

I 28.77 Rantai ringan

13

IgY anti-rabies

(WSF)b

J 94.03 LDL dan a-Livetin

K 65.61 Rantai berat

L 35.26 Fragmen Fab aPemurnian dengan pengendapan NaCl

bPemurnian dengan WSF

Kuning telur yang telah dimurnikan diukur berat molekulnya menggunakan

teknik SDS-PAGE. Hasil elektroforesis tersaji pada Gambar 5 dan Tabel 2. Hasil

pemurnian IgY menggunakan metode pengendapan NaCl menghasilkan 6 pita

protein pada berat molekul 164.16 kDa, 126.43 kDa, 97.36 kDa, 68.73 kDa, 40.76

kDa, 28.77 kDa sedangkan pemurnian IgY menggunakan teknik WSF

menghasilkan 3 pita protein pada berat molekul 94. 03 kDa, 65.61 kDa, dan 31.94

kDa.

IgY kontrol adalah IgY standar (PROMEGA®). Susunan protein pada IgY

kontrol terdiri atas 3 pita protein yaitu 181.55 kDa, 71.78 kDa dan 41.47 kDa.

Protein dengan berat molekul 181.55 kDa pada IgY kontrol dan 164,16 kDa pada

IgY spesifik rabies (kolom A) diduga merupakan IgY utuh. Sun et al. (2001)

menyatakan bahwa berat molekul IgY sebesar 167.25 kDa dan Narat (2003)

menyatakan bahwa IgY mempunyai berat molekul yang lebih besar dibandingkan

IgG (160 kDa), yaitu sekitar 180 kDa atau lebih. Pita protein dengan berat

molekul 68.73 kDa (pita G) untuk NaCl dan 65.61 kDa (pita K) untuk WSF

diduga sebagai rantai berat IgY, sedangkan pita protein dengan berat molekul

28.77 kDa (Pita I) pada kolom B merupakan rantai ringan IgY. Beberapa peneliti

melaporkan bahwa ukuran berat molekul dari rantai berat IgY adalah 65-70 kDa,

sedangkan untuk rantai ringan 20-30 kDa (Yokohama et al. 1993; Hatta et a1.

1993; Bhanushali et al. 1994; Schade et al. 1996).

Sun et a1. (2001) menyatakan, bahwa degradasi IgY akan menghasilkan

fragmen Fc dan Fab, Fab mempunyai berat molekul 45 kDa. Pita protein dengan

ukuran 41.47 kDa pada IgY kontrol dan 40.76 kDa pada IgY spesifik rabies

dengan teknik NaCl serta pita protein dari teknik WSF dengan ukuran 35.26 kDa

di duga adalah fragmen dari Fab. Hasil SDS-PAGE pada gambar juga

memperlihatkan pita protein lain yaitu pada pita E, F, dan J dengan estimasi berat

molekul masing-masing 126.43 kDa, 97.36 kDa, dan 94.03 kDa memiliki

kemungkinan LDL terlarut dan a-livetin. Adanya pita protein selain IgY

kemungkinan disebabkan adanya kandungan protein selain bagian dari IgY.

14

Gambar 5 Profil pita protein (dalam kDa) IgY spesifik rabies yang telah

dipurifikasi. Keterangan; (1) IgY kontrol, (2) IgY spesifik rabies

yang dipurifikasi dengan metode NaCl, (3) IgY spesifik rabies yang

dipurifikasi dengan metode WSF, dan (4) Marker protein

Titrasi IgY Spesifik Rabies

Uji ELISA terhadap IgY hasil pemurnian pengendapan NaCl dan WSF

menunjukkan bahwa titer IgY spesifik rabies yang dimurnikan dengan

pengendapan NaCl adalah lebih besar dari 0.5 EU/ml, sedangkan dengan teknik

WSF lebih rendah dari ≤ 0.5 EU/ml. Berdasarkan acuan dari WHO (1992), titer

antibodi rabies dikatakan protektif apabila nilainya ≥ 0.5 EU/ml dengan uji

ELISA. Hal ini berarti bahwa hewan atau orang yang divaksinasi rabies paling

tidak harus mempunyai antibodi terhadap rabies sebesar 0.5 EU/ml untuk dapat

terlindung dari penyakit rabies (OIE 2007). Titer IgY spesifik rabies yang

dihasilkan pada penelitian ini di tunjukkan pada Tabel 3. Hasil penelitian ini

menunjukkan bahwa bahwa ayam mampu merespon virus rabies dan dapat

memproduksi IgY spesifik rabies yang titernya cukup tinggi. Perbedaan titer

antibodi dari IgY yang diuji diduga akibat adanya perbedaan teknik pemurnian,

seperti yang disampaikan Shimizu et al. (1988) dan Sunwoo et al. (1996).

Tabel 3 Titer IgY spesifik rabies

Metode pemurnian Titer IgY spesifik rabies (EU)

Pengendapan NaCl 0.5 EU/ml<OD sampel<4 EU/ml

Teknik Water Soluble Fraction 0.125 EU/ml<OD sampel<0.5 EU/ml

15

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa IgY spesifik rabies dapat

diproduksi pada ayam petelur, dan memiliki titer yang protektif. IgY spesfik

rabies hasil pemurnian dengan pengendapan NaCl menghasilkan konsentrasi (331

µg/ml) dan titer (≥ 0.5 EU/ml) yang lebih tinggi dibandingkan IgY hasil

pemurnian dengan WSF (konsentrasi 184 µg/ml; titer ≤ 0.5 EU/ml). Pemurnian

IgY dengan pengendapan NaCl membutuhkan waktu yang relatif lebih singkat

dibandingan pemurnian dengan WSF.

Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menguji efektivitas IgY

spesifik rabies yang diproduksi pada ayam petelur apabila hendak digunakan

sebagai antibodi standar dalam pengembangan kit diagnostik.

16

DAFTAR PUSTAKA

Adjid RMA, Sarosa A, Syapriati T, dan Yuningsih. 2005. Penyakit rabies di

Indonesia dan pengembangan teknik diagnosisnya. Wartazoa. 15(4): 165- 172.

Akita EM, Nakai S. 1992. Comparision of Four Purification Methods for The

Production of Imunoglobulin from Eggs Laid by Hens Immunized with

Enterotoxigenic E.coli Strain. J Immunol Method. 160:207-214.

Alves LM, Soares RM,Cortez A, Richtzenhain LJ, dan Ito FN. 2003. Pathogenesis

of rabies virus by ERA and PV strains administered orally in hamsters (M.

auratus).Braz J Ve Res Anim Sci. 40(1): 811-816

Awad WS, Ibrahim AK, Salib FA. 2009. Using Indirect ELISA to Assess

Different Antigens for The Serodiagnosis of Fasciola gigantica Infection in

Cattle,Sheep, and Donkeys. Res Vet Sci 86:466-471.

Baer GM. 1991. The Natural History of Rabies. [Internet]. [diunduh 2016 Mei 31].

Terdapat pada:

http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/rabies/Epidemiology/racoon_map_I.htm.

Bhanushali JK, Gilbert JM, Mc Dougald LR. 1994. Simple Method to Purify

Chicken Immunoglobulin G. Poultry Sci. 73:1158-1161.

[Biorad]. 2009. User's manual Platelia Rabies II Kit. [Internet]. [diunduh

2016Maret 13].

Terdapatpada:http://web.oie.int/VCDA/eng/Registre/User's%20manual_Platel

iaRabiesII.pdf

Bogoyavlensky AP, Bersin VE, Tolmachva VP. 1999. Immunogenicity of

influenza glycoprotein with different forms of supermolecular organization in

hens. J Lab Anim Sci. 4: 99-105

Burgess GW. 1995. Teknologi ELISA dalam Diagnosis dan Penelitian. Artama

WT, penerjemah. Yogyakarta (ID): Gadjah Mada University Press.

Campbell JB, Reece LG dan Mitchell. 2004. Biologi. Ed ke-5. Jilid 3. Jakarta (ID).

Penertbit Erlangga.

Carlander D. 2002. Avian Immunoglobulin Y Antibody in Vitro and in Vivo.

[disertations]. Swedia (SE): Faculty of Medicine Uppsala University.

Gassmann M, Thommes P, Weiser T, Hubscher U. 1990. Efficient production of

chicken egg yolk antibodies againts a conserved mammalian protein. FASEB

J. 4: 2528-2532.

Gordon AH. 1975. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular

Biology Vol.1 Ed-2. Electrophoresis of Protein in Polyacrilamide and Starch

Gels. Amsterdams (NL): North Holland Press Publishers.

Haak-Frendscho M. 1994. Why IgY? Chicken Polyclonal Antibody, an Appealing

Alternative. Promega Notes Magazine.(46): 11.

Hassl AH, Aspock H, Flamm. 1987. Comparative stuideis on the purity and

specifity of yolk immunoglobulin Y isolated from eggs laid by hens

immunized with Toxoplasma gondii. Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg. 2:

247-253.

Hatta H, Tsuda K, Akachi S, Kim M, Yamamoto T. 1993. Productivity and Some

Properties of Egg Yolk Antibody (IgY) Against Human Rotavirus Compared

with Rabbit IgG. Biosci Biotech Biochem. 57:450-454.

17

Hodek P, Pavel T, Jiri S, Jiri H, Marie S. 2013. Optimized Protocol of Chicken

Antibody (IgY) Purification Providing Electrophoretically Homogenous

Preparations. Int J Electrochem Sci. 8:113 – 124.

Indardi. 2005. Efek Sistemik Pemberian Imunoglobulin Y (IgY) anti

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) peroral pada mencit. [Skripsi]

Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Jackson A. 2007. Pathogenesis dalam Rabies. Ed ke-2. Edited by Alan C.

Jackson and William H. Wunner. Elsevier Inc.

Jensenius JC, Andersen I, Hau J, Crone M, Koch C. 1981. Eggs: Conveniently

Packaged Antibodies Methods for Purification of Yolk IgG. J Immunol

Methods.46(1): 63–68.

Kermani-Arab, Moll VT, Cho BR, Davis WC, Lu YS. 2001. Effects of IgY

antibodiy on the development of marek’s disease. J Avian Dis. 20: 32-41.

Laemmli UK. 1970. Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the

Head of Bacteriophage T4. The Nature. 227: 680 – 685.

Larsson A, Wejaker PE, Forsberg PO, Lindahl T. 1993. Chicken antibodies taking

advantage of evolution : A review. Poultry sci.

Leenaars PPAM, Claassen E, Boersma WJA. 1997. Antigen and Antigen

Presentation. In: Immunology Methods Manual, I. Lefkovits (Ed.). London

(GB). Akademic Press Ltd.

Lewis P, Fu Y, and Lentz TL. 2000. Rabies Virus Entry At The Neuromuscular

Junction In Nerve–Muscle Cocultures. Mucle and Nerve. John Wiley & Sons,

Inc.

Liddell E, Weeks I. 1995. Antibody Technology. Oxford (UK). Bios Scientific

Publisher Ltd.

Makoto SCF, Robert N, Shuryo. 1998. Anti-E.coli immunoglobulin Y isolated

from egg yolk of immunized chickens as a potential food ingredient. J Food

Sci. 53: 1361-1365.

Meslin FX, Kaplan MM. 1996. An Overview of Laboratory Techniques in The

Diagnosis and Prevention of Rabies and in Rabies Research . Chapter 2 in

Laboratory Techniques in Rabies Ed-4. Geneva (CH): WHO Pr.

Narat M. 2003. Production of antibodies in chickens. Food Technol

Biotechnol.41(3):259-267.

[OIE] Office International des Epizootis. 2007. Kit for In Vitro Detection and

Titration of IgG anti Rabies Virus Glycoprotein in Dogs, Cats and Foxes

Serum. User’s manual. Biorad.

Paryati, SPY. 2006. Antibodi Anti-Idiotipe Sebagai Kandidat Vaksin Rabies.

[Disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Polson A, Von Wechmar MB, Van Regen-mortel MHV. 1980. Isolation of viral

IgY anti-bodies from yolks of immunized hens. Immunol Commun.9(5): 475–

493.

Priadi. 2002. Prinsip Dasar Reaksi Imunologi Dalam Uji Serologi. Pelatihan

Internal Teknisi Bakteriologi. Balai Penelitian Veteriner: Bogor.

Schade R, Staak C, Hendriksen C, Erhard M, Hugl H, Koch G, Larsson A,

Pollmann W, Rogenmortel M, Rijke E, Spielmann H, Steinbusch H,

Straughan D. 1996. The Production of avian (egg yolk) antibodies : IgY.

ATLA. 24: 925-934.

18

Scott RW. 1997. Financial Accounting Theory. New Jersey (US). Prentice Hall

International Inc.

Shimizu M, Fotzsimmons RC, Nakai S. 1988. Anti-E.coli Immunoglobulin Y

Isolated From Egg Yolk of Immunized Chicken as Potential Food Ingredient.

J Food Sci. 53: 1360

Siles-Lucas, Cuesta-Bandera C. 1996. Echinococcus granulosus in Spain: Strain

Differentiation by SDS-PAGE of Somatic and Excretory/Secretory Proteins. J

Helminthol. 70(3): 253-257.

Sun S, Mo W, Ji Y, Liu S. 2001. Preparation and Mass Spectrometric Study of

Egg Yolk Antibody (IgY) Againts Rabies Virus. Rapid Commun. Mass

Spedtrom. 15:708-712.

Sunwoo HH, Nakano T, Dixon WT, Sim JS. 1996. Immune Responses in

Chickens Against Lipopolysccharide of Escherichiacoli and Salmonella

typhimurium. Poultry Sci. 75:342-345.

Suwarno. 2003. Prinsip Dasar, Optimalisasi, dan Interpretasi Hasil Uji

ELISA.Surabaya (ID): Lab Virology dan Immunologi FKH Unair

Tizard.2004. Pengantar Imunologi Veteriner. Edisi II. Partodiredjo M,

penerjemah. Surabaya (ID): Airlangga University Pr.

[WHO] World Health Organization. 1992. WHO Expert Consultation on Rabies.

Geneva (CH):WHO Pr.

[WHO]World Health Organization. 2002. Rabies vaccines. In : Immunization,

Vaccines and Biologicals.Weekly Epidemiological Record.77:109-120.

Wunner WH. 2007. Rabies Virusin Rabies. Ed Ke-2. Edited by Alan C. Jackson

and William H. Wunner. Elsevier Inc

Yokohama H, Peralta RC, Horikoshi T, Hiraoka J, Ikemori Y, Kuroki M, Kodama

Y. 1993. A Two-step Procedure for Purification of Hen Egg Yolk

Immunoglobulin G : Utilization of Hydroxypropylmethylcellulose Phthalate

and Synthetic Affinity Ligand Gel (Avil ALB). Poultry Sci. 72: 275-281.

Yokohama H, Peralta RC, Umeda K, Hashi T, Icalto FC, Kuroki M. 1998.

Prevention of fatal salmonellosis in neonatal calves, using orally administered

chicken egg yolk salmonella-specific antibodies. Am J Vet Res. 59: 416-420.

19

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kendari, Sulawesi Tenggara pada tanggal 7 Maret

1987 sebagai anak kedua dari empat bersaudara dari ayah Drs. La Ode Ruhi dan

seorang ibu Asmawati.

Penulis menamatkan Sekolah Menengah Atas Negeri (SMAN) 1 Kendari

tahun 2005 dan ditahun yang sama diterima di Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam di jurusan Biologi Universitas Halu Oleo, Sulawesi Tenggara

dan lulus pada tahun 2009. Pada tahun 2014 penulis lulus seleksi program

pascasarjana Institut Pertanian Bogor (IPB) di Program Studi Mikrobiologi

Medik.

Penulis memperoleh bantuan bantuan penelitian dan penulisan tesis

diperoleh dari Lembaga Pengelola Dana Pendidikan (LPDP) Kementrian

Keuangan. Karya ilmiah berjudul preparasi imunoglobulin yolk (IgY) spesifik

rabies untuk pengembangan kit diagnostik telah disajikan pada

International Postgraduate Symposium on Food, Agriculture and Biotechnology

di Bangkok. Karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari progran S-2 penulis