BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangKegiatan analisis semakin dikenal secara luas, bahkan mulai dilakukan secara rutin dengan metode sistematis. Hal ini didukung pula oleh perkembangan yang pesat dari instrument analisis.Dalam melakukan analisis di laboratorium, diperlukan suatu metode analisis yang tepat dengan tingkat selektivitas dan sensitivitas yang tinggi, gangguan yang sedikit mungkin, dan nilai akurasi serta presisi yang tinggi. Untuk memperoleh hal tersebut, maka metode analisis yang akan digunakan harus divalidasi terlebih dahulu. Metode validasi pada analisis kimia terdiri dari beberapa percobaan laboratorium yang bertujuan untuk memastikan bahwa metode analisis yang akan divalidasi, parameternya harus memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan. Seperti yang tercantum dalam ISO/IEC klausul 5.4.5.1, validasi diartikan sebagai konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus telah dipenuhi. Sedangkan validasi metode analisis merupakan suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Parameter unjuk kerja pengujian antara lain adalah presisi (keseksamaan), akurasi (kecermatan), spesifisitas, batas deteksi dan batas kuantisasi, linearitas, rentang dan ketangguhan. Pemilihan parameter yang akan diuji tergantung dari jenis dan metode pengujian yang akan divalidasi (Harmita, 2004).Suatu metode analisis baru dapat dipakai atau digunakan bila telah dilakukan validasi yang kondisinya disesuaikan dengan laboratorium dan peralatan yang tersedia, meskipun metode yang akan dipakai tersebut telah dipublikasikan pada jurnal, buku teks atau buku resmi. Hal ini dikarenakan adanya perbedaan dan keterbatasan alat, bahan kimia atau kondisi lain yang menyebabkan metode tersebut tidak dapat diterapkan secara keseluruhan. Sehingga sering dilakukan modifikasi, penyederhanaan maupun perbaikan metode, akibatnya metode tersebut harus divalidasi dengan cara yang benar. Apabila metode ini dapat dipertanggungjawabkan secara keseluruhan tidak menyimpang dan diakui oleh pihak yang berkompeten, maka metode yang dimodifikasi ini dianggap valid dan dapat digunakan untuk analisis rutin.Dalam makalah ini, akan dibahas mengenai pengertian validasi metode serta parameter-parameter pengujiannya. Validasi metode sangat penting dilakukan karena dengan melakukan validasi dapat diketahui tingkat kepercayaan yang dihasilkan dari suatu metode pengujian. Selain itu, validasi metode merupakan salah satu bentuk jaminan mutu hasil kepada pelanggan, dimana metode yang digunakan telah terbukti baik sehingga hasil yang dikeluarkan adalah valid, sehingga dapat diketahui metode analisis dengan tingkat selektivitas dan sensitivitas yang tinggi, serta dengan sedikit mungkin gangguan, sehingga dapat diterapkan untuk pengujian sampel pada masa yang akan datang.

1.2 Rumusan Masalah1. Apakah yang dimaksud dengan validasi metode?2. Apasajakah parameter-parameter pengujian validasi metode?3. Bagaimana analisis asosiasi dalam validasi metode?

1.3 Tujuan1. Mengerti dan memahami deskripsi validasi metode.2. Mengerti dan memahami parameter-parameter pengujian validasi metode.3. Mengerti dan mengetahui cara analisis asosiasi dalam validasi metode.

1.4 Manfaat1. Dapat mengerti dan memahami deskripsi validasi metode.2. Dapat mengerti dan memahami parameter-parameter pengujian validasi metode.3. Dapat mengerti dan mengetahui cara analisis asosiasi dalam validasi metode.

BAB IIISI

2.1 Validasi MetodeValidasi metode analisis adalah suatu proses penilaian terhadap metode analisis tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa metode tersebut memenuhi persyaratan untuk digunakan (Harmita, 2004). Selain itu, validasi metode dilakukan jika terjadi perubahan kondisi antara kondisi analisis dan kondisi pada saat validasi metode, atau terjadi perubahan metode dari metode standar. Beberapa manfaat validasi metode analisis adalah untuk mengevaluasi unjuk kerja suatu metode analisis, menjamin prosedur analisis, menjamin keakuratan dan kedapat ulangan hasil prosedur analisis, dan mengurangi resiko penyimpangan yang mungkin timbul (Wulandari, 2007).Menurut Wea (2010), tujuan dari validasi metode adalah untuk mengetahui sejumlah mana penyimpangan yang tidak dapat dihindari suatu metode kondisi normal dimana seluruh elemen terkait telah dilaksanakan dengan baik. Disamping itu dengan memvalidasi metode dapat diperkirakan dengan pasti tingkat kepercayaan yang dihasilkan oleh suatu metode pengujian maupun dari metode instrument yang digunakan. Untuk mendapatkan hasil yang paling akurat dari suatu validasi, maka semua variabel dari metode harus diperhitungkan, seperti jenis atau matriks contoh, cara penyiapan contoh dan cara evaluasi data.

2.2 Parameter Uji Validasi MetodeDalam proses validasi metode, parameter-parameter unjuk kerja metode ditentukan dengan menggunakan peralatan yang memenuhi spesifikasi, bekerja dengan baik dan terkalibrasi secara memadai. Secara umum, validasi metode mencakup penentuan yang berkaitan dengan alat dan metode (Nugroho, 2006). Prosedur analisis yang harus divalidasi meliputi beberapa jenis pengujian, yaitu adanya pengotor, uji limit untuk mengendalikan keberadaan pengotor, serta uji kuantitatif komponen aktif atau komponen lain dalam produk obat-obatan. Selain itu, terdapat 8 parameter validasi metode analisis, yaitu spesifisitas, ketelitian, ketepatan, linearitas, kisaran, limit deteksi, limit kuantitasi, dan ketangguhan. A. Ketepatan (Accuracy)Accuracyadalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya.Accuracydinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan.Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur (Gandjar, 2007).Ketepatan suatu metode analisis didefinisikan sebagai kedekatan hasil yang diterima (baik sebagai nilai teoretis maupun sebagai nilai rujukan yang diterima) dengan nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran (ICH 1995 diacu dalam Chan 2004). Ketepatan dinyatakan sebagai perolehan kembali yang ditentukan dengan cara menambahkan sejumlah tertentu standar dari analit yang akan diukur ke dalam contoh. Perolehan kembali (%) yang dapat diterima menurut ICH adalah 98102%. ICH juga mensyaratkan minimum 9 kali pengukuran pada 3 tingkat konsentrasi yang berbeda.Accuracydapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method) (Riyadi, 2009).Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke dalam plasebo, lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Recovery dapat ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang akan divalidasi(Riyadi, 2009). Perhitungan perolehan kembali ditetapkan dengan rumus sebagai berikut:% Perolehan Kembali = CF = konsentrasi total sampel yangdiperoleh dari pengukuranCA = konsentrasi sampel sebenarnyaC*A = konsentrasi analit yang ditambahkanB. Keseksamaan (Precision)Precisionadalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen.Presiciondiukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). Ketelitian prosedur analisis menyatakan kedekatan hasil dari sederet pengukuran yang diperoleh dari contoh yang homogen pada kondisi tertentu (ICH, 1995). Ketelitian dinyatakan dengan 3 cara, yaitu keterulangan (repeatability), ketelitian intermediet (intermediet precision), dan ketertiruan (reproducibility). Repeatabilityadalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Keterulangan merupakan pengukuran ketelitian dengan metode, peralatan, dan laboratorium yang sama pada selang waktu tertentu. Ketelitian intermediet dilakukan dalam laboratorium yang sama, namun dengan operator dan peralatan yang berbeda serta pada hari yang berlainan. Ketertiruan merupakan pengukuran ketelitian yang dilakukan dengan peralatan, operator, dan laboratorium yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV) 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium(Riyadi, 2009).Keseksamaan dapat dihitung dengan cara sebagai berikut:Hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,.....................xn, maka simpangan bakunya adalahSD =Simpangan baku relatif atau koefisien variasi (KV) adalah:KV = SD x 100%Percobaan keseksamaan dilakukan terhadap paling sedikit enam replika sampel yangdiambil dari campuran sampel dengan matriks yang homogen.C. Linearitas dan rentangLinearitas menunjukkan kemampuan suatu metode analisis untuk memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam sampel pada kisaran konsentrasi tertentu.Sedangkan rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima.Rentangdapat dilakukan dengan cara membuat kurva kalibrasi dari beberapa sel larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya(Ermer & Miller, 2005).Linearitas menunjukkan kemampuan suatu metode analisis untuk memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam contoh pada kisaran konsentrasi tertentu. Hal ini dapat dilakukan dengan cara membuat kurva kalibrasi dari beberapa set larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya. Linearitas juga dapat diketahui dari kemiringan garis, intersep, dan residual (Ermer & Miller, 2005). Residual menyatakan besarnya penyimpangan yang terjadi antara nilai yang terukur (y) dan nilai teoretis yang dihitung dari persamaan regresi (). Plot antara residual dan konsentrasi dibuat untuk mengetahui distribusi residual secara statistik. Jika residual terdistribusi secara normal (rerata mendekati nol dan berbentuk linear), maka persamaan regresi dapat dikatakan mempunyai bentuk yang benar.Persamaan garis yang digunakan pada kurva kalibrasi diperoleh dari metode kuadrat terkecil, yaitu y = a + bx. Persamaan ini akan menghasilkan koefisien korelasi (r). Koefisien korelasi inilah yang digunakan untuk mengetahui linearitas suatu metode analisis.Penetapan linearitas minimum menggunakan lima konsentrasi yang berbeda. Nilai koefisien korelasi yang memenuhi persyaratan adalah lebih besar dari 0.9970 (ICH, 1995).Linearitas juga dapat diketahui dari kemiringan garis, intersep, dan residual(Ermer & Miller, 2005).D. Selektivitas (Spesifisitas)Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya. Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat diperoleh, maka selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji lalu dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti kromatografi, analisis kelarutan fase, danDifferential Scanning Calorimetry. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektivitas(Riyadi, 2009)E. Batas Deteksi dan Batas KuantisasiLimit deteksi (LD) merupakan jumlah atau konsentrasi terkecil analit dalam contoh yang dapat dideteksi, namun tidak perlu diukur sesuai dengan nilai sebenarnya. Limit kuantitasi (LK) adalah jumlah analit terkecil dalam contoh yang dapat ditentukan secara kuantitatif pada tingkat ketelitian dan ketepatan yang baik. Limit kuantitasi merupakan parameter pengujian kuantitatif untuk konsentrasi analit yang rendah dalam matriks yang kompleks dan digunakan untuk menentukan adanya pengotor atau degradasi produk (ICH 1995). Limit deteksi dan limit kuantitasi dihitung dari rerata kemiringan garis dan simpangan baku intersep kurva standar yang diperoleh.Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blangko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blangko dan formula di bawah ini dapat digunakan untuk perhitungan:

Q= batas deteksi atau batas kuantisasik= 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantisasiSb= simpangan baku respon analitik dari blangkoSl= arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap konsentrasiBatas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis linier y = a + bx, sedangkan simpangan baku blanko sama dengan simpangan baku residual (Sy/x.)1) Batas deteksi (Q). Karena k=3 atau 10Simpangan baku (Sb) = Sy/x, maka

2) Batas Kuantitasi (Q)

F. Ketangguhan metode (rugged-ness)Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dll. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara lab dan antar analis.Ketangguhan metode ditentukan dengan menganalisis beningan suatu sampel yang homogen dalam lab yang berbeda oleh analis yang berbeda menggunakan kondisi operasi yang berbeda, dan lingkungan yang berbeda tetapi menggunakan prosedur dan parameter uji yang sama. Derajat ketertiruan hasil uji kemudian ditentukan sebagai fungsi dari variabel penentuan (Harmita, 2004).G. Kekuatan (Robustness)Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi. Sebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan kekuatan prosedur HPLC dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organik fase gerak (1%), pH fase gerak ( 0,2 unit), dan perubahan temperatur kolom ( 2 - 3 C). Perubahan lainnya dapat dilakukan bila sesuai dengan laboratorium. Identifikasi sekurang-kurangnya 3 faktor analisis yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau diubah. Faktor orisinal ini dapat diidentifikasi sebagai A, B, dan C. Perubahan nilai faktor-faktor ini dapat diidentifikasi dengan a, b, dan c. Lakukan analisis pada kondisi yang telah disebutkan pada pemeriksaan ketangguhan (Harmita, 2004).

2.3 Analisis Asosiasi dalam Validasi MetodeAnalisis asosiasi merupakan sebuah cara dalam pengolahan data statistik yang digunakan apakah sebuah variabel mempunyai hubungan yang signifikan dengan variabel lainnya. Korelasi disebut juga koefisien korelasi, merupakan nilai yang menunjukkan kekuatan dan arah hubungan linier antara dua variabel. Analisis korelasi dan regresi sering digunakan sebagai alat analisis dalam uji asosiasi.Berikut contoh analisis asosiasi dalam validasi metode uji kadar hydrazin dalam air menggunakan spektrofotometer uv-visNo.Konsentrasi (ppm)Absorbansi

100

20.10.0752

30.20.1502

40.30.2286

50.40.3064

60.50.3886

710.771

PERHITUNGAN EXCELSUMMARY OUTPUT

Regression Statistics

Multiple R0.999963835

R Square0.99992767

Adjusted R Square0.999913205

Standard Error0.00238488

Observations7

r tabel : ( , n-2 ) = (0.05,5)r tabel = 0.669ANOVA

dfSSMSFSignificance F

Regression10.393147950.3931479569123.061.5107E-11

Residual52.84383E-055.68765E-06

Total60.393176389

F tabel:6.607890969

CoefficientsStandard Errort StatP-value

Intercept-0.0019565220.001384374-1.4132898170.216693

X Variable 10.7734782610.002941959262.91265641.51E-11

Lower 95%Upper 95%Lower 95.0%Upper 95.0%

Intercept-0.005515170.001602-0.005520.001602

X Variable 10.7659157140.7810410.7659160.781041

RESIDUAL OUTPUTObservationPredicted YResidualsStandard Residuals

1-0.0019565220.0019565220.898687676

20.075391304-0.000191304-0.087871684

30.15273913-0.00253913-1.166296895

40.230086957-0.001486957-0.683002634

50.307434783-0.001034783-0.475305926

60.3847826090.0038173911.75343951

70.771521739-0.000521739-0.239650047

PERHITUNGAN MANUALNo.Konsentrasi (X)Absorbansi (Y)Xi-X (a)Yi-Y (b)(xi-x)^2(yi-y)^2a.b

100-0.357142-0.274290.1275510.0752330.097959

20.10.0752-0.257142-0.199090.0661220.0396350.051193

30.20.1502-0.157142-0.124090.0246940.0153970.019499

40.30.2286-0.057142-0.045690.0032650.0020870.002611

50.40.30640.0428570.0321140.0018370.0010310.001376

60.50.38860.1428570.1143140.0204080.0130680.016331

710.7710.6428570.4967140.4132650.2467250.319316

jumlah2.51.92000.6571430.3931760.508286

rata-rata0.3571428570.274285714SSxxSSyySsxy

Slope = = = 0.773478261Intercept = Yrata-rata (slope x Xrata-rata)= 0.274285714 (0.773478261 x 0.357142857)= -0.001956522R = = = 0.9999647821

SSE residu = = 0.508286 (0.773478261 x 0.508286) = 2.84383x10-5

SSE regresi = = 0.508286 2.84383x10-5= 0.39314795MSE residu = = = 5.6876510-6MSE regresi = = = 0.39314795F hitung = = = 69123.06489

Berdasarkan hasil perhitungan diatas, maka dapat dianalisis asosiasi sebagai berikuta) Persamaan garis linear : y = 0.773x - 0.002b) Uji regresiHipotesa:Ho = tidak ada hubungan antara konsentrasi hydrazine dan AbsorbansiHipotesa:Ha = ada hubungan antara konsentrasi hydrazine dan absorbansiKarena F hitung (69123.06) > F tabel (6.607890969), maka Ho ditolak. Hal ini berarti ada hubungan antara konsentrasi hydrazine dan absorbansi dimana konsentrasi hydrazine mempengaruhi absorbansi.c) Uji KorelasiHipotesa: Ho = tidak ada korelasi signifikan antara variabel X (konsentrasi hydrazine) dan variabel Y (absorbansi)Hipotesa: Ha = ada korelasi signifikan antara variabel X (konsentrasi hydrazine) dan variabel Y (absorbansi)Karena r hitung (0.999) > r tabel (0.669), maka Ho ditolak. Dapat disimpulkan bahwa terdapat hubungan signifikan antara konsentrasi hydrazine dan absorbansi dimana absorbansi sangat dipengaruhi oleh konsentrasi.

BAB IIIPENUTUP

3.1 Kesimpulan1. Validasi metode analisis adalah suatu proses penilaian terhadap metode analisis tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa metode tersebut memenuhi persyaratan untuk digunakan. 2. Parameter unjuk kerja pengujian antara lain adalah presisi (keseksamaan), akurasi (kecermatan), spesifisitas, batas deteksi dan batas kuantisasi, linearitas dan rentang, kekuatan dan ketangguhan.3. Analisis asosiasi dapat dilakukan dengan menggunakan uji korelasi dan uji regresi. Berdasarkan contoh dalam validasi metode uji kadar hydrazin dalam air menggunakan spektrofotometer uv-vis, dapat disimpulkan bahwa:a. Uji regresi : terdapat hubungan antara konsentrasi hydrazine dan absorbansi dimana konsentrasi hydrazine mempengaruhi absorbansi.b. Uji korelasi : terdapat hubungan signifikan antara konsentrasi hydrazine dan absorbansi dimana absorbansi sangat dipengaruhi oleh konsentrasi.

DAFTAR PUSTAKA

Chan, C.C. Lam, Herman. Lee, Y.C. and Zhang, Xue-Ming. 2004. Analytical Method Validation and InstrumentPPerformance Verification. Canada: John Wiley & Sons..Ermer, J. H. and Miller, McB. 2005. Method Validationiin Pharmaceutical Analysis. A Guide to Best Practice. Weinheim: Wiley-Vch. Verlag Gmb H&Co.Gandjar, G. I & Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Belajar.Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian Vol. 1, No. 3.International Conference on Harmonization. 2005. Validation of Analytical Procedures: Text andMethodology Q2((R1). Tersedia di http://www.ich.org.[diakses tanggal 06 Mei 2014].Riyadi, Wahyu. 2009. Validasi Metode Analisis. Tersedia dihhttp://www.chem-is-try.org/artikel_kimia/kimia_analisis/validasi-metode-analisis/[diakses tanggal 06 Mei 2014].

14