STUDI PENDAHULUAN VALIDASI UJI STERILITAS

SERUM ANTI TETANUS (TSM)DENGAN METODE MEMBRAN FILTRASI

Disusun OlehVivi Adriyani

140603110057

LATAR BELAKANG

Suatu bahan yang akan dimasukkan ke dalam tubuh manusia baik secara oral maupun diinjeksikan harus dalam keadaan steril, sehingga bahan terbebas dari kontaminasi mikroorganisme. Untuk memastikan bahwa produk terbebas dari kontaminasi mikroorganisme, maka dilakukan uji sterilitas. Metode yang digunakan pada uji sterilitas kali ini adalah membran filtrasi. Untuk memastikan keberhasilan proses uji sterilitas yang dilakukan, perlu dilakukan validasi. Dalam studi pendahuluan validasi uji sterilitas ini digunakan contoh uji serum anti tetanus (TSM).

LATAR BELAKANG

Steril

Uji Sterilitas• Metode

Filtrasi Membran

• Metode

Validasi

Untuk membuktikan bahwa uji sterilitas dengan metoda membran filtrasi mampu mendeteksi keberadaan seluruh mikroorganisme challenge: Clostridium sporogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermis (bakteri isolat lingkungan), Bacillus subtilis, Candida albicans dan Aspergillus niger.

TUJUAN

ALAT DAN BAHAN

ALAT Biosafety Cabinet Level II Inkubator : - Suhu 22,5 ± 2,5˚C - Suhu 32,5 ± 2,5˚C Pakaian ruangan

berkelas Alat pembuka wadah

contoh uji, larutan pencuci dan medium steril

Vortex mixer

Satu set alat untuk uji sterilitas metoda membran filtrasi (alat penyaring, canister steril, botol penampung steril)

Mikropipet dan tip steril Tabung reaksi steril Alat uji monitor

lingkungan (particle counter, air sampler)

BAHAN

Media 1 batch media Fluid Thioglycollate (FTM) dalam botol 100 mL 1 batch media Soybean Casein Digest (SCDM) dalam botol 100 mL

Contoh uji: 1 batch serum anti tetanus (TSM) yang sudah lulus uji sterilitas

Mikroorganisme challenge Untuk validasi ini digunakan 7 mikroorganisme yaitu:

Clostridium sporogenes ATCC 11437, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Bacillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404, Staphylococcus epidermis (isolat lingkungan)

Tryptic soy agar (TSA) dan agar darah (BPL) untuk kontrol inokulum Media untuk monitoring lingkungan: settling plate, contact agar,

finger dab Larutan pencuci (pepton 0,1%) steril Disinfektan

PROSEDUR BIOBALL

Inokulasikan 0,1 ml suspensi sel ke plat agar untuk teknik Prepored agar atau ke piring petri kosong untuk teknik spread plate

Lepaskan tutup botol, periksa permukaan dalam tutup botol dan pastikan tidak ada lagi partikel hitam yang belum larut saat ini.

Lepaskan vial dari rak busa. Ketuk tutup botol dengan lembut atau balikan vial untuk dikocok. Ketuk vial untuk memastikan bahwa semua cairan sudah keluar dari tutup botol

Balikan rak busa dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 35-37ºC

Simpan vial dalam rak busa (tutup botol berada di atas)

Pindahkan tutup botol merah ke rehydration fluid vial sebelum dihangatkan.

Copot tutup botol biru dari rehydration vial

Siapkan alat dan disinfeksi alat menggunakan disinfektan.

Disinfeksi seluruh permukaan luar wadah contoh uji, botol medium, wadah dan alat lain dengan disinfektan sebelum dimasukkan ke dalam biosafety cabinet level II.

Pasangkan selang dan canister pada alat penyaring dengan benar

Saring seluruh isi wadah contoh uji. Bilas membran sebanyak 2 kali dengan 100 mL larutan

pencuci (pepton 0,1%). Terakhir bilas membran sebanyak 1 kali dengan 100 mL

larutan pencuci yang telah diinokulasi dengan 0,1 mL suspensi yang mengandung < 1000 CFU/ mL Clostridium sporogenes

Isi masing-masing canister dengan 100 mL medium Fluid Thioglycollate (FTM).HASIL

Alat Steritest

Validasi Uji Sterilitas menggunakan Medium Fluid Thioglycollate (FTM)

KONTROL POSITIF

Siapkan canister baru.

Lakukan filtrasi sebanyak 2 kali dengan 100 mL larutan pencuci (pepton 0,1%).

Terakhir bilas membran sebanyak 1 kali dengan 100 mL larutan pencuci yang telah diinokulasi dengan 0,1 mL suspensi yang mengandung < 1000 CFU/ mL Clostridium sporogenes (kontrol positif)

Isi masing-masing canister dengan 100 mL medium Fluid Thioglycollate (FTM).

Lakukan prosedur yang sama untuk mikroorganisme challenge Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, dan isolat lingkungan.

Siapkan alat penyaring dan disinfeksi alat penyaring menggunakan disinfektan.

Disinfeksi seluruh permukaan luar wadah contoh uji, botol medium, wadah dan alat lain dengan disinfektan sebelum dimasukkan ke dalam biosafety cabinet level II.

Pasangkan selang dan canister pada alat penyaring dengan benar Saring seluruh isi wadah contoh uji. Bilas membran sebanyak 2 kali dengan 100 mL larutan pencuci

(pepton 0,1%). Terakhir bilas membran sebanyak 1 kali dengan 100 mL larutan

pencuci yang telah diinokulasikan dengan 0,1 mL suspensi yang mengandung < 1000 CFU/ mL Bacillus subtilis

Isi masing-masing canister dengan 100 mL medium Soybean casein digest (SCDM).HASIL

Alat Steritest

Validasi Uji Sterilitas menggunakan Soybean Casein Digest (SCDM)

KONTROL POSITIF

Siapkan canister baru.

Lakukan filtrasi sebanyak 2 kali dengan 100 mL larutan pencuci (pepton 0,1%).

Terakhir bilas membran sebanyak 1 kali dengan 100 mL larutan pencuci yang telah diinokulasi dengan 0,1 mL suspensi yang mengandung < 1000 CFU/ mL Bacillus subtilis (kontrol positif).

Isi masing-masing canister dengan 100 mL medium Fluid Thioglycollate (FTM).

Lakukan prosedur untuk 3 nomor bets medium untuk 3 kali pengujian dengan contoh uji yang berbeda.

Lakukan prosedur yang sama untuk mikroorganisme challenge Candida albicans, Aspergillus niger.

Kontrol Negatif

•Sebagai kontrol negatif tambahkan medium ke dalam canister tanpa perlakuan apapun.

Kontrol Inokulum

• Inokulasikan 0,1 mL Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus nigerdan isolat lingkungan pada masing-masing 2 cawan TSA;

• Inokulasikan 0,1 mL Clostridium sporogenes pada 2 cawan agar darahMonitoring Lingkungan

• Lakukan monitoring lingkungan meliputi finger dab, contact agar, settling plate, air sampler dan particel counter selama proses validasi berlangsung.

FTM

• 32,5 ± 2,5 ºC selama 5 hari

SCDM

• 22,5 ± 2,5 ºC selama 5 hari

Kontrol Inokulum

• TSA (bakteri) pada suhu 32,5 ± 2,5ºC selama 3 hari

• BPL pada suhu 32,5 ± 2,5ºC

• TSA (jamur) pada suhu 22,5 ± 2,5ºC selam 5 hari

INUKBASI

Pengamatan Lakukan pengamatan setiap hari dan amati adanya

pertumbuhan mikroorganisme pada media menggunakan lampu visual dengan latar belakang hitam putih.

Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada kontrol inokulum.

Interpretasi hasil uji Bandingkan pertumbuhan mikroorganisme antara

kelompok media yang diinokulasi contoh uji dengan media yang tidak diinokulasi contoh uji (kontrol positif).

HASIL

MediaMikroorganisme

ChallengeNo. Canister

Pengamatan hari ke-

1 2

FTM

Clostridium sporogenes

1 + +

2 + +

Staphylococcus aureus

1 - +

2 - +

Pseudomonas aeruginosa

1 - +

2 - +

Isolat Lingkungan 1 - +

Staphylococcus epidermidis

2 - +

SCDM

Bacillus subtilis1 - +

2 - +

Candida albicans1 - +

2 - +

Aspergillus niger1 - +

2 - +

Tabel I. Contoh Uji Serum Anti Tetanus (TSM)

MediaMikroorganisme

Challenge(Bio Ball)

No. Canister

Pengamatan hari ke-

1 2

FTM

Clostridium sporogenes

1 + +

2 + +

Staphylococcus aureus

1 - +

2 - +

Pseudomonas aeruginosa

1 - +

2 - +

Isolat Lingkungan 1 - +

Staphylococcus epidermidis

2 - +

SCDM

Bacillus subtilis

1 - +

2 - +

Candida albicans1 - +

2 - +

Aspergillus niger1 - +

2 - +Tabel II. Kontrol Positif (Bio Ball)

Mikroorganisme ChallengeA

MediaJumlah Koloni (CFU/cawan)

1 2

Clostridium sporogenes

BPL 48 47

Staphylococcus aureus

TSA 39 36

Pseudomonas aeruginosa

TSA 33 34

Isolat Lingkungan (Staphylococcus epidermidis)

TSA 40 41

Bacillus subtilis TSA 47 65

Candida albicans TSA 26 32

Aspergillus niger TSA 36 40

Tabel III. Kontrol Inokulum

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil studi pendahuluan bahwa uji sterilitas dengan metoda

membran filtrasi dengan bahan uji serum anti tetanus (TSM) terbukti mampu

mendeteksi keberadaan seluruh mikroorganisme challenge (Clostridium

sporogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus epidermis, Bacillus subtilis, Candida albicans dan Aspergillus

niger). Hal ini dapat dilihat pada setiap medium contoh uji maupun kontrol

positif menunjukkan hasil yang positif secara bersamaan (dalam masa

inkubasi yang sama).

TERIMAKASIH