TEKNOLOGI REPRODUKSITEKNOLOGI REPRODUKSIDr. Tjok Gde Oka Pemayun, drh.,MS.Dr. Tjok Gde Oka Pemayun, drh.,MS.

TOPIKTOPIK

• SinkronisasiSinkronisasi

• SuperovulasiSuperovulasi

• Produksi EmbrioProduksi Embrio

• Frozen EmbrioFrozen Embrio

• ICSI (Intracytoplasmic Sperm)ICSI (Intracytoplasmic Sperm)

EMBRIO TANSFEREMBRIO TANSFER

• Th 1890 oleh walter heap: Rabbit Th 1890 oleh walter heap: Rabbit

• Th 1930 : pd Kamb & Domba di Amerika Utara & Th 1930 : pd Kamb & Domba di Amerika Utara & RusiaRusia

Hasilnya: < 25%Hasilnya: < 25%

Penyebab: Penyebab: – Status rep donor & resipien kurang sinkronStatus rep donor & resipien kurang sinkron– Media yg digunakan tda sesuaiMedia yg digunakan tda sesuai– Kurang sterilnya bhn2 yg digunakanKurang sterilnya bhn2 yg digunakan

• Th 1970 : Teknologi ET mulai dikemb scr komersialTh 1970 : Teknologi ET mulai dikemb scr komersial

ManfaatManfaat

• u/ meningkatkan jml anak dari betina genetik u/ meningkatkan jml anak dari betina genetik superiorsuperior

• Pemanfaatan hwn betina cacat fisik (genetik Pemanfaatan hwn betina cacat fisik (genetik unggul)unggul)

• Pemanfaatan limbah RPH berupa ovumPemanfaatan limbah RPH berupa ovum

PROSEDUR ETPROSEDUR ET

1.1. Sinkronisasi siklus estrusSinkronisasi siklus estrus

2.2. Superovulasi donorSuperovulasi donor

3.3. Koleksi & Identifikasi embrioKoleksi & Identifikasi embrio

4.4. Tansfer Embrio ke resipien Tansfer Embrio ke resipien

Sinkronisasi EstrusSinkronisasi EstrusPrinsip Kerja : Prinsip Kerja : 1.1. Memperpanjang fase lutealMemperpanjang fase luteal2.2. Memperpendek fase lutealMemperpendek fase luteal

Memperpanjang Fase LutealMemperpanjang Fase Luteal• CL beregresi scr alamiCL beregresi scr alami• Memblok FSH & LH setelah CL beregresiMemblok FSH & LH setelah CL beregresi• Preparat: Progesteron (P4) yg diberikan slm 14-21 Preparat: Progesteron (P4) yg diberikan slm 14-21

hrhr (tgt spesies)(tgt spesies)• Penghentian P4: Folikel berkemb., estrus & Penghentian P4: Folikel berkemb., estrus &

OvulasiOvulasi

Estrus: 2-8 hr setelah pengehentian P4 Estrus: 2-8 hr setelah pengehentian P4

Metode Pemberian: Metode Pemberian: orally, pessaries, ear implant and orally, pessaries, ear implant and intravaginal Devicesintravaginal Devices

Memperpendek fase lutealMemperpendek fase luteal

• Menginduksi regresi CL lebih awal (Luteolisis)Menginduksi regresi CL lebih awal (Luteolisis)

Preparat:Preparat:

• PGFPGF22 αα atau analognya ( atau analognya (CloprostenoCloprostenol) l) daya daya

luteolitik pada semua spesies (fase perkemb CL) luteolitik pada semua spesies (fase perkemb CL)

• Estrogen Estrogen dayadaya luteolitik pd ruminansia, tdk pd kuda & luteolitik pd ruminansia, tdk pd kuda & babibabi

PGFPGF22 αα::

• Injeksi tunggal Injeksi tunggal PGFPGF22 αα - CL regresi 24-72 jam - CL regresi 24-72 jam

- Estrus dan ovulasi 2-3 - Estrus dan ovulasi 2-3 hrhr

• Ruminansia & kuda: PG tdk respon thd Cl umur 4-6 Ruminansia & kuda: PG tdk respon thd Cl umur 4-6 hrhr

• Babi: PG berespon setelah hr12 atau 13 siklus estrusBabi: PG berespon setelah hr12 atau 13 siklus estrus

• PGFPGF22 α α + P4: Sinkronisasi estrus + P4: Sinkronisasi estrus

Metode sinkronisasi estrus pd TernakMetode sinkronisasi estrus pd Ternak

• Sapi P4 kurang memberikan hsl yg baik oleh Sapi P4 kurang memberikan hsl yg baik oleh karena karena dpt menurunkan fertilitas dpt menurunkan fertilitas

AplikasiAplikasiSapi dan KerbauSapi dan Kerbau

1.1. 2 kali injek PGF2 kali injek PGF22 αα (pengulangan hr ke -11 atau -12 (pengulangan hr ke -11 atau -12 dari saat injek I dikawinkan (alami/AI) saat estrus dari saat injek I dikawinkan (alami/AI) saat estrus atau 72-96 jam stlh injek ke -2atau 72-96 jam stlh injek ke -2

2.2. P4 dan P4 dan PGFPGF22 αα: Progestogen (P4) (PRID)/ slm 7 hr dan : Progestogen (P4) (PRID)/ slm 7 hr dan PG diinjek hr ke -6 dr saat pemb P4PG diinjek hr ke -6 dr saat pemb P4 dikawin dikawin berdasarkan gejala estrus (84 jam post injek PG)berdasarkan gejala estrus (84 jam post injek PG)

3.3. P4 + E2: - Dosis 5 mg E2 (estradiol benzoat) & 3 mg P4 + E2: - Dosis 5 mg E2 (estradiol benzoat) & 3 mg P4 P4 (norgestomet) dinjek. (norgestomet) dinjek.

- - P4 diimplan slm 9 hr mulai hr 1P4 diimplan slm 9 hr mulai hr 1 - - IB saat estrus (AIDE) atau saat IB (TAI) IB saat estrus (AIDE) atau saat IB (TAI)

54 jam54 jam setelah implan diangkat setelah implan diangkat

4.4. aGn-RH: Fungsinya u/ mengontrol perkemb fol. dan aGn-RH: Fungsinya u/ mengontrol perkemb fol. dan kehdp CL. kehdp CL.- Injek aGn-RH hr ke -0 dan PG hr ke -6- Injek aGn-RH hr ke -0 dan PG hr ke -6

- 70-80% estrus dlm waktu 4 hr tampa - 70-80% estrus dlm waktu 4 hr tampa mempengaruhi mempengaruhi fertilitas (65-85%) fertilitas (65-85%)

• Kambing dan DombaKambing dan Domba - P4 dan PGF- P4 dan PGF22 αα sangat efektif sbg preparat sinkronisasi sangat efektif sbg preparat sinkronisasi - Lama treatment P4 bervariasi (perbedaan siklus estrus) - Lama treatment P4 bervariasi (perbedaan siklus estrus)

yaitu yaitu Domba 16 hr dan Kambing 21 hrDomba 16 hr dan Kambing 21 hr

AplikasiAplikasi1.1. P4 P4 pessarypessary:-P4 pessary/implant slm 12-14 hr (domba) :-P4 pessary/implant slm 12-14 hr (domba)

dan dan 18-21 hr u/ kambing 18-21 hr u/ kambing - Ke2 sp, injek eCG 400-800 IU saat imlant - Ke2 sp, injek eCG 400-800 IU saat imlant

diangkatdiangkat

-- IB ; Domba 48-60 jam stl implant IB ; Domba 48-60 jam stl implant diangkatdiangkat

Kambing Kambing 30-60 jam stl implant 30-60 jam stl implant diangkatdiangkat

2.2. PGFPGF22 αα sering dikombinasi dg P4 dan eCG (belum ada sering dikombinasi dg P4 dan eCG (belum ada hasil yg signifikanhasil yg signifikan

Domba: 2 kali injek PG (pengulangan hr ke -9) dan dikawin Domba: 2 kali injek PG (pengulangan hr ke -9) dan dikawin kan saat estrus atau dobel kawin kan saat estrus atau dobel kawin

Kambing: sama (pengulangan hr ke -11 atau 12) dan dikawinKambing: sama (pengulangan hr ke -11 atau 12) dan dikawin

kan saat estrus atau dobel kawin kan saat estrus atau dobel kawin

PGFPGF22 αα menyebabkan Abortus hati2 pd hw bunting menyebabkan Abortus hati2 pd hw bunting

BabiBabi

1.1. P4 (altrenogest) mll pakan slm 14-18 hr : sangat efektifP4 (altrenogest) mll pakan slm 14-18 hr : sangat efektif- Estrus: 4-5 hr stl p4 dihentikan- Estrus: 4-5 hr stl p4 dihentikan- Lama periode estrus: 2-4 hr- Lama periode estrus: 2-4 hr- IB: 2kali yaitu hr ke -6 dan ke -7 stl P4 dihentikan- IB: 2kali yaitu hr ke -6 dan ke -7 stl P4 dihentikan

2. 2. PGFPGF22 αα tdk digunakan pd babi, oleh karena tdk digunakan pd babi, oleh karena respon CL hr ke-12 atau 13 siklus estrusrespon CL hr ke-12 atau 13 siklus estrus

33 E2 / HCG hr ke -12 siklus estru akan E2 / HCG hr ke -12 siklus estru akan memperpanjang kehidupan CLmemperpanjang kehidupan CL

44 Sinkronisasi yg paling baik pd babi adl: injek Sinkronisasi yg paling baik pd babi adl: injek 500-1000 iu HCG pd hr ke -12, kmd PG 3 500-1000 iu HCG pd hr ke -12, kmd PG 3 minggu terakhirminggu terakhir

KudaKudaUmum: P4 dan Umum: P4 dan PGFPGF22 αα 1.1. Altrenogest: pemberian mll pakan slm 15 hr.Altrenogest: pemberian mll pakan slm 15 hr.

Estrus muncul kira2 3 hr stl P4 dihentikanEstrus muncul kira2 3 hr stl P4 dihentikan

2.2. PGFPGF22 αα: Fase diestrus cl sangat respon thd : Fase diestrus cl sangat respon thd PGFPGF22 αα - Estrus: 3-5 hr.- Estrus: 3-5 hr.- Random (tampa memperhatikan siklus) pemberian - Random (tampa memperhatikan siklus) pemberian

PGFPGF22 αα dan dan HCG dilakukan 2 kaliHCG dilakukan 2 kaliI. injek PG hr ke-1 dan HCG hr ke -7 atau 8I. injek PG hr ke-1 dan HCG hr ke -7 atau 8II. Injek PG hr ke -15 dan HCG hr ke -21 atau 22II. Injek PG hr ke -15 dan HCG hr ke -21 atau 22 Estrus akan nampak: 2-4 hr Estrus akan nampak: 2-4 hr

Konsep: 1. Sumber EmbrioKonsep: 1. Sumber Embrio

• EMBRIO TRANSFER (ET)EMBRIO TRANSFER (ET)

2. Methode ET2. Methode ET

3. Sinkronisasi Resipien3. Sinkronisasi Resipien

Sumber EmbrioSumber EmbrioIn vivo : In vivo : Ovari mammaliaOvari mammalia

SuperovulasiSuperovulasi

1.1. FSH & eCG: FSH memp half life pendek dp eCGFSH & eCG: FSH memp half life pendek dp eCG

FSH diberikan setiap 12 jam slm 3 hrFSH diberikan setiap 12 jam slm 3 hr

e CG single dose o.k. half life lebih lama (4 hr)e CG single dose o.k. half life lebih lama (4 hr)

2. PGF2. PGF22 αα sangat mendukung superovulasi pd sapi sangat mendukung superovulasi pd sapi dpt menghasilkan sejml embrio yg normaldpt menghasilkan sejml embrio yg normal

- Superovulasi dpt dilakukan setiap saat antara hr ke - Superovulasi dpt dilakukan setiap saat antara hr ke -6 -6 siklus atau saat regresi Cl scr alamisiklus atau saat regresi Cl scr alami

- Donor akan estrus 2-3 hr post PG- Donor akan estrus 2-3 hr post PG

3. aGn-RH: diperlukan u/ mengontrol waktu ovulasi stl 3. aGn-RH: diperlukan u/ mengontrol waktu ovulasi stl injek FSH, kmd injel LH u/ ovulasiinjek FSH, kmd injel LH u/ ovulasi

- IB donor dilakukan bersamaan dg injek LH tampa - IB donor dilakukan bersamaan dg injek LH tampa deteksi deteksi estrusestrus

Faktor yg Mempengaruhi Hsl SuperovulasiFaktor yg Mempengaruhi Hsl Superovulasi1. Intrinsik1. Intrinsik2. Ektrinsik2. Ektrinsik

• IntrinsikIntrinsik

- Fisiologis- Fisiologis

- Keberadaan folikel fungsional yang dominant- Keberadaan folikel fungsional yang dominant

- Menurunnya jml embrio yg dikoleksi- Menurunnya jml embrio yg dikoleksi

• EktrinsikEktrinsik

- Rendahnya kualitas pakan- Rendahnya kualitas pakan

- Dalam keadaan laktasi- Dalam keadaan laktasi

Pengulangan SuperovulasiPengulangan Superovulasi

Umumnya: respon ke -1, -2 dan ke -3 hslnya sama Umumnya: respon ke -1, -2 dan ke -3 hslnya sama kemudian menurun terbentunya antibodikemudian menurun terbentunya antibodi

Collection of embryosCollection of embryos• Awalnya dikoleksi emb. dr oviduk/uterus donor Awalnya dikoleksi emb. dr oviduk/uterus donor

setelah dipotong atau diopresisetelah dipotong atau diopresi

• Th 1976 koleksi emb pd sapi, kerbau dan kuda Th 1976 koleksi emb pd sapi, kerbau dan kuda scr rutin dilakukan mll scr rutin dilakukan mll transervical (non sugical) transervical (non sugical) sedangkan pd kambing, domba dan babi dg sedangkan pd kambing, domba dan babi dg laparotomi laparotomi

• Th 1990 teknik Th 1990 teknik Transercal and laparoscopy Transercal and laparoscopy sering sering digunakandigunakan

Metode Metode SurgicalSurgical

Metode Metode non surgicalnon surgical

MetodeMetode Transcervical Transcervical

MetodeMetode Laparoscopy Laparoscopy

Seleksi embrio untuk transferSeleksi embrio untuk transfer

Surgical MethodSurgical Method

• Sering digunakan pd kb, db dan babiSering digunakan pd kb, db dan babi

• General Anasthesi u/ pengeluaran sal. rep. dg insisi General Anasthesi u/ pengeluaran sal. rep. dg insisi midventralmidventral

• Collection embrio dr kornua uteri (5 hr post estrus)Collection embrio dr kornua uteri (5 hr post estrus)

• Medium flushing: PBS yg dimasukan dr UTJMedium flushing: PBS yg dimasukan dr UTJ

• Medium hsl flush ditampung dg spuit yg ujungnya tumpul Medium hsl flush ditampung dg spuit yg ujungnya tumpul atau atau glass tubeglass tube kecil dimasukkan dlm lumen uterus kecil dimasukkan dlm lumen uterus

• Volume flush adl 2- 20 ml (oviduk) dan 10 ml pd uterus (tgt Volume flush adl 2- 20 ml (oviduk) dan 10 ml pd uterus (tgt sp)sp)

• Hsl: Embrio yg ditampung < drpd flush dr ovidukHsl: Embrio yg ditampung < drpd flush dr oviduk

• Metoda ini sering menyebebkan adesiMetoda ini sering menyebebkan adesi

Non Surgical methodNon Surgical methodMetode kurang beresiko shg paling banyak dipakaiMetode kurang beresiko shg paling banyak dipakai

Transcercal MethodTranscercal Method

• Folley catheter (3 sal) : sapi, kerbau dan kudaFolley catheter (3 sal) : sapi, kerbau dan kuda

• Pd sapi & kerbauPd sapi & kerbau folley catheter diletaknan saluran servik folley catheter diletaknan saluran servik

• Catheter diposisikan pd korpus uteri/kornua uteri (flush Catheter diposisikan pd korpus uteri/kornua uteri (flush setiap kornua) kemudian balon dipompasetiap kornua) kemudian balon dipompa

• Vol medium: 30-60 ml (PBS hangat) kmd dialirkan Vol medium: 30-60 ml (PBS hangat) kmd dialirkan ketempat penampungan dg masage mll rektum ketempat penampungan dg masage mll rektum

• Hal yg sama diulang dg memasukan catheter pd kornua yg Hal yg sama diulang dg memasukan catheter pd kornua yg lainlain

• Pada Kuda Pada Kuda adl sama, kecuali balon ditiup pd servik dan adl sama, kecuali balon ditiup pd servik dan flush dilakukan scr simultanflush dilakukan scr simultan

• Pada Kb & DbPada Kb & Db: Injek PG dan oksitosin akan : Injek PG dan oksitosin akan mempermudah memasukan cathetermempermudah memasukan catheter

Lapararoscopy MethodLapararoscopy Method

• Pertama kali diperkenalkan oleh MckelveyPertama kali diperkenalkan oleh Mckelvey

• Db, Kb dan bb; collection embrio dg generalanasthesiDb, Kb dan bb; collection embrio dg generalanasthesi

• Perbedaan dg surgical adl Perbedaan dg surgical adl instrumen u/ flushinstrumen u/ flush

• Laparoskopi: dg tusukan langs kekornua/uterusLaparoskopi: dg tusukan langs kekornua/uterus

Surgical: insisi pd midventralSurgical: insisi pd midventral

• Laparoskopi dimsk mll tusukan pd kulit, kmd uterus Laparoskopi dimsk mll tusukan pd kulit, kmd uterus dilihatdilihat

• Catheter folley (2 sal) dimasukan mll tusukan yg lain dan Catheter folley (2 sal) dimasukan mll tusukan yg lain dan diarahkan ke satu kornua sblm balom dipompadiarahkan ke satu kornua sblm balom dipompa

• Vol medium: 40-50 ml diinjek mll catheterVol medium: 40-50 ml diinjek mll catheter

• Embrio di koleksiEmbrio di koleksi

• Hal yg sama diulang pd kornua yg lainHal yg sama diulang pd kornua yg lain

Embrio SelectionEmbrio Selection

• Setelah flush pd db, kb dan babi: langs diperikas dibawah Setelah flush pd db, kb dan babi: langs diperikas dibawah stereomikroskopstereomikroskop

• Embrio hrs dijaga didlm kontainer u/ mencegah penguapanEmbrio hrs dijaga didlm kontainer u/ mencegah penguapan

• Gunakan parafin oilGunakan parafin oil

Invitro Fertilization ProductionInvitro Fertilization Production (IVF P)(IVF P)

Prosedur:Prosedur:

• Koleksi oosit dr fol ovariumKoleksi oosit dr fol ovarium

- IVM- IVM

- IVF- IVF

- IVC- IVC

SpermatozoaSpermatozoa

• KapasitasiKapasitasi

• Medium: Awalnya dipakai cairan uterus saat kawinMedium: Awalnya dipakai cairan uterus saat kawin

Ca Ca 2+ 2+ ,, ionphore, caffeine dg lama inkubasi 18-ionphore, caffeine dg lama inkubasi 18-24 jam dan 24 jam dan dicuci dg dicuci dg percoll gardient percoll gardient

Medium IVFMedium IVF

• TCM199 dgn 10% FCS dan FSH, LHTCM199 dgn 10% FCS dan FSH, LH

• Oosit dimasukan dlm vetri yg berisi maturation Oosit dimasukan dlm vetri yg berisi maturation maturationmaturation

• 4 – 5 oosit ditaruh pada mikrodroplet dg medium 4 – 5 oosit ditaruh pada mikrodroplet dg medium yg sama dan ditutup dg parafinyg sama dan ditutup dg parafin

• Inkubasi slm 24 jam pd t 39 Inkubasi slm 24 jam pd t 39 0 0 C dg tekanan COC dg tekanan CO22 5 5 % %

Kreteria FertilisasiKreteria Fertilisasi• Penetrasi spermPenetrasi sperm• Pembengkakan kepada spermPembengkakan kepada sperm• Secara morfologi cleavage normal dan pembentukan Secara morfologi cleavage normal dan pembentukan

blastosisblastosis

Medium yg umum digunakanMedium yg umum digunakanModified Krebs-Ringers bicarbonate, modified Dulbeccos, Modified Krebs-Ringers bicarbonate, modified Dulbeccos,

TCM199TCM199Modified F-10.Modified F-10.

SuplementSuplementBSA, FCS dan antibiotik streptomicyn sulfat 100.000 IU dengan BSA, FCS dan antibiotik streptomicyn sulfat 100.000 IU dengan

potassium penicilin G dalam 1 lt air.potassium penicilin G dalam 1 lt air.

EMBRIO TRANSFEREMBRIO TRANSFER

• Sinkronisasi Donor dan ResipienSinkronisasi Donor dan Resipien• Betina resipien hr kondisi baik, bebas Px genital Betina resipien hr kondisi baik, bebas Px genital

tract dan mempunyai siklus estrus yg normaltract dan mempunyai siklus estrus yg normal• Resepien hrs mempunyai estrus sama dg donorResepien hrs mempunyai estrus sama dg donor• Hasil optimum: resipien hrs dlm waktu 12 jam drpd Hasil optimum: resipien hrs dlm waktu 12 jam drpd

donor angka kebuntingan rendah > 24 jam pd donor angka kebuntingan rendah > 24 jam pd sapisapi> 48 jam pd kambing dan domba> 48 jam pd kambing dan domba

• Embrio beku: ditransfer 7 hr setelah estrus Embrio beku: ditransfer 7 hr setelah estrus keresipienkeresipien

Teknik ETTeknik ETSapi dan KerbauSapi dan Kerbau• Awal melalui laparotomiAwal melalui laparotomi

Th 1978 digunakan teknik Transcevical yaitu:Th 1978 digunakan teknik Transcevical yaitu: Palpasi rektal: ada tdknya CLPalpasi rektal: ada tdknya CL Anasthesi epidural posteriorAnasthesi epidural posterior Kondisi aseptis, embrio dimasukan ke gun transfer yg Kondisi aseptis, embrio dimasukan ke gun transfer yg

dilapisi dg sarung steril dilapisi dg sarung steril Gun dimasukan kedlm vagina dan dg rektal diarahkan Gun dimasukan kedlm vagina dan dg rektal diarahkan

ke kornua uteri ipsilateral dg CL.ke kornua uteri ipsilateral dg CL. Kemudian pd kornua uteriStraw didepositkanKemudian pd kornua uteriStraw didepositkan

Kambing dan dombaKambing dan domba• Midventral laparotomiMidventral laparotomi• General anasthetic/localGeneral anasthetic/local• Insisi midventral: dg pipet kapiler embrio ditransfer Insisi midventral: dg pipet kapiler embrio ditransfer

melalui infundibulum ke ampula.melalui infundibulum ke ampula.

Bila Ditransfer ke uterus: Bila Ditransfer ke uterus:

• Kornua uteri ditusuk dg jarum tumpul, lalu dg Kornua uteri ditusuk dg jarum tumpul, lalu dg pipet kapiler didepositkan dalamlumen yeterus.pipet kapiler didepositkan dalamlumen yeterus.

• Embrio dlm uterus dg laparoskopiEmbrio dlm uterus dg laparoskopi

Keberhasilan ETKeberhasilan ET

• Hrs mencapai 80% embrio yg hidupHrs mencapai 80% embrio yg hidup

• Angka kebuntingan tinggi pd domba, sapi dan Angka kebuntingan tinggi pd domba, sapi dan kambing dr hasil transfer 1 embrio setiap kornua kambing dr hasil transfer 1 embrio setiap kornua sering hasilnya Twinsering hasilnya Twin

• Pada Babi: 6-10 embrio harus ditransfer oleh Pada Babi: 6-10 embrio harus ditransfer oleh karena biasanya hanya setengahnya menjadi karena biasanya hanya setengahnya menjadi lahirlahir

ICSI (ICSI (Intra-Cytoplasmic Sperm Injection)Intra-Cytoplasmic Sperm Injection)

Prinsip:Prinsip:

Injeksi 1 sperm yg motil langsung kedln sitoplasma pd Injeksi 1 sperm yg motil langsung kedln sitoplasma pd oosit mature dg menggunakan glass needleoosit mature dg menggunakan glass needle

Hasil PenelitianHasil Penelitian

sperm sapi jantan (n=20) diinjeksikan kedlm oosit sperm sapi jantan (n=20) diinjeksikan kedlm oosit mature memberikan hsl yg cukup baikmature memberikan hsl yg cukup baik

KeuntunganKeuntungan

Teknik ini lebih efektif u/ treament pd pejantan yg Teknik ini lebih efektif u/ treament pd pejantan yg mengalami infertilitasmengalami infertilitas

Figure 2. A diagram showing an immobilized spermatozoon at the tip of the injection pipette, captured tail (A) or head first (B). The sperm tail before mixing with cytoplasm is straightened towards the opposite end of the tip of the injection pipette by negative pressure (A).

Figure 3. A diagram showing a spermatozoon injected into the ooplasm. Note the mechanical damage to the membrane of the sperm head equatorial region when it penetrates the zona pellucida (ZP) and ooplasm membrane. Repeatedly aspirating the head membrane-damaged sperm in and out of the injection pipette facilitates mixing