UJI STERILITAS

Marlia Singgih WibowoSchool of Pharmacy ITB

Pembuatan produk farmasisteril >>> perlu diuji sterilitas

Tujuan uji sterilitas:

Untuk menetapkan apakah bahanfarmakope yang harus sterilmemenuhi syarat berkenaan denganuji sterilitas seperti yang tertera padamasing-masing monografi

UJI STERILITAS (FARMAKOPE INDONESIA IV/1995)

GUIDELINES FOR STERILITY TESTING OF THERAPEUTIC GOODS (THERAPEUTIC GOODS ADMINISTRATION/ TGA 2006)

PEMBANDINGAN

Suatu produk dikatakanSTERIL

Bila memenuhi persyaratan dalam ujisterilitasKemungkinan hasil positif dapat terjadikarena teknik yang salah ataukontaminasi lingkungan pada waktupengujian.

Mikroba yang Digunakan:

(1) Bacillus subtilis (ATCC No. 6633)(2) Candida albicans (ATCC No. 10321)(3) Bacteroides vulgatus (ATCC No. 8482)

PRECAUTIONS AGAINST MICROBIAL CONTAMINATION

Tests for sterility are to be carried out by trained personnelConducted in a clean-room environment the standard of clean-room

Personnel should wear sterilized over-garmentsAll equipment may come into contact in the course of the testingshould be sterilized prior to use.All substances added to the goods tested, should be sterilized prior to use by heatAll vessels, substances or outer clothing to be used should be appropriately packaged or closed,The outer surfaces of all packages of equipment which are introduced into the aseptic testing environment should be free of contamination

TEST METHODS VALIDATION (TGA 2006)

Test method validationBefore tests for sterility for any product are initially carried out, it is necessary to demonstrate the validity of the test method usedValidation should mimic the test proper in every detailValidation is to be performed when the test for sterility has to be carried out on reformulated or new productAll validation procedures should be carried out by personnel who are responsible for the routine testing of the product

Jika terdapat kontaminasi mikroba denganmenggunakan prosedur farmakope, makaditentukan bahwa bahan tersebut tidakmemenuhi syarat.Jika terdapat kegagalan menunjukkanadanya kontaminasi mikroba denganmenggunakan prosedur dalam farmakope, maka ditentukan bahwa bahan tersebutmemenuhi syarat.

Ketentuan hasil:

Media yang digunakan :

Media yang digunakan mempunyai sifatmerangsang pertumbuhan bagi mikrobayaitu:Fluid Thioglycolate Medium (FTM) dan / atauAlternative Thioglycolate Medium (ATM)Soybean-Casein Digest Medium (SCDM)

Cairan Pengencer dan pembilas :Cairan ACairan D = Cairan A + 1mL polisorbat 80/LCairan K

MEDIA (FI IV/TGA 2006)

Medium 1 (Fluid Thioglycollate Medium)

Pancreatic Digest of Casein  15.0 g

Yeast Extract (water‐soluble)  5.0 g

Glucose monohydrate/anhydrous  5.5 g/5.0 g

Sodium chloride  2.5 g

L‐Cystine 0.5 g

Sodium thioglycollate 0.5 g

0.1% Resazurin Sodium Solution (freshly prepared)  1.0 mL

Granulated Agar (moisture not more than 15%)  0.75 g

Purified Water  1000 mL

Polysorbate 80 (optional)  5.0 mL

pH after sterilisation (measured at room temperature): 7.1± 0.2

MEDIA (FI IV)Media Tioglikolat Alternatif (untuk alat yangmempunyai lumen kecil) :

Pancreatic Digest of Casein  15.0 gYeast Extract (water‐soluble)  5.0 gGlucose monohydrate/anhydrous  5.5 g/5.0 gSodium chloride  2.5 gL‐Cystine 0.5 gSodium thioglycollate 0.5 gPurified Water  1000 mLpH after sterilization (measured at room temperature): 7.1± 0.2

MEDIA (FI IV/TGA 2006)

Medium 2 (Soybean‐Casein Digest Medium)Pancreatic Digest of Casein  17.0 gPapain Digest of Soybean Meal  3.0 gGlucose monohydrate/anhydrous  2.5 g/2.3 gSodium chloride 5.0 gDipotassium hydrogen phosphate 2.5 gPurified Water  1000 mLPolysorbate 80 (optional)  5.0 mLpH after sterilisation (measured at room temperature): 7.3±0.2

Cairan A

1 gram jaringan hewan yg telah diuraikanoleh enzim pepsin, dilarutkan dlm air smp 1 liter, saring atau sentrifuga, pH diatur 7,1Jika akan digunakan untuk uji sediaan yang mengandung senyawagol.penisilin/sefalosporin (beta laktam), maka media tsb harus ditambahkan enzimpenisilinase utk proses inaktivasi

Cairan D

Adalah 1 L Cairan A + 1 mL Tween 80Digunakan bila sediaan mengandunglesitin, atau minyakAtau utk uji peralatan steril denganmenggunakan penyaring membran

Cairan K

Cairan yang mengandung Jaringanhewan yg telah diuraikan oleh enzimlambung (peptic digest), beef extract, dan Tween 80Semua cairan pembilas harusdisterilkan dengan otoklaf

Prosedur penambahanpenisilinase:

Tetapkan jumlah penisilinase yang diperlukan denganmenggunakan sediaan penisilinase yang sebelumnyatelah diuji daya penginaktif penisilin atau sefalosporinatau tetapkan jumlah penisilinase yang diperlukandengan menambahkannya ke dalam tabung FTM dansejumlah antibiotik dalam spesimen uji

1. Inokulasi media dengan 1 ml pengenceran (1 : 1000) biakan 18 jam-24 jam Staphylococcus aureus (ATCC 29737) dalam FTM.

2. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 30o – 35o

Pada saat tersebut harus teramatipertumbuhan mikroba yang spesifik. Lakukan uji konfirmasi di daerah yang benar-benar terpisah dari tempat ujisterilitas.

Uji fertilitas

Tujuan?Untuk memastikan bahwa media yang digunakan dapat menumbuhkanmikroba uji sampai waktu 7 hariDilakukan sebelum uji sterilitas thpsampel

Uji Fertilitas

Tabel 1

InkubasiMedia Mikroba Uji

Suhu (oC) Kondisi

Fluid TioglikolatMedium

(1) Bacillus subtilis (ATCC 6633)

(2) Candida albicans(ATCC10321)

(3) Bacteroides vulgatus(ATCC8482)

30 – 35

30 – 35

30 – 35

Aerobik

Tioglikolatalternative

(1) Bacteroides vulgatus(ATCC8482)

30 – 35 Anaerobik

Soybean – casein digest

(1) Bacillus subtilis (ATCC 6633)

(2) Candida albicans (ATCC No. 10321)

20 – 25

20 – 25

Aerobik

Prosedur

Inokulasi duplo wadah tiap media secaraterpisah dengan 10 hingga 100 mikrobaviabel dari tiap galur pada tabel.

Media uji memenuhi syarat jika terjadipertumbuhan yang nyata dalam semuawadah media yang diinokulasikan dalamkurun waktu 7 hari.

METODE UJI STERILITAS

INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA UJITEKNIK PENYARINGAN MEMBRAN

Prosedur Inokulasi langsung:

Uji aktivitas bakteriostatik dan Fungistatik

Prosedur:1. Encerkan biakan bakteri dan jamur tidak kurang dari galur

mikroba seperti pada uji fertilitas.2. Inokulasi media dengan uji sterilitas dengan 10 mikroba hingga

100 mikroba viabel, gunakan volume media seperti yang terteradalam Tabel Jumlah untuk bahan cair pada pemilihan spesimenuji dan masa inkubasi.

3. Tambahkan sejumlah tertentu bahan ke dalam setengah darijumlah wadah yang mengandung inokulum dan media.

4. Inkubasi wadah pada suhu dan kondisi seperti yang tertera dalamtabel selama tidak kurang dari 7 hari.

Jumlah untuk bahan cair

Volume minimum tiap media

Isi wadah (mL)Volume minimum

diambil dariwadah untuktiap media

Digunakan untukinokulasilangsung kevolume yang diambil dari tiapwadah (mL)

Digunakan untukmembrane atausetengah bagianmembrane yang mewakili volume total dari jumlahwadah yang sesuai (mL)

Kurang dari 10 1mL, atau seluruh isi jikakurang dari 1mL

15 100 20 (40 jika volume tiapwadah tidak cukupuntuk keduamedia)

10 sampai kurang dari50

5mL 40 100 20

50 sampai kurang dari100

10mL 80 100 20

50 sampai kurang dari100 dimaksudkanuntuk pemberianintravena

Seluruh isi - 100 20

100 sampai 500 Seluruh isi - 100 10

Di atas 500 500mL - 100 10

Jumlah wadah per media

Tabel 2

Jika pertumbuhan mikroba uji dalamcampuran media bahan secara visual sebanding dengan pertumbuhan dalamtabung kontrol, gunakan jumlah bahan danmedia seperti yang tertera pada Tabeljumlah untuk bahan cair dalam pemilihanspesimen uji dan masa inkubasi.

Penetapan perbandingan bahan danmedia yang tidak merugikan pertumbuhanmikroba uji.

Prosedur yang digunakan samadengan uji aktivitas bakteriostatik danfungistatik, tetapi digunakan sejumlahtertentu bahan dan volume media yang lebih besar.

Ketentuan Penambahan atau pengurangandalam menentukan perbandingan bahan danmedia

Jika sejumlah tertentu bahan dalam 250mL media masih mempunyai daya bakteriostatik ataufungistatik, kurangi jumlah bahan hingga diperolehjumlah maksimum yang tidak menghambatpertumbuhan uji dalam 250mL media.Untuk cairan dan suspensi yang jumlahnya kurangdari 1mL, perbesar jumlah media hingga cukup untukmengencerkan dan mencegah hambatanpertumbuhan.Untuk bahan padat yang tidak segera larut ataudapat terdispersi, jika jumlahnya kurang dari 50mg, perbesar jumlah media hingga cukup untukmengencerkan untuk mencegah hambatanpertumbuhan.

PROSEDUR UJI INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA UJI

Untuk:CairanSalep dan minyak yang tidak larut dalam isopropilmiristatZat padatKapas murni, perban, pembalut, benang bedahdan bahan sejenisnyaAlat kesehatan sterilAlat suntik kosong atauterisi steril

Bahan uji Bahan uji + media

Prinsip pengujian:

Inkubasi minimal 14 haridengan pengamatan padahari ke 3,4,atau 5, hari ke 7 atau 8, dan pada hari terakhirpengujian.

Catatan:Perlakuan awal berbeda untuk masing-masing produkfarmasi dan kesehatan.

Bahan uji merupakan larutan yang pada produk farmasidan kesehatan kecuali yang berbentuk cairan digunakanuntuk membilas atau mendispersi produk tersebut.

Cairan1. Pindahkan cairan dari wadah uji menggunakan pipet atau jarum suntik

steril.2. Secara aseptik inokulasikan sejumlah tertentu bahan dari tiap wadah

uji ke dalam tabung media.3. Campur cairan dengan media tanpa aerasi berlebihan.

Salep dan minyak yang tidak larut dalam isopropil miristat

Pilih 20 wadah yang mewakili, dibagi atas 2 kelompok terdiri dari 10 wadah, dan diperlakukan tiap kelompok sebagai berikut:

1. Secara aseptik pindahkan 100mg dari tiap wadah dari 10 wadah kedalam labu berisi 100mL pembawa air steril yang dapat mendispersihomogen bahan uji dalam seluruh campuran cairan.

2. Campur 10mL alikot dari campuran cairan yang diperoleh dengan80mL tiap media.

Perlakuan awal untukberbagai sediaan

Zat padatAmbil sejumlah tertentu produk dalam bentuk padat kering (atau yang sudah dibuat larutan atau suspensi dalam cairan pengencer steril) tidak kurang dari 300mg tiap wadah atau seluruh isi wadah jika tiap isikurang dari 300mg.Inokulasikan ke dalam masing-masing tidak kurang dari 40mL FTM dan SCDM.

Kapas murni, perban, pembalut, benang bedah dan bahansejenisnyaDari setiap kemasan, ambil secara aseptik 2 bagian atau lebihmasing-masing 100 sampai 500mg dari bagian paling dalam.Secara aseptik pindahkan bagian bahan uji ini ke dalam sejumlahtertentu wadah media yang sesuai dan inkubasi.

Alat kesehatan sterilUntuk alat yang bentuk dan ukurannya memungkinkan dicelupkankeseluruhan ke dalam tidak lebih dari 1000mL media, uji alat utuhmenggunakan media yang sesuai.

Untuk alat yang mempunyai pipa/saluran berlubangseperti alat transfusi atau infus atau yang ukurannyamenyebabkan pencelupan tidak dapat dilakukan danhanya saluran cairannya yang harus steril,

1. Bilas lumen masing-masing dengan sejumlah FTM danSCDM hingga diperoleh kembali tidak kurang dari15mL setiap media.

2. Inkubasi dengan tidak kurang dari 100mL masing-masing media.

Untuk alat dengan lumen yang sangat kecil sehingga FTM tidakmengalir, gunakan ATM, tetapi inkubasi dilakukan secaraanaerob.

Jika karena ukuran dan bentuk alat tidak dapat diuji dengan carapencelupan keseluruhannya ke dalam tidak lebih dari 1000mL media:

Uji bagian alat yang paling sulit disterilisasi dan jika mungkinlepaskan 2 atau lebih bagian yang paling dalam dari alat.Secara aseptik pindahkan bagian tersebut ke dalam sejumlahtertentu tabung berisi tidak kurang dari 1000mL media yang sesuai, inkubasikan.Amati pertumbuhan pada media secara visual sesering mungkinsekurangnya pada hari ke-3 atau ke-4 atau ke-5, pada hari ke-7 atau ke-8 dan pada hari terakhir dari masa uji.

Catatan: jika spesimen uji dalam media mempengaruhi uji karena kerja bakteriostatikatau fungistatik, bilas seksama alat dengancairan pembilas sesedikit mungkin sepertiyang tertera pada cairan pengencer danpembilas. Peroleh kembali cairan bilasan danuji menggunakan teknik penyaringanmembran

Prosedur untuk:Alat suntik kosong atau terisi steril

Uji dilakukan sama seperti uji untuk produk sterildalam ampul atau vial.Cara inokulasi langsung dapat dilakukan jikapenetapan bakteriostatik dan fungistatik telahmenunjukkan aktivitas yang tidak merugikandalam kondisi pengujian.

UJI STERILITAS DENGAN TEKNIK PENYARINGAN MEMBRAN

Kegunaan uji sterilitas denganteknik penyaringan membran

Berguna untuk cairan danserbuk yang dapat larutyang bersifat bakteriostatikatau fungistatik, untukmemisahkan mikrobakontaminan daripenghambat pertumbuhan.Berguna untuk bahanseperti minyak, salep ataukrem yang dapat melarut kedalam larutan pengencerbukan bakteriostatik ataubukan fungistatik.Berguna untuk uji sterilitaspermukaan atau lumen kritisalat-alat kesehatan.

Prosedur awal:

Buat perbandingan yang sama menggunakansejumlah tertentu bahan uji dan cairan pengencer danpembilas yang sesuai.Bilas membran 3 kali, tiap kali dengan 100mL cairanpengencer dan pembilas.

Pertumbuhan mikroba uji dari membran yang digunakan untuk menyaring bahan diikuti cairanpengencer dan pembilas yang telah diinokulasi secaravisual sebanding dengan pertumbuhan dari membranyang hanya digunakan untuk menyaring cairanpengencer dan pembilas yang telah diinokulasi.

Cara membuka wadah:

Bersihkan permukaan luar ampul dan tutup vial dantutup botol menggunakan bahan dekontaminasi yang sesuai dan ambil secara aseptik.Jika isi vial dikemas dalam hampa udara, masukkanudara steril dengan alat steril yang sesuai, seperti alatsuntik dengan jarum yang dilengkapi bahan penyaringuntuk sterilisasi.Untuk kapas murni, perban, pembalut, benang bedahdan bahan farmakope sejenis, buka kemasan atauwadah secara aseptik.

Pemilihan spesimen uji danmasa inkubasi

Untuk bahan cair:Gunakan volume bahan dan media untuk setiap unit danjumlah wadah per media tidak kurang dari seperti yang terterapada Tabel jumlah untuk bahan cair. Jika volume setiap wadahsejumlah tidak cukup untuk kedua media, gunakan wadahsejumlah dua kali.Untuk bahan selain cairan:Uji 20 unit bahan dengan masing-masing media. Untuk bahanyang hanya lumennya harus steril, bilas lumen dengansejumlah media yang sesuai hingga diperoleh kembali tidakkurang dari 15mL media.

Catatan:Jika tidak dinyatakan lain di dalam monografi atau bab ini, inkubasicampuran uji dengan FTM (atau ATM) selama pada suhu 20oC -25oC.

PROSEDUR UJI MENGGUNAKAN PENYARINGAN MEMBRAN

Untuk:Cairan yang dapat bercampur dengan pembawa airCairan yang tidak bercampur dengan pembawa air (kurang dari 100mL per wadah)Zat padat yang dapat disaringSalep dan minyak yang larut dalam Isopropil MiristatZat padat yang tak dapat disaringAlat kesehatan

Peralatan: porositas 0,45µm, diameter ±47mm, kecepatanpenyaringan 55mL-75mL/mnt pada tekanan 70cmHg.

Prosedur untuk:Cairan yang dapat bercampur denganpembawa air

Secara aseptik pindahkan sejumlah volume tertentu yang dibutuhkan untuk kedua media seperti yang tertera pada tabel 2, langsung kedalam satu atau dua corong penyaring membranterpisah, atau ke dalam tabung penampung sterilterpisah sebelum dipindahkan.

Jika volume cairan dalam wadah kurang dari 50mL, atau 50mL smp <100mL dan tidak dimaksudkan untukpemberian intravena, diperlukan volume tidak kurangdari 20 wadah diwakili satu membran atau setengahbagian membran yang dipindahkan ke dalam media.Jika volume cairan 50mL, 50mL smp <100mL per wadah dan dimaksudkan untuk pemberian intravena, atau 100mL – 500mL, secara aseptik tidak kurang dari10 wadah melalui tiap penyaring dari 2 rakitanpenyaring, atau tidak kurang dari 20 wadah jika hanyadigunakan satu rakitan penyaring. Lewatkan segeratiap spesimen melalui penyaring dengan bantuanpompa vakum atau tekanan.

Jika cairan sangat kental dan tidak mudah disaringmelalui 1 atau 2 membran maka diperlukan lebih dari2 rakitan penyaring. Setengah jumlah membrandiinkubasi dalam masing-masing media asalkanvolume dan jumlah wadah per media memenuhisyarat.

Jika produk bersifat bakteriostatik atau fungistatikbilas membran 3 kali , tiap kali dengan 100mL cairan A.

Secara aseptik pindahkan membran dari alatpemegang, potong membran menjadi setengahbagian (jika digunakan hanya 1), celupkan membranatau setengah bagian membran, ke dalam 100mL SCDM dan inkubasi pada suhu 20o-25o dan kedalam FTM dengan suhu inkubasi 30o-35o selamamin.7hari.

Catatan: jika contoh yang diuji bersifat bakteriostatik, gunakan cakram membran penyaring hidrofobik atausetelah spesimen disaring, potong cakram lebih kurangsetengah daerah penyaringan dari pusat membranmenggunakan alat pemotong steril, secara aseptikpindahkan potongan setengah cakram membran kedalam FTM dan sisa potongan cakram ke dalam SCDM

Prosedur untuk:Cairan yang tidak bercampur dengan pembawa air (kurang dari 100mL per wadah)

1. Pindahkan volume yang diinginkan untuk ke duamedia, seperti yang tertera pada tabel 2 langsungke dalam 1 atau 2 corong penyaring membranterpisah atau ke dalam tabung penampung sterilsebelum dipindahkan.

2. Lewatkan segera tiap spesimen melalui penyaringdengan bantuan pompa vakum atau tekanan.

Jika bahan uji berupa cairan kental atau suspensidan tidak sesuai untuk penyaringan cepat, secaraaseptik tambahkan cairan pengencer secukupnyake dalam kumpulan spesimen yang akan disaringuntuk menambahkan kecepatan aliran.Jika produk uji bersifat bakteriostatik atau fungistatikatau mengandung pengawet, bilas membran 1-3 kali dengan 100mL cairan A. Jika bahan ujimengandung lesitin atau minyak, gunakan cairan D sebagai cairan A.

Catatan :

Setelah penyaringan dan pencucian secara aseptikpindahkan membran dari alat pemegang, potongmembran menjadi setengah bagian (jika digunakanhanya 1), celupkan membran atau setengah bagianmembran, ke dalam 100mL SCDM dan inkubasipada suhu 20o-25o dan ke dalam FTM dengan suhuinkubasi 30o-35o selama min.7hari.

Prosedur untuk:Zat Padat yang tidak dapat disaring

1. Ambil ±6g produk dalam bentuk padat kering, atautidak kurang dari 300mg tiap wadah yang akan diuji, atau seluruhnya jika isi tiap wadah kurang dari300mg bahan padat.

2. Secara aseptik masukkan spesimen uji ke dalamtabung berisi 200mL cairan A, dan aduk hinggalarut. Jika spesimen tidak larut sempurna, gunakan400mL cairan A, atau secara aseptik bagi spesimenke dalam 2 bagian, dan uji tiap bagian dengan200mL cairan A.

3. Setelah penyaringan dan pembilasan secara aseptikpindahkan membran dari alat pemegang, potongmembran menjadi setengah bagian (jika digunakanhanya 1), celupkan membran atau setengah bagianmembran, ke dalam 100mL SCDM dan inkubasipada suhu 20o-25o dan ke dalam FTM dengan suhuinkubasi 30o-35o selama min.7hari.

Jika contoh uji bersifat bakteriostatik ataufungistatik , bilas membran 3 kali, tiap kali dengan 100mL cairan A.

Prosedur untuk:Salep dan minyak yang larut dalam isopropilmiristat

1. Larutkan tidak kurang dari 100mg dari tiap isi wadah, tidakkurang dari 20 wadah dalam tidak kurang dari 100mL isopropilmiristat dengan pH ekstrak air tidak kurang dari 6,5.

2. Goyang labu untuk melarutkan salep atau minyak .3. Saring segera salep yang dilarutkan.4. Secara aseptis pindahkan campuran ke dalam 1 atau 2 corong

penyaring membran dengan bantuan pompa vakum atautekanan.

5. Setelah penyaringan spesimen, bilas membran 2 kali dengan200mL cairan D, kemudian cuci dengan 100mL cairan A.

6. Secara aseptik pindahkan membran dari alat pemegang, potong membran menjadi setengah bagian (jika digunakanhanya 1), celupkan membran atau setengah bagian membran, ke dalam 100mL SCDM dan inkubasi pada suhu 20o-25o danke dalam FTM dengan suhu inkubasi 30o-35o selamamin.7hari.

Jika zat yang diuji mengandung petrolatum, gunakan cairan K. Basahi membran dengan ±200µL media pembilas sebelum penyaringan dimulai. Setelah penyaringan spesimen, bilas membran 3 kali, tiap kali dengan 100mL media pembilas.

Catatan: Untuk salep dan minyak yang tidak larut dalam isopropilmiristat lakukan penetapan seperti tertera pada salep dan minyaktidak larut dalam isopropil miristat dalam prosedur uji inokulasilangsung ke dalam media uji.

Prosedur untuk:Zat padat yang tak dapat disaring

Tidak dianjurkan dengan menggunakan teknikpenyaringan membran kecuali telah terbuktibahwa tidak terjadi penyumbatan pada filter.

Prosedur untuk:Alat Kesehatan

1. Secara aseptik alirkan volume tertentu cairan D melalui tiaplumen tidak kurang dari 20 alat hingga diperoleh 100mL dari tiapalat.

2. Kumpulkan cairan dalam wadah aseptik dan saring seluruhvolume melalui penyaring membran.

3. Secara aseptik pindahkan membran dari alat pemegang, potongmembran menjadi setengah bagian (jika digunakan hanya 1), celupkan membran atau setengah bagian membran, ke dalam100mL SCDM dan inkubasi pada suhu 20o-25o dan ke dalamFTM dengan suhu inkubasi 30o-35o selama min.7hari.

Jika ukuran alat besar, dan ukuran lot kecil, lakukan uji sejumlahunit yang sesuai seperti yang tertera pada kasus serupa dalamalat kesehatan pada prosedur uji inokulasi langsung ke dalammedia uji.

Penafsiran Hasil Uji Sterilitas

Tahap IAmati adanya pertumbuhan mikroba seperti kekeruhan dan / atau pertumbuhan pada permukaan pada isi semua wadahdalam interval waktu tertentu dan pada akhir periode inkubasi.Jika tidak terjadi pertumbuhan, maka bahan uji memenuhisyarat.

Tahap IIJumlah spesimen yang diuji minimal 2 kali jumlah tahap I.Jika tidak ditemukan pertumbuhan mikroba, bahan yang diujimemenuhi syarat.Jika ditemukan pertumbuhan mikroba, bahan yang diuji tidakmemenuhi syarat.